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编号:10275693
双嘧达莫抗单纯疱疹病毒的体外实验研究
http://www.100md.com 《中华皮肤科杂志》 1998年第4期
     作者:郑家润 唐美育 余艳华 徐兰芳

    单位:210042 南京,中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所

    关键词:双嘧达莫;疱疹病毒1型,人;疱疹病毒2型,人;抗病毒药

    中华皮肤科杂志/980408 【摘要】 目的和方法 用Vero细胞及HEK-293细胞体外培养法检测双嘧达莫对单纯疱疹病毒(HSV)的抑制活性,并以直线回归方程计算IC50值。结果 双嘧达莫对HSV-1及2型质控株及临床分离株的IC50值范围在6.9~16.1μg/ml之间,而对照药阿昔洛韦为1.9~21.3μg/ml。结论 从双嘧达莫广谱的抗病毒作用及其特有的作用机制以及药代动力学资料分析,口服给药对HSV感染的疗效尚待临床药理研究进一步证实,而局部给药则可能是抗HSV皮肤粘膜感染可供选择的治疗药物之一。

, http://www.100md.com     Study on Anti-Herpes Simplex Virus Activity of Dipyridamole in Vitro Zheng Jiarun, Tang Meiyu, Yu Yanhua, et al. Department of Pharmacology. Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Nanjing 210042

    【Abstract】 Objective and Methods To determine the inhibitoryactivity of dipyridamole (DPM) onreplication of herpes simplex virus (HSV)-Ⅰ、Ⅱ in Vero cells and HEK-293cells in vitro. Results The results showed that the range of 50% inhibition concentrations (IC50) of DPM and control-drug acyclovir on different types of HSV in 2 cell lines ranged 6.9~16.1μg/ml and 1.9~21.3μg/ml respectively. Conclusion It is known that DPM possessed a definite antiviral activity with a broad spectrum, the therapeutic effect of DPM taken orally for the treatment of viral diseases should be further studied. It is possible that topical preparations of DPM can be used for the treatment of mucocutaneous infection of HSV.
, 百拇医药
    【Key Words】 Dipyridamole Herpesvirus 1, human Herpesvirus 2, human Antiviral agents

    双嘧达莫(dipyridamole,潘生丁,简称DPM)原为冠状动脉扩张药,并能抑制血小板聚集,但临床疗效评价不一。Toner等[1]首先报道其有广谱抗病毒活性。近年来国内有不少报道口服DPM治疗呼吸道、胃肠道、皮肤、粘膜等部位的病毒性感染有效,但所有报道均非临床药理报道,对疱疹病毒的疗效尚缺乏药效学依据。我们报道DPM对1、2型单纯疱疹病毒(HSV-1,2)在不同细胞株中繁殖的抑制作用,并结合文献资料对DPM抗病毒尤其是抗HSV的应用价值作进一步评价。

    材料和方法

    一、材料

    1.药物:双嘧达莫(上海第六制药厂,批号951001,含量99.19%)、对照药阿昔洛韦(ACV,潜江制药厂,批号9508044,甘泰注射液干粉)。
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    2.细胞:Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)及HEK-293细胞(人胚肾细胞,中国科学院细胞生物研究所)。

    3.病毒:质控株HSV-1(Sm44)及HSV-2(333)(卫生部生物制品药品检验所)。临床分离株HSV-1(C)及HSV-2(C)(本所及南京医科大学)。

    4.培养基:RPMI 1640(Dibco BRL)加10%小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)。

    二、方法

    1.病毒毒力测定:按Reed和Muench法常规,以确定致≥98%细胞病变的病毒浓度作为药物的抗病毒实验。

    2.药物对细胞毒性测定:确定本实验所用DPM和ACV的最高终浓度均为充分溶解及细胞毒性为0%的浓度。

, 百拇医药     3.抗病毒实验:将定量病毒悬液接种于含细胞的培养瓶内,平行4瓶,吸附45分钟后,换入含系列浓度的药液或无药的培养液,培养20小时(Vero细胞)或48小时(HEK-293细胞),以无药对照瓶细胞病变达≥98%后中止培养。在测微计下选2个网格,共200个小方格,计算出病变细胞(正常细胞+病变细胞)的比率,以4瓶8个网格之和求正常细胞和病变细胞的百分率。每次实验重复3次,求平均值。以对数剂量(D)作横座标,以抑制百分率(IR)作纵座标作图,并计算直线回归方程,求半数抑制浓度(IC50),对相关系数(r)作显著性检验。

    结 果

    1.病毒毒力测定:见表1。

    2.药物细胞毒性测定:DPM在最大溶解度100μg/ml浓度下未见细胞毒性病变;ACV 80μg/ml细胞病变为0,160μg/ml病变率为10%。

    3.在2种体外培养细胞中药物抑制HSV繁殖的量-效关系、直线回归方程和IC50值:从图1及表2可见,DPM和ACV两药抑制HSV各株繁殖有明确的剂量依赖关系,对数剂量-抑制百分率的直线回归方程相关系数均有显著统计学意义。在Vero细胞培养中,ACV直线略偏左,效价较DMP略高,在HEK-293细胞培养中,两药量-效直线基本重叠,表明效价接近。
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    表1 引起≥98%细胞病变的病毒接种液稀释度 病毒株

    病毒悬液稀释度

    Vero细胞

    HEK-293细胞

    HSV-1(Sm44)

    10-3

    5×10-1

    HSV-2(333)

    10-2

    5×10-1

    HSV-1(C)
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    10-3

    5×10-1

    HSV-2(C)

    5×10-3

    5×10-3

    讨 论

    Tonew等[1]报道DPM的体外抗病毒活性包括抑制微小RNA病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、披膜病毒科和痘病毒科等代表性病毒株的生长,但尚未见抗疱疹病毒科病毒实验报道。该报道证明25μg/ml(50μmol/L)DPM对上述病毒的抑制率均可达99%。此后有不少报道证实此实验结果,并报道对A型流感病毒亦有抑制作用。Szebeni等[2~4]证明DPM在体外能显著增强叠氮胸苷(AZT)在单核-巨噬细胞和CD4+T细胞内的抗HIV-1病毒活性,同样浓度不引起这些细胞和人骨髓颗粒-单核干细胞的毒性作用,亦不增强AZT的骨髓毒性,在CEM-SS淋巴样细胞内尚可显著抑制AZT的细胞毒性,从而认为DPM及其衍生物可能用于联合治疗HIV感染。上述抗病毒实验结果按不同病毒、不同细胞、不同实验方法和判断标准(完全或半数有效)其有效浓度在1.25~25μg/ml范围内。以后Galabove[5]等发现DPM在小鼠及人中能诱生α和β型干扰素,Suzuki[6]进一步报道DPM在体外浓度低至0.005μg/ml时即可增强人干扰素抗各种癌细胞的活性,裸鼠体内实验亦证实DPM与干扰素的这种协同结果。Hay[7]报道DPM在体外神经组织培养时能阻断潜伏状态的HSV再活化。
, 百拇医药
    表2 双嘧达莫和阿昔洛韦在Vero细胞和HEK-293细胞体外培养中对HSV-1、2质控株和临床株抑制作用的直线回归方程和IC50值 病毒株

    双 嘧 达 莫

    阿 昔 洛 韦

    方 程

    r

    P

    IC50

    方 程

    r

    P

    IC50
, 百拇医药
    Vero细胞

    HSV-1(Sm44)

    Y=-19.5784+74.3689X

    0.9675

    <0.01

    8.62

    Y=14.4475+61.5673X

    0.9934

    <0.01

    3.78

    HSV-2(333)

    Y=-32.5581+98.3291X
, 百拇医药
    0.9766

    <0.01

    6.91

    Y=-16.6104+100.9164X

    0.9999

    <0.01

    4.57

    HSV-1(C)

    Y=-19.9851+67.2645X

    0.9730

    <0.05

    10.97
, 百拇医药
    Y=35.0952+52.7826X

    0.9901

    <0.01

    1.92

    HSV-2(C)

    Y=-24.6782+69.7189X

    0.9421

    <0.01

    11.78

    Y=3.7735+49.7934X

    0.9948

    <0.01
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    8.47

    HEK-293细胞

    HSV-1(Sm44)

    Y=-38.8079+73.6139X

    0.9791

    <0.05

    16.08

    Y=-14.3899+59.5293X

    0.9748

    <0.05

    12.07

    HSV-2(333)
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    Y=-13.7599+68.0622X

    0.9781

    <0.05

    8.65

    Y=-7.8098+43.4937X

    0.9788

    <0.05

    21.34

    HSV-1(C)

    Y=-17.4894+63.0474X

    0.9636

    <0.05
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    11.76

    Y=-3.8324+53.4249X

    0.9998

    <0.01

    10.18

    HSV-2(C)

    Y=-54.9102+105.3051X

    0.9905

    <0.001

    9.91

    Y=-3.6021+54.7889X

    0.9948
, 百拇医药
    <0.01

    9.51

    图1 双嘧达莫和阿昔洛韦在Vero细胞(左)和HEK-293细胞(右)中对HSV-1、2型质控株和临床株抑制作用的量-效关系

    我们的实验证实DPM有明确的体外抗疱疹病毒科HSV的活性。以2株细胞分别检测DPM对HSV-1,2型质控株和临床株的抑制活性,其IC50值在Vero细胞和HEK-293细胞分别为6.9~11.8和8.7~16.1μg/ml,而标准抗HSV药物ACV分别为1.9~8.5μg/ml和9.5~21.3μg/ml,总的抗病毒效价DPM略低于ACV。DPM的抗病毒机制是多环节的,它是一种尿苷、腺苷、脱氧胞苷抑制剂,能抑制二氧嘧啶核苷、腺苷及脱氧嘧啶胞苷等通过细胞膜进入细胞内,并能选择性抑制病毒RNA合成,部分地抑制RNA依赖的RNA聚合酶的合成,而对宿主RNA的合成无明显影响[1]。这是DPM广谱抗病毒活性及选择性作用的基础。此外,实验已证明,DPM在未感染的单核-巨噬细胞内能显著抑制3H-脱氧胞苷对细胞的作用,但不抑制3H-双脱氧胞苷的作用,这种竞争性抑制生理核苷的作用可能解释DPM对AZT抗HIV的增强作用,其增强AZT和双脱氧胞苷的磷酸化,可导致后二者代谢活性及抑制HIV逆转录酶活性的增强[2,3]。上述实验及文献资料表明,DPM具有明确、广谱的抗RNA及DNA病毒活性,这是临床抗病毒新用途的药效学依据。然而DPM的药代动力学研究表明[7],服药者每日分2次或3次口服DPM 150mg,其平均血药稳态浓度分别为1.71±0.98μg/ml和1.40±0.72μg/ml,此水平在体外为抗病毒浓度的低限,其中个体差异又可达6.6~7.2倍。因此,口服DPM治疗病毒性疾病的药代动力学依据并不充分,至少需结合药物的血浆和(或)组织浓度与体外各病毒株的抑制效价才能判断。DPM有诱生和增强IFN作用[5,6],这或许是产生临床疗效的另一个可能解释。无论如何,DPM的口服抗病毒的临床疗效只有通过临床药理评价才能确定。而DPM外用治疗,在皮肤、粘膜皮损局部则完全可以达到所需的抗病毒浓度,药效学依据比较充分。由于DPM抗病毒谱广、安全、价廉、有诱生干扰素活性及其作用机制不同于其它抗病毒药,以及有证据可能与其它抗病毒药物有协同作用,因而具有临床抗病毒的潜在价值。以适宜的制剂局部外用,是皮肤粘膜各种病毒感染可供选择的治疗药物之一。通过药代动力学及临床药理学评价,对某些敏感的病毒株口服DPM作为联合或辅助抗病毒治疗也是可能的。
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    参 考 文 献

    1 Tonew M, Tonew E, Mentel R. The antiviral activity of dipyridamole. Acta Virol, 1977,21∶146-150.

    2 Szebeni J, Wahl SM, Popovic M, et al. Dipyridamole potentiates the inhibition by 3′-azido-3′-deoxythymidine and other dideoxynucleosides of human immunodeficiency virus replication in monocyte-macrophages. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86∶3842-3846.

    3 Palel SS, Szebeni J, Wahl LM, et al. Differential inhibition of 2′-deoxycytidine salvage as a possible mechanism for potentiation of the anti-human immunodeficiency virus activity of 2′,3′-dideoxycytidine by dipyridamole. AntimicrobAgents Chemother, 1991,35∶1250-1253.
, http://www.100md.com
    4 Szebeni J. A new drug in a new role: dipyridamole in the treatment of HIV-1 infections? Orv Hetil, 1991,132∶1907.

    5 Galabove AS, Mastikova M. Interferon-inducing activity of dipyridamolein mice. Acta Virol, 1982,27∶356-358.

    6 Suzuki N, Oiwa Y, Sugano I, et al. Dipyridamole enhances an anti-proliferativeeffect of interferon in various types of human tumor cells. Int J Cancer, 1992,51∶627-633.

    7 Mahony C, Cox JL, Bjornsson TD. Plasma dipyridamole concentrations after two different dosage regimens in patients. J Clin Pharmacol, 1983, 23∶123-126.

    (收稿:1997-08-19 修回:1997-12-31), 百拇医药