红斑狼疮患者皮损中角朊细胞凋亡的初步研究
作者：王秀丽 徐世正 熊腊元
单位：430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院皮肤科
关键词：
中华皮肤科杂志980525 近年来对细胞凋亡与自身免疫疾病关系的研究已成为热点[1 ]。红斑狼疮是自身免疫病的一个原型，而皮肤损害是红斑狼疮的一个突出表 现。为研究细胞凋亡与红斑狼疮皮损发生、发展的关系，我们采取原位DNA断裂位点末端标 记技术(TUNEL)，对13例系统性红斑狼疮(SLE)和9例盘状红斑狼疮(DLE)患者不同病程的皮损 进行了表皮角朊细胞凋亡的研究。
一、材料与方法
(一)标本来源：13例SLE和9例DLE皮损标本均来自我科1995年1月至1997年4月临床资料保存 完整的石蜡包埋组织。SLE符合美国风湿病协会1982年修订的分类标准。DLE根据皮疹、皮肤病理及免疫荧光带试验而确诊。13例SLE中男4例，女9例；平均年龄29.9岁；病程在6个月以内且未经皮质类固醇激素治疗者7例，6个月以上且经全身皮质类固醇激素治疗者6例。9例 DLE中男3例 ，女6例；平均年龄37.8岁；病程在1至6个月(早期)且未经皮质类固醇激素治疗者3例，表 现为浸润性红斑；病程在6个月以上(晚期)且局部用过皮质类固醇激素治疗者6例，为典型的 盘状红斑。7例正常对照来源于皮肤外科手术的正常皮肤。
, 百拇医药
(二)试剂：蛋白酶K为Merck公司产品，TdT酶购于Promega公司，DIG-dUTP及碱性磷酸酶(AP )偶联的抗DIG抗体为Boehringer公司产品，防脱片剂APES为Sigma公司产品。
(三)原位DNA断裂位点的3-羟基末端标记(TUNEL)方法：切取5μm厚的石蜡切片贴附于APES 处理过的载玻片上，常规脱蜡水化，20μg/ml蛋白酶K室温孵育15分钟，双蒸水冲洗，TdT反 应液37℃孵育60分钟，2×SSC洗涤后，滴加1∶1500抗DIG-AP偶联抗体，37℃孵育30分钟， 最后NBT/BCIP室温暗处显色。
(四)细胞凋亡指数(apoptotic index, AI)测定：沿核膜见到环形、半月形或细胞核中央呈 团块状的紫蓝色颗粒沉着为凋亡阳性细胞。每张切片连续选择5个阳性染色最明显的高倍视 野(×400)，计算每平方毫米表皮细胞中凋亡阳性细胞所占的百分比即为该切片的凋亡指数 [2]。根据凋亡指数大小将其分为0～0.1、0.11～0.3和>0. 3三组。所得结果采用Wilcoxon秩和检验进行统计分析。
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二、结果
不同病程SLE和DLE细胞凋亡指数分布情况见附表。正常皮肤仅在颗粒层见到程序性细胞死亡 (PCD)阳性细胞(图1)。SLE及DLE皮损表皮内PCD细胞除分布于颗粒层外，尚可见于棘细胞层，两者的细胞凋亡指数均明显高于对照组(P<0.05)，但DLE与SLE之间无显著性差异(P>0.05)。另外，SLE和DLE皮损表皮细胞AI与病程密切相关( P<0.05)，病程越短，AI值越高；反之亦然，详见附表。
附表 SLE和DLE皮损表皮细胞凋亡指数分布情况 病种与病程
例数
细胞凋亡指数(AI)
0～0.1
0.11～0.3
, http://www.100md.com
>0.3
系统性红斑狼疮
1～6个月
7
2
5
0
6个月以上
6
5
1
0
盘状红斑狼疮
, http://www.100md.com 1～6个月
3
0
0
3
6个月以上
6
4
2
0
对 照 组
7
7
0
, http://www.100md.com
0
图1 早期DLE皮损表皮出现大量
PCD阳性细胞(×20)
3例病程在6个月以内的DLE皮损除表皮棘细胞层和颗粒层可见到较多的PCD阳性细胞外，其真皮内的毛囊及皮脂腺亦可见到较多的PCD阳性细胞。
三、讨论
我们检测的22例红斑狼疮皮损的表皮基底层细胞均有不同程度的液化变性，但无一例在基底 层出现PCD阳性着色，说明细胞变性坏死与凋亡有着不同的分子机制，也证明TUNEL法检测PC D具有较高的特异性。本研究发现有些细胞核膜呈紫蓝色着色，提示细胞处于凋亡早期染色 质浓聚阶段；另一些细胞核内呈均匀一致的紫蓝色着色，表明DNA凋亡片段化分布于整个细 胞核，凋亡已进一步发展。
, 百拇医药
本研究的13例SLE皮损中，其凋亡指数明显高于正常皮肤对照组，且与病程长短呈负相关。C aseiola-Rosen等[3] 对表皮角朊细胞凋亡过程进行研究，发现在角朊细胞凋亡过程中产生了含 有DNA、内质网、Ro、La及核糖体等多种细胞成分的自身抗原 。故作者推测，在SLE早期，由于皮肤角朊细胞异常凋亡，产生了大量含有多种细胞成分 的自身抗原。而SLE患者机体内存在有识别自身抗原的T淋巴细胞[4]，当它们受到自身抗原的刺激时，则产生大量针对细胞多种成分的自身抗体，从而发病 或使病情加重。我们所检测的9例DLE，其凋亡指数与正常皮肤对照组之间亦有显著性差异， 且3例早期未经皮质激素治疗的皮损AI值明显高于6例充分发展并经皮质激素治疗的皮损AI值 (P<0.05)。另外，于毛囊及皮脂腺亦可见到较多的PCD阳性细胞，表明DL E在发病早期，其角朊细胞、毛囊及皮脂腺细胞均发生异常凋亡，这可能是造成DLE表皮、毛 囊、皮脂 腺萎缩等病理改变的直接原因。有研究发现，当培养人的角朊细胞受到紫外线照射后，可引 起细胞凋亡[3]。红斑狼疮患者常在日光曝晒后皮损加重，很可 能与日光紫外线照射进一步加速了表皮、毛囊、皮脂腺的细胞凋亡有关。
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参考文献
1 Tan EM. Autoimmunity and apoptosis. J Exp Med, 1994,179 ∶1083-1086.
2 Lipponen PK, Aaltomaa S. Apoptosis in bladder cancer as related to stan dard prognostic factors and prognosis. J Pathol, 1994,173∶333-339.
3 Casciola-Rosen LA, Anhalt G, Rosen A. Autoantigens targeted in systemi c lupus erythematosus are clustered in two populations of surface structures on apoptoti c keratinocytes. J Exp Med, 1994,179∶1317-1330.
4 Sercarz EE, Lehmann PV, Ametani A, et al. Dominance and crypticity of T cell antigenic determinants. Ann Rev Immunol, 1993,11∶729-766.
(收稿：1997-08-25 修回：1997-12-31), http://www.100md.com
单位：430060 武汉，湖北医科大学附属第一医院皮肤科
关键词：
中华皮肤科杂志980525 近年来对细胞凋亡与自身免疫疾病关系的研究已成为热点[1 ]。红斑狼疮是自身免疫病的一个原型，而皮肤损害是红斑狼疮的一个突出表 现。为研究细胞凋亡与红斑狼疮皮损发生、发展的关系，我们采取原位DNA断裂位点末端标 记技术(TUNEL)，对13例系统性红斑狼疮(SLE)和9例盘状红斑狼疮(DLE)患者不同病程的皮损 进行了表皮角朊细胞凋亡的研究。
一、材料与方法
(一)标本来源：13例SLE和9例DLE皮损标本均来自我科1995年1月至1997年4月临床资料保存 完整的石蜡包埋组织。SLE符合美国风湿病协会1982年修订的分类标准。DLE根据皮疹、皮肤病理及免疫荧光带试验而确诊。13例SLE中男4例，女9例；平均年龄29.9岁；病程在6个月以内且未经皮质类固醇激素治疗者7例，6个月以上且经全身皮质类固醇激素治疗者6例。9例 DLE中男3例 ，女6例；平均年龄37.8岁；病程在1至6个月(早期)且未经皮质类固醇激素治疗者3例，表 现为浸润性红斑；病程在6个月以上(晚期)且局部用过皮质类固醇激素治疗者6例，为典型的 盘状红斑。7例正常对照来源于皮肤外科手术的正常皮肤。
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(二)试剂：蛋白酶K为Merck公司产品，TdT酶购于Promega公司，DIG-dUTP及碱性磷酸酶(AP )偶联的抗DIG抗体为Boehringer公司产品，防脱片剂APES为Sigma公司产品。
(三)原位DNA断裂位点的3-羟基末端标记(TUNEL)方法：切取5μm厚的石蜡切片贴附于APES 处理过的载玻片上，常规脱蜡水化，20μg/ml蛋白酶K室温孵育15分钟，双蒸水冲洗，TdT反 应液37℃孵育60分钟，2×SSC洗涤后，滴加1∶1500抗DIG-AP偶联抗体，37℃孵育30分钟， 最后NBT/BCIP室温暗处显色。
(四)细胞凋亡指数(apoptotic index, AI)测定：沿核膜见到环形、半月形或细胞核中央呈 团块状的紫蓝色颗粒沉着为凋亡阳性细胞。每张切片连续选择5个阳性染色最明显的高倍视 野(×400)，计算每平方毫米表皮细胞中凋亡阳性细胞所占的百分比即为该切片的凋亡指数 [2]。根据凋亡指数大小将其分为0～0.1、0.11～0.3和>0. 3三组。所得结果采用Wilcoxon秩和检验进行统计分析。
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二、结果
不同病程SLE和DLE细胞凋亡指数分布情况见附表。正常皮肤仅在颗粒层见到程序性细胞死亡 (PCD)阳性细胞(图1)。SLE及DLE皮损表皮内PCD细胞除分布于颗粒层外，尚可见于棘细胞层，两者的细胞凋亡指数均明显高于对照组(P<0.05)，但DLE与SLE之间无显著性差异(P>0.05)。另外，SLE和DLE皮损表皮细胞AI与病程密切相关( P<0.05)，病程越短，AI值越高；反之亦然，详见附表。
附表 SLE和DLE皮损表皮细胞凋亡指数分布情况 病种与病程
例数
细胞凋亡指数(AI)
0～0.1
0.11～0.3
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>0.3
系统性红斑狼疮
1～6个月
7
2
5
0
6个月以上
6
5
1
0
盘状红斑狼疮
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3
0
0
3
6个月以上
6
4
2
0
对 照 组
7
7
0
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0
图1 早期DLE皮损表皮出现大量
PCD阳性细胞(×20)
3例病程在6个月以内的DLE皮损除表皮棘细胞层和颗粒层可见到较多的PCD阳性细胞外，其真皮内的毛囊及皮脂腺亦可见到较多的PCD阳性细胞。
三、讨论
我们检测的22例红斑狼疮皮损的表皮基底层细胞均有不同程度的液化变性，但无一例在基底 层出现PCD阳性着色，说明细胞变性坏死与凋亡有着不同的分子机制，也证明TUNEL法检测PC D具有较高的特异性。本研究发现有些细胞核膜呈紫蓝色着色，提示细胞处于凋亡早期染色 质浓聚阶段；另一些细胞核内呈均匀一致的紫蓝色着色，表明DNA凋亡片段化分布于整个细 胞核，凋亡已进一步发展。
, 百拇医药
本研究的13例SLE皮损中，其凋亡指数明显高于正常皮肤对照组，且与病程长短呈负相关。C aseiola-Rosen等[3] 对表皮角朊细胞凋亡过程进行研究，发现在角朊细胞凋亡过程中产生了含 有DNA、内质网、Ro、La及核糖体等多种细胞成分的自身抗原 。故作者推测，在SLE早期，由于皮肤角朊细胞异常凋亡，产生了大量含有多种细胞成分 的自身抗原。而SLE患者机体内存在有识别自身抗原的T淋巴细胞[4]，当它们受到自身抗原的刺激时，则产生大量针对细胞多种成分的自身抗体，从而发病 或使病情加重。我们所检测的9例DLE，其凋亡指数与正常皮肤对照组之间亦有显著性差异， 且3例早期未经皮质激素治疗的皮损AI值明显高于6例充分发展并经皮质激素治疗的皮损AI值 (P<0.05)。另外，于毛囊及皮脂腺亦可见到较多的PCD阳性细胞，表明DL E在发病早期，其角朊细胞、毛囊及皮脂腺细胞均发生异常凋亡，这可能是造成DLE表皮、毛 囊、皮脂 腺萎缩等病理改变的直接原因。有研究发现，当培养人的角朊细胞受到紫外线照射后，可引 起细胞凋亡[3]。红斑狼疮患者常在日光曝晒后皮损加重，很可 能与日光紫外线照射进一步加速了表皮、毛囊、皮脂腺的细胞凋亡有关。
, 百拇医药
参考文献
1 Tan EM. Autoimmunity and apoptosis. J Exp Med, 1994,179 ∶1083-1086.
2 Lipponen PK, Aaltomaa S. Apoptosis in bladder cancer as related to stan dard prognostic factors and prognosis. J Pathol, 1994,173∶333-339.
3 Casciola-Rosen LA, Anhalt G, Rosen A. Autoantigens targeted in systemi c lupus erythematosus are clustered in two populations of surface structures on apoptoti c keratinocytes. J Exp Med, 1994,179∶1317-1330.
4 Sercarz EE, Lehmann PV, Ametani A, et al. Dominance and crypticity of T cell antigenic determinants. Ann Rev Immunol, 1993,11∶729-766.
(收稿：1997-08-25 修回：1997-12-31), http://www.100md.com