当前位置: 首页 > 期刊 > 《中华皮肤科杂志》 > 1998年第5期
编号:10275748
三种方法分离新生隐球菌RNA及其评价
http://www.100md.com 《中华皮肤科杂志》 1998年第5期
     作者:陈江汉 廖万清 温海 吴建华 姚志荣 顾菊林 刘晓刚

    单位:200003 上海,第二军医大学长征医院皮肤科隐球 菌专业实验室

    关键词:

    中华皮肤科杂志980516 如何获得高质量的生物RNA,是分子生物学研究的基础和极为关键的一步。 如Northern印迹及杂交分析,寡聚(dT)纤维素选择分离mRNA,cDNA合成及体外翻译,RT-PC R等实验的成败,很大程度上决定于RNA的纯度和完整性。我们参考哺乳动物细胞RNA的抽提 方法,并对其作了适当的修改,成功地获得了高质量的RNA,同时对它们的优劣进行了初步 的比较。

    一、材料和方法

    (一)菌株和试剂:菌株由我院中国医学真菌保藏管理中心隐球菌专业实验室提供,编号为CC CC0112,为临床分离株,保存于沙堡固体培养基斜面上。试剂有:①液体培养基YEPD:1%酵 母抽提物、2%蛋白胨、2%葡萄糖。②溶液D:4mol/L异硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠(pH7.0 )、0.5% Sarcosyl、0.1mol/L β-巯基乙醇组成。③盐酸胍匀浆1:8mmol/L盐酸胍、0. 1mmol/L醋酸钠(pH5.2)、5mmol/L β-巯基乙醇、0.5%十二烷基肌酸钠(SLS)。④盐酸胍 匀浆2:8mmol/L盐酸胍、0.1mmol/L醋酸钠(pH5.2)、1mmol/L β-巯基乙醇、20mmol/L E DTA pH8.0。⑤LiCl/尿素液:3mol/L LiCl、6mmol/L尿素。⑥悬浮液:10mmol/L Tris-Cl pH7.0、1mmol/L EDTA pH8.0、0.5% SDS。
, http://www.100md.com
    (二)方法:

    1.菌株的培养和裂解:保藏的菌株接种到固体沙堡培养基斜面上,活化3天后移种一整环菌 株于100ml YEPD培养基中,30℃振荡培养(200r/min)过夜,取1ml菌液离心收集菌体(4000r/ min 5分钟),无菌生理盐水清洗后重新离心收集菌体(4000r/min 5分钟)。

    2.RNA的分离:方法1参见文献[1]。方法2参见文献[2]:以LiCl/尿素液悬浮菌体,移 到组织匀浆器中,电动匀浆3分钟,匀浆液4℃静置4小时后移至Eppendorf管中,离心12 00 0r /min 30分钟,弃上清液,加入原匀浆液1/2容积的预冷LiCl/尿素液振荡充分混匀,离心(12 00 0r/min 30分钟),弃上清液,用1/2原匀浆液容积的悬浮液溶解沉淀物,加入等容积的酚∶ 氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),反复颠倒离心管,混匀10分钟,离心(3000r/min 5分钟),吸取 上 清液,加入1/10体积的3mmol/L NaAc(pH5.2)和2倍体积乙醇,混匀,-20℃放置15分钟,离 心沉淀RNA(12 000r/min 15分钟),弃上清液,75%乙醇清洗RNA,风干后加入50μl DEPC处 理 过的双蒸水,溶解RNA。方法3[3]:以1ml溶液D悬浮菌体,转移 到电动匀 浆器中,冰浴中匀浆3分钟,移至4ml Eppendorf管中,加入0.1ml 2mol/L浓度的醋酸钠,p H4.0,充分混匀后加入1ml的酚-氯仿,反复翻转混匀后剧烈摇荡10秒,冰浴中静置15分钟 ,样本在4℃条件下离心15分钟(13 000r/min),吸取上清液,加入1ml的异丙醇,混匀后-2 0℃静置30分钟,离心沉淀RNA(13 000r/min 15分钟),2倍体积的冰冻乙醇清洗后,沉淀风 干,以50μl DEPC处理过的无菌水溶解RNA。
, http://www.100md.com
    3.RNA的检测:各取10μl RNA溶液与2μl溴酚蓝混匀后,琼脂糖凝胶电泳检测RNA,同时取4 μl RNA样品,加水至1ml混匀后,转入分光光度计的石英比色杯中,先用1ml水校正零点,2 60nm和280nm分别读出吸光度A值,检测RNA的纯度和浓度。

    二、结果

    (一)匀浆新生隐球菌菌体时,每隔1分钟进行墨汁涂片检查和培养,在第3分钟时镜检和培养 均未见菌体,重复试验时也未查见。

    (二)无论是方法1还是方法2、3,电泳检测RNA时,紫外光照射下可见清晰的3条带,以啤酒 酵母和小白鼠肝细胞RNA作为对照,显示其大小分别为25S、18S和5S,即三种方法均获得了 能检测到的RNA。

    (三)每次取3个样本,以其平均数作为菌量,以分光光度计所测数值计算RNA的浓度和纯度, 重复5次后,比较3种方法的算术平均数。结果显示:方法1、2所获得的RNA可见轻微DNA污染 ,且其产量略低于方法3,方法3相对纯度高,但三者的量均低于用同样的方法3所获得的小 鼠肝细胞RNA而接近于啤酒酵母的RNA含量。
, http://www.100md.com
    附表 3种方法所抽提的新生隐球菌RNA的各种参数 方 法

    比率(260/280nm)

    DNA

    产量

    (μg/105个)

    方法1

    1.73±0.08

    测出

    1.14±0.04

    方法2

    1.76±0.04

    测出
, 百拇医药
    1.09±0.02

    方法3

    新 生

    隐球菌

    1.85±0.05

    未测出

    1.23±0.04

    啤酒酵母

    1.86±0.05

    未测出

    1.26±0.05

    小 鼠

    肝细胞
, 百拇医药
    1.86±0.04

    未测出

    1.69±0.04

    注:方法1、2检测的为新生隐球菌

    三、讨论

    RNA特别是mRNA的纯度和完整性主要取决于以下几个方面的因素:①不同生长期和生长条件 下的新生隐球菌。本试验所获得的均为指数生长期新生隐球菌的总RNA。一般而言,以YEPD 为液体培养基,250ml烧瓶中在100ml培养基内接种1个菌环的菌量,30℃孵育过夜,每1ml液 体中菌量可达108个,我们的实验中,经孵育过夜后,每1ml的菌量为8.6×107个 。当然,为了获得足够的目的mRNA的产量,还需改变相应的生长条件。②新生隐球菌RNA的 全部释放。我们的试验表明,电动匀浆后3分钟,均能彻底破坏新生隐球菌的结构,使得其R NA获得满意的释放。③最主要者为实验过程中RNA的降解和丢失,特别是RNase的作用。RNas e是一类生物活性非常稳定的酶,存在于细胞内外,因此预防其作用必须从两方面着手,一 是实验必须在一个相对洁净的环境中进行。操作中戴手套和口罩,新的玻璃器皿和溶液均经 DEPC(二乙基焦碳酸盐)处理并经高压灭菌等,可以有效地防止外源RNase的破坏;二是防止 细胞内RNase的作用[4],主要依靠异硫氰酸胍[3 ]。4mol/L异硫氰酸胍和β-巯基乙醇可以极度抑制RNase的活性,而去污剂Sa rcosyl又可以显著增强前者的作用,因此,我们将之应用于新生隐球菌RNA的分离,获得了 满意的效果。电泳图和分光光度计显示,三种方法新获得的RNA均能满足分子生物学实验的 要求,清晰的三条带分别为25S、18S和5S rRNA,这占RNA的绝大部分,由于tRNA和mRNA的含 量极微,且mRNA的大小差异不确定,因此尚不足以检测到它们的存在,更无法呈现清晰的可 辨的条带。实验中所获得的新生隐球菌RNA的产量均少于小鼠肝细胞而接近于啤酒酵母,这 可能与小鼠肝细胞的转录、翻译活动较为活跃有关。而方法3所获得的RNA无论是纯度和产量 上均不低于方法1、2,但后者易受到DNA的污染,特别是方法2,可能由于LiCl的作用,偶而 还会引起5S RNA的丢失。
, 百拇医药
    另外,3种方法尽管适用于大样本或少量组织的RNA的提取,但方法1、2需要7小时多的时间 方能完成操作,其中特别是方法1需要近20个步骤,大大繁杂于方法3,方法3步骤少,3小时 即可完成,且不需要大型仪器设备,因而更为适用于新生隐球菌分子生物学的研究。特别 是近几年来RT-PCR的发展,改变了分子生物学家的实验手段和效率,方法3已较多应用于哺 乳动物的研究中,因此我们认为方法3以其高质量的RNA和方法简单易行,费时较少更显其优势。

    参考文献 1 卢圣栋. 现代分子生物学技术. 北京: 高等教学出版社, 1993.1 42.

    2 Williamson PR. Biochemical and molecular characterization of the diphen ol oxida se of Cryptococcus neoformans: identification as a laccase. J Ba cteriol, 1994,176∶656-664.

    3 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid g uanidini um thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987,162∶156-159.

    4 Salas SD, Bennett JE, Kwon-Chung KJ, et al. Effect of the laccase gene , CNLAC1 , on virulence of Cryptococcus neoformans. J Exp Med, 1996,184∶ 377-386., 百拇医药