中药射干提取物对皮肤癣菌抑菌作用研究
作者：刘春平 王凤荣 南国荣 四荣联 王刚生 郭文友
单位：050051 石家庄，河北医科大 学第三医院(刘春平)；第二医院(南国荣 四荣联 王刚生 郭文友)；河北医科大学 病理研究室(王凤荣)
关键词：
中华皮肤科杂志980515 本实验选用中药射干进行研究，测定各部分提取物 对5种常见皮肤癣菌的抑 菌作用，以期为临床采用射干提取物治疗皮肤癣菌病提供科学依据。
一、材料和方法
1.菌种：红色毛癣菌(Tr)、须癣毛癣菌(Tm)、犬小孢子菌(Mc)、石膏样小孢子菌(Mg)和絮状 表皮癣菌(Ef)各1株，均为购于中国协和医科大学皮肤病研究所菌种保藏中心的标准株。
2.药物、药物提取及培养基制备：射干1000g，由本院中药房提供。根据李应勤等 [1]的方法，取射干1000g粉碎后，以95%乙醇回流提取3次。合并提取液， 加热浓缩，得稠膏200g，加水溶解，滤去不溶物。水溶液依次用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃 取，减压回流，三部分得量分别是25g、9g和30g。取三部分提取物和前两部分混和物(1∶1) 各2g、2g、5g和2g，分别溶于3ml二甲基亚砜中，将4种溶液分别以沙堡琼脂培养基稀释至10 0ml做为初浓度，再倍比稀释5次，得6个浓度的系列药基。设实验组、对应浓度的二甲基亚 砜对照组及空白对照组。冷藏备用。
, 百拇医药
3.抑菌效果观察：将5种皮肤癣菌分别移种于沙堡琼脂培养基，25℃培养7～14天，以手术刀 刮取菌丝体，加入无菌生理盐水，研磨，至形成菌悬液(菌丝长度约为10～50μm)。离心(40 00r/min，5分钟)，弃上清液。取沉淀菌丝分别加入沙堡液体培养基中，用血细胞计数板调 节菌丝浓度为0.5～1.0×107CFU/ml。5种菌悬液分别振荡混匀，接种于实验组和对 照组培养基斜面的底部，接种量10μl，平行样品3管。试管直立放置，25℃培养2周。3管均 无生长为阴性，阴性管的最低药物浓度为对该菌的最小抑菌浓度(MIC)。同时记录阳性管中菌丝体高度(cm)，以观察有无量效反应关系。
4.流式细胞术样品制备及检测：取抑菌效果最好的射干提取物，根据MIC以沙堡液体培养基 为基质，配制成药液，挑取Tr菌落(沙堡琼脂培养基，25℃培养12天)边缘菌丝体，浸泡于药 液。24小时取出，5%甲醛溶液固定，剪碎，加入0.5%盐酸胃蛋白酶1ml，37℃消化15分钟， 边消化边吹打，消化后于高倍镜下可见大量单体细胞。200目尼龙网过滤，低速离心去碎片 ，采用溴化乙啶一步插入性染色法进行染色，500目铜网过滤，待测[2][ HT5”〗。同时设二甲基亚砜对照组和空白对照组，每组平行样品3份。以FACS 420型流式细 胞仪检测，测量数据和图形输入HP-300 Consort 30计算机进行处理。测定前以鸡红细胞作 为标准样品调整仪器的CV值在5.0%以内。
, 百拇医药
5.统计学处理：用Poms软件对阳性管中菌丝体高度进行直线相关回归处理。以t检验处理流式细胞术检测数据，并计算PI值[3]。
二、结果
1.射干提取物中乙醚部分对5种皮肤癣菌的MIC为1.25～2.5mg/ml。乙酸乙酯部分对Tr和Ef 的MIC为20mg/ml，对其余3种菌在检测范围内无效。正丁醇部分在检测范围内对5种菌均无效 。混和物的MIC为1.25～2.5mg/ml，对Tr、Tm和Mg的抑菌作用略强于乙醚部分，对Mc和Ef 的抑菌作用等同于单纯乙醚部分。
2.乙醚部分抗5种皮肤癣菌各管生长情况及统计学处理见附表。由附表中可以看出，乙醚部 分对5种皮肤癣菌的抑菌作用均有量效反应关系。
附表 不同浓度射干乙醚提取物抗5种皮肤癣菌各管生长情况
, http://www.100md.com
(菌丝体高度)及统计学处理(cm) 皮肤癣菌
0.625mg/ml
1.25mg/ ml
r
Y=a+bx
P
1
2
3
1
2
3
红色毛癣菌
, 百拇医药
0 .5*
0.4
0.3
0
0
0
-0.9608
Y=0.8-0. 64x
<0.01
须癣毛癣菌
10
8
6
, 百拇医药
0.6
0.5
0.4
-0.7662
Y=8.25-3.7143x
<0.05
石膏样小孢子菌
6.5
6
5.5
1.1
1.0
0.9
, http://www.100md.com
-0.845
Y =6.5-2.8571x
<0.01
犬小孢子菌
2.5
2
1.5
0
0
0
-0.9608
Y=4-3.2x
<0.01
, 百拇医药
絮状表皮癣菌
0.3
0.2
0.1
0
0
0
-0.866
Y=0.4-0.32x
<0.01
注：提取物浓度为2.5、5.0、10.0、20.0mg/ml时5种皮肤癣菌各管均阴性。输入数 据取至出现阴性结果的第1大组(如Tr输入6组数据) 3.取乙醚部分MIC的最高值2.5mg/ml配制药液。流式细胞计数检测 结果显示，药物作用后Tr S期DNA含量增高，与两对照组相比均有显著性差异(P<0.05)。两对照组之间无显著性差异(P>0.05)。三组的PI值分别 为：实验组53.95%，二甲基亚砜对照组38.33%，空白对照组38.11%，各组之间均无显著 性差异(P>0.05)。
, 百拇医药
三、讨论
中药射干属于鸢尾科植物射干的干燥根茎[4]。关于射干抑制皮 肤癣菌的研究已有报道，但均用射干全药。本实验依射干药用成分极性的增强，将其分别提 取于乙醚、乙酸乙酯和正丁醇中。实验结果显示，射干的乙醚部分提取物对5种常见皮肤癣 菌的抑菌效果最好，具有量效反应关系。表明射干中极性小的亲脂性成分是其抗皮肤癣菌的 有效成分。
流式细胞计数已应用于真菌领域有关研究。皮肤癣菌通常状态下以菌丝形式存在，本实验 用0 .5%盐酸胃蛋白酶对其进行消化，从而将多细胞形式的菌丝变成细胞单体。经药物作用后， Tr的DNA含量增高，有较强的增殖活性，可能是Tr遇到不利条件时，为了生存出现的代偿性 变化，或可能菌丝细胞不全有核，制成单体后，各期带核的细胞数不一致等因素所致，有待 进一步研究。
参考文献 1 李应勤, 陆蕴茹, 魏璐雪. 白射干黄酮类成分的研究. 药学学报 , 1986,21∶836-841.
2 左连富. 流式细胞术与生物医学. 第1版. 沈阳: 辽宁科学技术出版社, 1996.68 -73.
3 李荫英, 朱永德, 郑力芬, 等. 应用FCM和TEM分析人胚肺二倍体细胞. 中华物理 医学杂志, 1992,14∶240-243.
4 江苏新医学院. 中药大辞典. 第1版. 上海: 上海科学技术出版社, 1991.1883-1 885., http://www.100md.com
单位：050051 石家庄，河北医科大 学第三医院(刘春平)；第二医院(南国荣 四荣联 王刚生 郭文友)；河北医科大学 病理研究室(王凤荣)
关键词：
中华皮肤科杂志980515 本实验选用中药射干进行研究，测定各部分提取物 对5种常见皮肤癣菌的抑 菌作用，以期为临床采用射干提取物治疗皮肤癣菌病提供科学依据。
一、材料和方法
1.菌种：红色毛癣菌(Tr)、须癣毛癣菌(Tm)、犬小孢子菌(Mc)、石膏样小孢子菌(Mg)和絮状 表皮癣菌(Ef)各1株，均为购于中国协和医科大学皮肤病研究所菌种保藏中心的标准株。
2.药物、药物提取及培养基制备：射干1000g，由本院中药房提供。根据李应勤等 [1]的方法，取射干1000g粉碎后，以95%乙醇回流提取3次。合并提取液， 加热浓缩，得稠膏200g，加水溶解，滤去不溶物。水溶液依次用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃 取，减压回流，三部分得量分别是25g、9g和30g。取三部分提取物和前两部分混和物(1∶1) 各2g、2g、5g和2g，分别溶于3ml二甲基亚砜中，将4种溶液分别以沙堡琼脂培养基稀释至10 0ml做为初浓度，再倍比稀释5次，得6个浓度的系列药基。设实验组、对应浓度的二甲基亚 砜对照组及空白对照组。冷藏备用。
, 百拇医药
3.抑菌效果观察：将5种皮肤癣菌分别移种于沙堡琼脂培养基，25℃培养7～14天，以手术刀 刮取菌丝体，加入无菌生理盐水，研磨，至形成菌悬液(菌丝长度约为10～50μm)。离心(40 00r/min，5分钟)，弃上清液。取沉淀菌丝分别加入沙堡液体培养基中，用血细胞计数板调 节菌丝浓度为0.5～1.0×107CFU/ml。5种菌悬液分别振荡混匀，接种于实验组和对 照组培养基斜面的底部，接种量10μl，平行样品3管。试管直立放置，25℃培养2周。3管均 无生长为阴性，阴性管的最低药物浓度为对该菌的最小抑菌浓度(MIC)。同时记录阳性管中菌丝体高度(cm)，以观察有无量效反应关系。
4.流式细胞术样品制备及检测：取抑菌效果最好的射干提取物，根据MIC以沙堡液体培养基 为基质，配制成药液，挑取Tr菌落(沙堡琼脂培养基，25℃培养12天)边缘菌丝体，浸泡于药 液。24小时取出，5%甲醛溶液固定，剪碎，加入0.5%盐酸胃蛋白酶1ml，37℃消化15分钟， 边消化边吹打，消化后于高倍镜下可见大量单体细胞。200目尼龙网过滤，低速离心去碎片 ，采用溴化乙啶一步插入性染色法进行染色，500目铜网过滤，待测[2][ HT5”〗。同时设二甲基亚砜对照组和空白对照组，每组平行样品3份。以FACS 420型流式细 胞仪检测，测量数据和图形输入HP-300 Consort 30计算机进行处理。测定前以鸡红细胞作 为标准样品调整仪器的CV值在5.0%以内。
, 百拇医药
5.统计学处理：用Poms软件对阳性管中菌丝体高度进行直线相关回归处理。以t检验处理流式细胞术检测数据，并计算PI值[3]。
二、结果
1.射干提取物中乙醚部分对5种皮肤癣菌的MIC为1.25～2.5mg/ml。乙酸乙酯部分对Tr和Ef 的MIC为20mg/ml，对其余3种菌在检测范围内无效。正丁醇部分在检测范围内对5种菌均无效 。混和物的MIC为1.25～2.5mg/ml，对Tr、Tm和Mg的抑菌作用略强于乙醚部分，对Mc和Ef 的抑菌作用等同于单纯乙醚部分。
2.乙醚部分抗5种皮肤癣菌各管生长情况及统计学处理见附表。由附表中可以看出，乙醚部 分对5种皮肤癣菌的抑菌作用均有量效反应关系。
附表 不同浓度射干乙醚提取物抗5种皮肤癣菌各管生长情况
, http://www.100md.com
(菌丝体高度)及统计学处理(cm) 皮肤癣菌
0.625mg/ml
1.25mg/ ml
r
Y=a+bx
P
1
2
3
1
2
3
红色毛癣菌
, 百拇医药
0 .5*
0.4
0.3
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0
0
-0.9608
Y=0.8-0. 64x
<0.01
须癣毛癣菌
10
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, 百拇医药
0.6
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Y=8.25-3.7143x
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石膏样小孢子菌
6.5
6
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1.1
1.0
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Y =6.5-2.8571x
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犬小孢子菌
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2
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-0.9608
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絮状表皮癣菌
0.3
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<0.01
注：提取物浓度为2.5、5.0、10.0、20.0mg/ml时5种皮肤癣菌各管均阴性。输入数 据取至出现阴性结果的第1大组(如Tr输入6组数据) 3.取乙醚部分MIC的最高值2.5mg/ml配制药液。流式细胞计数检测 结果显示，药物作用后Tr S期DNA含量增高，与两对照组相比均有显著性差异(P<0.05)。两对照组之间无显著性差异(P>0.05)。三组的PI值分别 为：实验组53.95%，二甲基亚砜对照组38.33%，空白对照组38.11%，各组之间均无显著 性差异(P>0.05)。
, 百拇医药
三、讨论
中药射干属于鸢尾科植物射干的干燥根茎[4]。关于射干抑制皮 肤癣菌的研究已有报道，但均用射干全药。本实验依射干药用成分极性的增强，将其分别提 取于乙醚、乙酸乙酯和正丁醇中。实验结果显示，射干的乙醚部分提取物对5种常见皮肤癣 菌的抑菌效果最好，具有量效反应关系。表明射干中极性小的亲脂性成分是其抗皮肤癣菌的 有效成分。
流式细胞计数已应用于真菌领域有关研究。皮肤癣菌通常状态下以菌丝形式存在，本实验 用0 .5%盐酸胃蛋白酶对其进行消化，从而将多细胞形式的菌丝变成细胞单体。经药物作用后， Tr的DNA含量增高，有较强的增殖活性，可能是Tr遇到不利条件时，为了生存出现的代偿性 变化，或可能菌丝细胞不全有核，制成单体后，各期带核的细胞数不一致等因素所致，有待 进一步研究。
参考文献 1 李应勤, 陆蕴茹, 魏璐雪. 白射干黄酮类成分的研究. 药学学报 , 1986,21∶836-841.
2 左连富. 流式细胞术与生物医学. 第1版. 沈阳: 辽宁科学技术出版社, 1996.68 -73.
3 李荫英, 朱永德, 郑力芬, 等. 应用FCM和TEM分析人胚肺二倍体细胞. 中华物理 医学杂志, 1992,14∶240-243.
4 江苏新医学院. 中药大辞典. 第1版. 上海: 上海科学技术出版社, 1991.1883-1 885., http://www.100md.com