Fas、FasL 表达在银屑病发病机理中的作用
作者：耿松梅 谭升顺 刘恩让 彭振辉
单位：710004 西安医科大学附属第二医院皮肤科
关键词：银屑病；Fas；FasL；细胞死亡
中华皮肤科杂志990208 【摘 要】 目的 探讨Fas、FasL介导的细胞凋亡引发的免疫调节在银屑病发病机理中的作用及意义。方法 采用免疫组化方法和原位末端标记方法研究银屑病患者不同期皮损中Fas、FasL表达与细胞凋亡、局部单一核细胞浸润程度之间的关系。结果 1角质形成细胞既可表达Fas,又可表达FasL，二者分布基本一致；Fas、FasL表达强的部位角质形成细胞凋亡明显，而局部单一核细胞浸润减少。2患者进行期斑块型皮损中Fas、FasL表达低于相邻非皮损区及恢复期皮损， 正常表皮基本不表达。结论 银屑病皮损中角质形成细胞与单一核细胞间不能有效地借助于Fas 系统进行免疫杀伤和免疫调节从而参与该病的发生。
, 百拇医药
Apoptosis Induced by Fas, FasL in the Pathogenesis of Psoriasis
GENG Songmei,TAN Shengshun,LIU Enrang,et al.
Department of Dermatology, The Second Affiliated Hospital of Xi'an Medical University, Xi'an,710004
【Abstract】 Objective To study the relationship between Fas,FasL and apoptosis and their roles in the pathogenesis of psoriasis. Methods Immunohistochemical techniques were employed to study the expression of Fas,FasL in the uninvolved skin, progressive plaque lesions and regressive lesions. Apoptosis was detected with terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-DIG nick end labeling (TUNEL). Results 1Both Fas and FasL were expressed on the keratinocytes with basically the same distribution. There were obvious apoptosis of keratinocytes but reduced infiltration of mononuclear cells (MNCs) in the epidermis with intensive Fas and FasL staining. 2There was a significantly upregulated expression of Fas,FasL in uninvolved skin adjacent to the lesions and regressive lesions compared with that in progressive plaque lesions, as well as in normal skin. Conclusion The downregulated expression of Fas and FasL and increased infiltration of MNCs might contribute to ineffective immunosurveillance and immunoregulation in psoriatic lesions, which might be involved in the pathogenesis of psoriasis.
, 百拇医药
【Key words】 Psoriasis Fas Fas ligand Apoptosis
银屑病是一种以角质形成细胞良性增生和真皮炎症细胞浸润为病理特征的慢性复发性疾病。局部淋巴细胞(LC)的持续性存在、活化成为该病发病的关键环节。Fas、FasL 作为少数凋亡诱导基因， 所表达蛋白参与炎症反应中的免疫杀伤，并能及时下调免疫反应，维护自稳状态。我们采用免疫组化方法(IH)和原位末端标记(TDT-mediated, dUTP-DIG nick end labeling, TUNEL)方法研究在银屑病患者各期皮损中Fas、FasL表达与细胞凋亡、 局部单一核细胞(MNCS)浸润间的关系，以初步探讨该病发病机理中可能存在的又一免疫调节异常。
病例和方法
(一)病例及取材：寻常型银屑病患者30例，男20例，女 10例；年龄9～56岁(平均35岁)；病程1个月至20年(平均7年)； 皮损范围30%～70%。其中20例2个月内未接受系统与局部治疗， 每例取其进行期皮损和边缘正常皮肤(二者相距 >1.5cm)各1块。另取10例不同程度接受治疗或自行消退皮损。对照10例为门诊手术所取常规正常皮肤，年龄、性别与银屑病组无统计学差异。标本按常规制作成蜡块，经病理确诊。
, 百拇医药
(二)试剂：Fas(M-20)、FasL(N-20)兔抗人多克隆抗体(Santa Crusz公司)，工作浓度1∶100；SP检测试剂盒(Zymed公司)，工作浓度 1∶ 50 ；TUNEL检测试剂盒购自武汉博士德公司。
(三)实验方法：
1.免疫组化：组织蜡块经连续切片(约6μm)粘附于APES处理后玻片上，常规脱蜡至水；枸椽酸缓冲液(0.1mol/L,pH6.0)92℃～97℃、15min修复抗原；3% H202室温、30min灭活内源性过氧化物酶(HRP)；10%封闭血清37℃、30min后加入相应1抗，4℃过夜；生物素化2抗37℃、30min；HRP标记链霉亲和素37℃、30min；DAB显色，苏木素套染，常规脱水、透明、封片。阳性片为乳腺癌组织，阴性对照为TBS代替一抗，其余步骤相同。
2.TUNEL：切片脱蜡至水同前；蛋白酶K(20μg/μL)37℃、15min；标记液(TdT 0.25U/μL，dUTP-DIG 0.02nmol/μL)湿盒内37℃、60min；封闭液37℃、20min甩去，碱性磷酸酶-抗地高辛抗体37℃、60min；室温下BCIP/NBT显色镜检。阳性对照为扁平苔藓，阴性对照为TBS代替标记液，其余步骤相同。以上实验各步骤间需TBS充分漂洗。
, 百拇医药
(四)判断标准：
1.免疫组化：细胞浆或细胞膜棕黄着色为阳性，着色百分率计分：< 1%为0，1%～20%为1，21%～50%为2，>50%为3；着色强弱分为1、2级分别计分1、2分。上述两项相加为2～2.9者弱阳性(+)，3～3.9者为阳性(++)，≥4者为强阳性(+++)。
2.凋亡细胞计数：1IH 片镜下(×40)参照Kerr标准行形态学计数：核染色质浓缩、深染呈环状或新月状，胞浆皱缩。2TUNEL片镜下(×40)以胞核呈蓝紫色着色为凋亡细胞。 以上均取5个高倍视野计数凋亡百分数(AI)。
3.MNCS浸润：根据MNCS 在真皮的数量大致分为轻度、重度浸润，计为Ⅰ度、Ⅱ度。以上数据进行秩和检验、 等级相关分析，显著性检验水平α=0.05。
结 果
, 百拇医药
(一)Fas、FasL表达：正常表皮基本不表达。皮损部位角质形成细胞既表达Fas,又表达FasL，二者分布基本一致,Fas表达强于FasL(图1、2)。进行期皮损Fas、FasL表达低于消退期皮损及相邻正常皮肤，经秩和检验有统计学意义(HFas=47.63,HFasL=21.80,P均<0.05)，见表1。FasL高表达皮损局部MNCS浸润减少，二者等级相关检验有统计学意义(rs=-0.480,P<0.01)，见表2。
表1 银屑病各组角质形成细胞上Fas，FasL阳性染色半定量结果(例数) 组 别
例 数
Fas
FasL
+
, 百拇医药 ++
+++
+
++
+++
银屑病相邻正常皮肤
20
0
5
15
2
6
12
银屑病进行期
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20
14
4
2
16
4
0
银屑病恢复期
10
1
2
7
2
4
, 百拇医药
4
Hc值
-
47.63
21.80
p值
-
<0.05
<0.05
表2 银屑病皮损中FasL表达与单一核细胞浸润分级 皮损处单一核细胞浸润分级
例 数
FasL表达分级
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Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅰ度
23
6
6
11
Ⅱ度
27
14
8
5
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图1 Fas在银屑病恢复期皮损中表达(IH：×40) 图2 FasL在银屑病恢复期皮损中表达(IH：×40)
(二)凋亡细胞计数(TUNEL片，×40)：TUNEL法观察凋亡比单纯形态学观察敏感。Fas表达尤其为细胞膜表达处凋亡明显。 进行期皮损凋亡细胞[24.05(16～28)]分布于棘层上部或表皮浅层；恢复期皮损凋亡细胞[40.90(34～50)]分布于皮肤全层；边缘正常皮肤凋亡细胞[10.15(7～15)] 分布在于棘层下部。
讨 论
Fas、FasL主要表达于激活的淋巴细胞上，被用于进行免疫杀伤和免疫调节[1]。银屑病皮损真皮激活的LC持续性浸润是该病发病关键环节[2]。我们从局部Fas系统介导免疫调节方面研究该病可能存在的发病因素。实验结果表明：进行期皮损中Fas表达弱于恢复期及相邻正常皮损中表达，但仍高于正常对照。在Fas表达明显处尤其呈膜表达时，凋亡现象较明显，其中TUNEL检测结果与徐丽敏等[3]报道相似。另有报道，在银屑病皮损中，原癌基因 BCL-XL，增殖性核抗原(PCNA)高表达，且增殖的角质形成细胞对凋亡有一定抵制作用[4]。Wrone-Smith[5]在斑块型皮损中也检测到Fas表达高于正常，国内有报道Fas呈低表达，但均未见与其它各期皮损相比较分析。此外，皮损角质形成细胞上FasL表达与局部MNCS 浸润程度呈负相关， 且可见到散在的TUNEL阳性MNCS细胞。已有报道：体外培养角质形成细胞可表达FasL，并具有借此杀伤周围LC及某些病原微生物能力，从而在表皮防御中担负一定功能[6]。本实验中：恢复期角质形成细胞 FasL表达明显强于进行期皮损，结果与Gutierrez-Steil[7]所观察中波紫外线UVB治疗银屑病皮损前后FasL 表达一致。
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综上我们推测：尽管银屑病与其它某些皮肤炎症均有T细胞的活化浸润，但由于某些机制使角质形成细胞不能有效表达Fas、FasL， 及时清除病变角质形成细胞、下调真皮T细胞炎症反应，使局部自稳状态破坏，角质形成细胞增生。另一方面，银屑病皮损在长期反复过程中大多维持良性增生性质，也许正因为角质形成细胞既可表达Fas、又可表达FasL，且Fas表达强于FasL，因而可能存在一定“自杀”或受T细胞监视，没有进一步恶变。而在皮肤恶性黑素瘤中Fas表达弱或无，FasL则呈高表达，因可单向杀伤LC，逃避T细胞监视而增殖、转移[8]。Fas、FasL表达与增殖性皮肤病良恶性关系有待进一步研究。
参考文献
1 Suda T, TaKahashi T, Golstein P, et al. Molecular cloning and expression of the Fas ligand: a novel member of the tumor necrosis factor family. Cell,1993,75:1169-1178.
, 百拇医药
2 Norris DA, Travers JB,Leuny DYM. Lymphocyte activation in the pathogenesis of psoriasis.J Invest Dermatol,1997,109:1-4.
3 徐丽敏,陈学荣,殷金珠.角朊细胞凋亡与银屑病.中华皮肤科杂志, 1997,30:235-236.
4 Wrone-Smith T, Mitra RS, Thompson CB, et al. Keratinocytes derived from psoriatic plaques are resistant to apoptosis compared with normal skin. Am J Pathol,1997,151:1321-1329.
5 Wrone-Smith T,Johnson T, Nelson B, et al. Discordant expression of Bcl-X and Bcl-2 by keratinocytes in vitro and psoriatic keratinocytes in vivo. Am J Pathol,1995,146:1079-1088.
, 百拇医药
6 Berthou C, Michel L, Soulie A, et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand protein by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol, 1997,159:5293-5300.
7 Gutierrez-Steil C, Wrone-Smith T, Sun X,et al. Sunlight-induced basal cell carcinoma turmor cells and ultraviolet-B-irradiated psoriatic plaques express Fas ligand (CD95L). J Clin Invest, 1998,101:33-39.
8 Hahne M,Rimoldi D,Schroter M, et al. Melanoma cell expression of Fas (Apo-1/CD95)ligand:Implications for tumor immune escape.Science,1996,274:1363-1366.
(收稿：1998-08-04 修回：1998-11-19), 百拇医药
单位：710004 西安医科大学附属第二医院皮肤科
关键词：银屑病；Fas；FasL；细胞死亡
中华皮肤科杂志990208 【摘 要】 目的 探讨Fas、FasL介导的细胞凋亡引发的免疫调节在银屑病发病机理中的作用及意义。方法 采用免疫组化方法和原位末端标记方法研究银屑病患者不同期皮损中Fas、FasL表达与细胞凋亡、局部单一核细胞浸润程度之间的关系。结果 1角质形成细胞既可表达Fas,又可表达FasL，二者分布基本一致；Fas、FasL表达强的部位角质形成细胞凋亡明显，而局部单一核细胞浸润减少。2患者进行期斑块型皮损中Fas、FasL表达低于相邻非皮损区及恢复期皮损， 正常表皮基本不表达。结论 银屑病皮损中角质形成细胞与单一核细胞间不能有效地借助于Fas 系统进行免疫杀伤和免疫调节从而参与该病的发生。
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Apoptosis Induced by Fas, FasL in the Pathogenesis of Psoriasis
GENG Songmei,TAN Shengshun,LIU Enrang,et al.
Department of Dermatology, The Second Affiliated Hospital of Xi'an Medical University, Xi'an,710004
【Abstract】 Objective To study the relationship between Fas,FasL and apoptosis and their roles in the pathogenesis of psoriasis. Methods Immunohistochemical techniques were employed to study the expression of Fas,FasL in the uninvolved skin, progressive plaque lesions and regressive lesions. Apoptosis was detected with terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-DIG nick end labeling (TUNEL). Results 1Both Fas and FasL were expressed on the keratinocytes with basically the same distribution. There were obvious apoptosis of keratinocytes but reduced infiltration of mononuclear cells (MNCs) in the epidermis with intensive Fas and FasL staining. 2There was a significantly upregulated expression of Fas,FasL in uninvolved skin adjacent to the lesions and regressive lesions compared with that in progressive plaque lesions, as well as in normal skin. Conclusion The downregulated expression of Fas and FasL and increased infiltration of MNCs might contribute to ineffective immunosurveillance and immunoregulation in psoriatic lesions, which might be involved in the pathogenesis of psoriasis.
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【Key words】 Psoriasis Fas Fas ligand Apoptosis
银屑病是一种以角质形成细胞良性增生和真皮炎症细胞浸润为病理特征的慢性复发性疾病。局部淋巴细胞(LC)的持续性存在、活化成为该病发病的关键环节。Fas、FasL 作为少数凋亡诱导基因， 所表达蛋白参与炎症反应中的免疫杀伤，并能及时下调免疫反应，维护自稳状态。我们采用免疫组化方法(IH)和原位末端标记(TDT-mediated, dUTP-DIG nick end labeling, TUNEL)方法研究在银屑病患者各期皮损中Fas、FasL表达与细胞凋亡、 局部单一核细胞(MNCS)浸润间的关系，以初步探讨该病发病机理中可能存在的又一免疫调节异常。
病例和方法
(一)病例及取材：寻常型银屑病患者30例，男20例，女 10例；年龄9～56岁(平均35岁)；病程1个月至20年(平均7年)； 皮损范围30%～70%。其中20例2个月内未接受系统与局部治疗， 每例取其进行期皮损和边缘正常皮肤(二者相距 >1.5cm)各1块。另取10例不同程度接受治疗或自行消退皮损。对照10例为门诊手术所取常规正常皮肤，年龄、性别与银屑病组无统计学差异。标本按常规制作成蜡块，经病理确诊。
, 百拇医药
(二)试剂：Fas(M-20)、FasL(N-20)兔抗人多克隆抗体(Santa Crusz公司)，工作浓度1∶100；SP检测试剂盒(Zymed公司)，工作浓度 1∶ 50 ；TUNEL检测试剂盒购自武汉博士德公司。
(三)实验方法：
1.免疫组化：组织蜡块经连续切片(约6μm)粘附于APES处理后玻片上，常规脱蜡至水；枸椽酸缓冲液(0.1mol/L,pH6.0)92℃～97℃、15min修复抗原；3% H202室温、30min灭活内源性过氧化物酶(HRP)；10%封闭血清37℃、30min后加入相应1抗，4℃过夜；生物素化2抗37℃、30min；HRP标记链霉亲和素37℃、30min；DAB显色，苏木素套染，常规脱水、透明、封片。阳性片为乳腺癌组织，阴性对照为TBS代替一抗，其余步骤相同。
2.TUNEL：切片脱蜡至水同前；蛋白酶K(20μg/μL)37℃、15min；标记液(TdT 0.25U/μL，dUTP-DIG 0.02nmol/μL)湿盒内37℃、60min；封闭液37℃、20min甩去，碱性磷酸酶-抗地高辛抗体37℃、60min；室温下BCIP/NBT显色镜检。阳性对照为扁平苔藓，阴性对照为TBS代替标记液，其余步骤相同。以上实验各步骤间需TBS充分漂洗。
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(四)判断标准：
1.免疫组化：细胞浆或细胞膜棕黄着色为阳性，着色百分率计分：< 1%为0，1%～20%为1，21%～50%为2，>50%为3；着色强弱分为1、2级分别计分1、2分。上述两项相加为2～2.9者弱阳性(+)，3～3.9者为阳性(++)，≥4者为强阳性(+++)。
2.凋亡细胞计数：1IH 片镜下(×40)参照Kerr标准行形态学计数：核染色质浓缩、深染呈环状或新月状，胞浆皱缩。2TUNEL片镜下(×40)以胞核呈蓝紫色着色为凋亡细胞。 以上均取5个高倍视野计数凋亡百分数(AI)。
3.MNCS浸润：根据MNCS 在真皮的数量大致分为轻度、重度浸润，计为Ⅰ度、Ⅱ度。以上数据进行秩和检验、 等级相关分析，显著性检验水平α=0.05。
结 果
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(一)Fas、FasL表达：正常表皮基本不表达。皮损部位角质形成细胞既表达Fas,又表达FasL，二者分布基本一致,Fas表达强于FasL(图1、2)。进行期皮损Fas、FasL表达低于消退期皮损及相邻正常皮肤，经秩和检验有统计学意义(HFas=47.63,HFasL=21.80,P均<0.05)，见表1。FasL高表达皮损局部MNCS浸润减少，二者等级相关检验有统计学意义(rs=-0.480,P<0.01)，见表2。
表1 银屑病各组角质形成细胞上Fas，FasL阳性染色半定量结果(例数) 组 别
例 数
Fas
FasL
+
, 百拇医药 ++
+++
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银屑病相邻正常皮肤
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银屑病进行期
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银屑病恢复期
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2
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Hc值
-
47.63
21.80
p值
-
<0.05
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表2 银屑病皮损中FasL表达与单一核细胞浸润分级 皮损处单一核细胞浸润分级
例 数
FasL表达分级
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Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅰ度
23
6
6
11
Ⅱ度
27
14
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图1 Fas在银屑病恢复期皮损中表达(IH：×40) 图2 FasL在银屑病恢复期皮损中表达(IH：×40)
(二)凋亡细胞计数(TUNEL片，×40)：TUNEL法观察凋亡比单纯形态学观察敏感。Fas表达尤其为细胞膜表达处凋亡明显。 进行期皮损凋亡细胞[24.05(16～28)]分布于棘层上部或表皮浅层；恢复期皮损凋亡细胞[40.90(34～50)]分布于皮肤全层；边缘正常皮肤凋亡细胞[10.15(7～15)] 分布在于棘层下部。
讨 论
Fas、FasL主要表达于激活的淋巴细胞上，被用于进行免疫杀伤和免疫调节[1]。银屑病皮损真皮激活的LC持续性浸润是该病发病关键环节[2]。我们从局部Fas系统介导免疫调节方面研究该病可能存在的发病因素。实验结果表明：进行期皮损中Fas表达弱于恢复期及相邻正常皮损中表达，但仍高于正常对照。在Fas表达明显处尤其呈膜表达时，凋亡现象较明显，其中TUNEL检测结果与徐丽敏等[3]报道相似。另有报道，在银屑病皮损中，原癌基因 BCL-XL，增殖性核抗原(PCNA)高表达，且增殖的角质形成细胞对凋亡有一定抵制作用[4]。Wrone-Smith[5]在斑块型皮损中也检测到Fas表达高于正常，国内有报道Fas呈低表达，但均未见与其它各期皮损相比较分析。此外，皮损角质形成细胞上FasL表达与局部MNCS 浸润程度呈负相关， 且可见到散在的TUNEL阳性MNCS细胞。已有报道：体外培养角质形成细胞可表达FasL，并具有借此杀伤周围LC及某些病原微生物能力，从而在表皮防御中担负一定功能[6]。本实验中：恢复期角质形成细胞 FasL表达明显强于进行期皮损，结果与Gutierrez-Steil[7]所观察中波紫外线UVB治疗银屑病皮损前后FasL 表达一致。
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综上我们推测：尽管银屑病与其它某些皮肤炎症均有T细胞的活化浸润，但由于某些机制使角质形成细胞不能有效表达Fas、FasL， 及时清除病变角质形成细胞、下调真皮T细胞炎症反应，使局部自稳状态破坏，角质形成细胞增生。另一方面，银屑病皮损在长期反复过程中大多维持良性增生性质，也许正因为角质形成细胞既可表达Fas、又可表达FasL，且Fas表达强于FasL，因而可能存在一定“自杀”或受T细胞监视，没有进一步恶变。而在皮肤恶性黑素瘤中Fas表达弱或无，FasL则呈高表达，因可单向杀伤LC，逃避T细胞监视而增殖、转移[8]。Fas、FasL表达与增殖性皮肤病良恶性关系有待进一步研究。
参考文献
1 Suda T, TaKahashi T, Golstein P, et al. Molecular cloning and expression of the Fas ligand: a novel member of the tumor necrosis factor family. Cell,1993,75:1169-1178.
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2 Norris DA, Travers JB,Leuny DYM. Lymphocyte activation in the pathogenesis of psoriasis.J Invest Dermatol,1997,109:1-4.
3 徐丽敏,陈学荣,殷金珠.角朊细胞凋亡与银屑病.中华皮肤科杂志, 1997,30:235-236.
4 Wrone-Smith T, Mitra RS, Thompson CB, et al. Keratinocytes derived from psoriatic plaques are resistant to apoptosis compared with normal skin. Am J Pathol,1997,151:1321-1329.
5 Wrone-Smith T,Johnson T, Nelson B, et al. Discordant expression of Bcl-X and Bcl-2 by keratinocytes in vitro and psoriatic keratinocytes in vivo. Am J Pathol,1995,146:1079-1088.
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6 Berthou C, Michel L, Soulie A, et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand protein by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol, 1997,159:5293-5300.
7 Gutierrez-Steil C, Wrone-Smith T, Sun X,et al. Sunlight-induced basal cell carcinoma turmor cells and ultraviolet-B-irradiated psoriatic plaques express Fas ligand (CD95L). J Clin Invest, 1998,101:33-39.
8 Hahne M,Rimoldi D,Schroter M, et al. Melanoma cell expression of Fas (Apo-1/CD95)ligand:Implications for tumor immune escape.Science,1996,274:1363-1366.
(收稿：1998-08-04 修回：1998-11-19), 百拇医药