银屑病患者血清抗致病分支杆菌抗体的检验
作者：吴勤学 尹跃平 李和莲 侯 伟 张津平 蔡秀玲 邵长庚
单位：210042 南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所
关键词：
中华皮肤科杂志990221 银屑病至今病因不明。有关其病因学的报道很多，迄今为止，大多报道倾向于银屑病是一种有遗传背景的与免疫有关的疾病，特别是A族溶血性链球菌超抗原与点滴状银屑病有关的观点已被大多数人所接受。以往大多报道链球菌、葡萄球菌和糠秕孢子菌等与银屑病的相关性，而分支杆菌与银屑病的关系尚缺乏报道。现将近年来我们的有关研究报道如下。
一、材料和方法
(一)待检标本：银屑病患者63例(寻常型51例，红皮病型7例，脓疱型5例)，均为我所门诊和病房患者，除1例为78岁外，其余者为12～55岁。采静脉血，分离血清后分装，-20℃备用。正常人对照血清(30份)取自我所常规体检工作人员和由甘肃地方病研究所提供，年龄为13～58岁，X线胸片正常。
, 百拇医药
(二)分支杆菌整菌抗原的制做及包被：
1.菌株及来源：人结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb,H37Rv)引自南京市胸科医院，堪萨斯分支杆菌(Mycobacterium kansasii,Mk)和海鱼分支杆菌(Mycobacterium marinum, Mm)均引自法国巴斯德研究所。
2.整分支杆菌抗原的制备：将上述各待试菌培养在改良罗氏培养基(Lowenstein-Jensen medium)上，Mtb和Mk于37℃孵育，Mm于33℃孵育，待菌落丰富时于无菌操作条件下用白金耳将之刮下和在玻璃研磨器中研磨以分散菌团，高压灭菌后，低速离心除去未分散之菌，取上清液按吸光度值(A值)调整菌悬液浓度，并用标准阳性血清标化其包被浓度。
3.抗原的包被：将标化的上述各分支杆菌抗原，按0.1mL/孔包被于40孔聚苯乙烯微量滴盘，37℃存放使去掉挥发缓冲液至干，待用。
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(三)间接酶联免疫吸附试验(ELISA)[1]：程序简述如下：1将已包被整菌抗原的微量滴盘用pH7.4 PBS/吐温20泡30min，再用PBS/吐温20 冲洗3次；2按0.2mL/孔，加5%脱脂奶粉(SM)封闭，37℃×30min；3加以2.5%SM-PBS 做1:200稀释的待试血清0.1mL于每孔，37℃×60min；4以PBS/吐温20冲洗3次后加以2.5%SM-PBS 做1:2000稀释的HRP-羊抗人IgA、IgG、IgM, 37℃×30min；5以PBS/吐温20冲洗3次，加底物和显色剂(OPD/H2O2)，37℃×30min；6以2.5N H2SO4中止反应，于波长490nm处测A值。实验设阳性及阴性对照，用空白校零点。
(四)统计学处理：取平均A值(
)=标准差(s)表示A总体均数水平和个体离散度，用Walters公式设定分界值和用卡方检验各抗原间检测结果是否有差异。
, 百拇医药
二、结果
从表1可见：1在受检的各型银屑病患者均显示血清抗Mtb、Mm和Mk抗体，从银屑病总体平均值(x)看Mm(1.20)>Mtb(1.06)>Mk(0.83)；2在正常人对照血清也显示有一定量的抗体，从总体平均值看Mm(0.42)>Mtb(0.39)>Mk(0.28)；3在3种分支杆菌，全部银屑病血清抗体水平与正常人之比>2.1倍，受检的各型银屑病患者血清抗体水平亦显示同样的规律；4在红皮病型银屑病，3种抗原都显示相当高的抗体水平和高的P/N；5在Mm，各型(类)银屑病均显示高抗体水平；6在点滴状和脓疱型银屑病，Mtb、Mk的抗体水平偏低；7在正常人对照亦显示有一定的抗体水平。
表1 银屑病患者及正常人血清中抗3种致病分支杆菌的抗体水平 受检标准
例数
人结核分支杆菌
, 百拇医药
海鱼分支杆菌
堪萨斯分支杆菌±s
P/N±s
P/N±s
P/N
寻常型银屑病
30
1.15±0.31
2.90
, 百拇医药
1.18±0.21
2.81
0.85±0.33
3.00
点滴状银屑病
11
0.85±0.35
2.20
1.16±0.25
2.76
0.70±0.35
2.50
, 百拇医药
斑块状银屑病
10
0.96±0.31
2.46
1.14±0.20
2.71
1.00±0.42
3.57
红皮病型银屑病
7
1.10±0.22
2.82
, 百拇医药 1.37±0.11
3.26
0.87±0.32
3.11
脓胞型银屑病
5
0.85±0.35
2.20
1.16±0.25
2.76
0.70±0.35
2.50
银屑病合计
, 百拇医药
63
1.06±0.34
2.70
1.20±0.24
2.86
0.83±0.35
2.96
正常人对照
30
0.39±0.29
-
0.42±0.62
-
, 百拇医药
0.28±0.27
-
注：寻常型银屑病包括点滴状银屑病和斑块状银屑病.P/N为患者与正常人平均水平之比；*检测28例，**检测29例
表2列出在银屑病和正常人对照测定抗Mtb、Mm和Mk抗体的定量分析结果。从表可见：1在分界值CV1(为正常人对照的平均A值)，几乎所有被检银屑病患者的血清抗体水平均高于此限，特别在Mm,100%的受检银屑病患者血清抗体含量超过此限，但在对应的正常人对照，亦有1/3～1/2超过此限；2在CV2(为正常人对照平均A值的2.1倍)，在Mtb则仅3.4%的正常人对照超过此限，在Mm和Mk仍有16.7%和20%的正常人对照超过此限。3在点滴状银屑病和斑块状银屑病，Mtb和Mk检测率低；4在Mm和Mk，亦有16%～20%的正常人对照超过CV2。
表2 在两个抗体分界值时银屑病患者及正常人检测抗体阳性例数[阳性例数/检查例数(%)] 受检标本
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人结核分支杆菌
海鱼分支杆菌
堪萨斯分支杆菌
CV1
CV2
CV1
CV2
CV1
CV2
寻常型
28/28(100)
, 百拇医药
26/28(92.9)
30/30(100)
26/30(86.7)
30/30(100)
26/30(86.7)
点滴状
9/11(81.8)
6/11(54.5)
11/11(90.9)
10/11(90.9)
10/11(90.9)
, 百拇医药
8/11(72.7)
斑块状
9/10
7/10
10/10
10/10
9/10
6/10
红皮病型
7/7
7/7
7/7
7/7
, 百拇医药
7/7
6/7
脓胞型
5/5
4/5
4/5
4/5
5/5
5/5
银屑病合计
58/61(95.1)
50/61(82.0)
63(100)
, 百拇医药
57(90.5)
61(96.8)
51(81.0)
正常人对照
14/29(48.3)
1/29(3.4)
11/30(36.7)
5/30(16.7)
11/30(36.7)
6/30(20.0)
注：寻常型银屑病包括点滴状银屑病和斑块状银屑病.CV1=正常对照之；CV2=正常对照之×2.1值，括号内数字为百分数率
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表3列出在银屑病和正常人对照用ELISA评价3种抗原检测结果的差异性和个体符合率结果。从表3可见：1除Mm与Mk在银屑病显示检测结果有显著差异外，其余的均显示无显著性差异；2在点滴状银屑病和斑块状银屑病：Mm与Mk和Mtb与Mk的个体符合率明显偏低，从而在银屑病也显偏低，而Mm与 Mtb无论在哪种银屑病均有很高的个体符合率，特别在红皮病型银屑病和脓疱型银屑病。
表3 银屑病患者及正常人ELISA检测结果差异性的显著检验 抗原匹配
寻常型银屑病
点滴状银屑病
斑块状银屑病
红皮病型银屑病
脓胞型银屑病
银屑病合计
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正常人对照
P值
A
P值
A
P值
A
P值
A
P值
A
P值
A
P值
, 百拇医药
A
Mm与Mk
>0.1
80.0
>0.1
63.6
>0.2
60.0
>0.99
85.7
>0.99
80.0
<0.02
, 百拇医药
73.0
>0.1
86.6
Mm与Mtb
>0.1
85.7
>0.99
81.8
>0.5
70.0
>0.99
100.0
>0.99
, http://www.100md.com
100.0
>0.99
85.2
>0.1
79.3
Mtb与Mk
>0.3
75.0
>0.99
45.5
>0.99
70.0
>0.99
, 百拇医药
85.0
>0.99
80.0
>0.1
68.8
>0.3
82.7
注：Mm：海鱼分支杆菌；Mk：堪萨斯分支杆菌；Mtb：人结核分支杆菌；A：个体符合率；*：包括点滴状银屑病和斑块状银屑病
三、讨论
我们报道了用Mtb/ELISA、Mm/ELISA和Mk/ELISA 3种方法检测银屑病和正常人对照血清中抗Mtb、Mm、和Mk 3种致病分支杆菌的抗体水平(以下简称APM-Ab)，结果显示，银屑病与正常人对照间抗体含量有清晰的分界线。银屑病患者有很高的APM-Ab，且阳性率高达80%～90%，正常人对照阳性率约为3%～20%。银屑病患者的阳性率明显高于正常人对照，提示银屑病患者血清中存在APM-Ab。
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(一)选择致病分支杆菌做抗原的设想： 我们之所以选择3种致病分支杆菌(Mtb、Mm、Mk)做抗原主要受启于以下几点：1有人报道许多微生物如链球菌、葡萄球菌、糠秕孢子菌等与银屑病有关，特别是A族溶血性链球菌超抗原与点滴状银屑病相关已被广泛接受[2]；2当代研究倾向于银屑病是一种与免疫(含自身免疫)有关的疾病，而有人认为慢生长分支杆菌可能有作用[3]；3我们以往研究表明分支杆菌之间存在交叉反应抗体[1]，分支杆菌与人表皮抗原间有相似性[4]。基于上述，我们拟定先从3种致病分支杆菌入手进行探索。
(二)对研究结果的分析和解释： 实验结果表明，银屑病患者血清和正常人对照血清中均含有一定量的APM-Ab(表1)。1虽然有相当比例的银屑病患者和正常人对照均显示有APM-Ab(表1), 但当提高分界值时银屑病患者和正常人对照之间的阳性率最少相差60%～70%(表2)；2虽然正常人对照有的A值超过分界值，但80%以上的正常人对照 A值低于分界值(表2)，而在银屑病患者80%以上A值比分界值高，>0.6，且患者与正常人平均抗体水平之比>2.2～3.57(表1)；3虽然分型(类)后的病例偏少，但综合比较时病例数较多；4本实验方法的间接酶联免疫吸附试验是定量性的试验。据上分析，我们认为在银屑病患者血清中存在抗Mtb、Mm和Mk抗体。其意义尚待进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
1 吴勤学，魏万惠，刘琦，等. 用Ms-ELISA检测麻风病人血清抗体水平. 中国医学科学院学报，1988, 10:451-455.
2 Rosenberg EW, Noah PW, Skinner RB, et al. Microorganisms and psoriasis. J Natl Med Assoc, 1994, 86:305-310.
3 Rook GAW, Stanford TL. Slow bacterial infetions or autoimmunity? Immunol Today, 1992, 13:160-164.
4 Van den Akker THW, Naafs B, Kolk AHJ, et al. Similarity between mycobacterial and human epidermal antigens. Br J Dermatol, 1992, 127:352-358.
(收稿：1998-03-26 修回：1998-11-02), 百拇医药
单位：210042 南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所
关键词：
中华皮肤科杂志990221 银屑病至今病因不明。有关其病因学的报道很多，迄今为止，大多报道倾向于银屑病是一种有遗传背景的与免疫有关的疾病，特别是A族溶血性链球菌超抗原与点滴状银屑病有关的观点已被大多数人所接受。以往大多报道链球菌、葡萄球菌和糠秕孢子菌等与银屑病的相关性，而分支杆菌与银屑病的关系尚缺乏报道。现将近年来我们的有关研究报道如下。
一、材料和方法
(一)待检标本：银屑病患者63例(寻常型51例，红皮病型7例，脓疱型5例)，均为我所门诊和病房患者，除1例为78岁外，其余者为12～55岁。采静脉血，分离血清后分装，-20℃备用。正常人对照血清(30份)取自我所常规体检工作人员和由甘肃地方病研究所提供，年龄为13～58岁，X线胸片正常。
, 百拇医药
(二)分支杆菌整菌抗原的制做及包被：
1.菌株及来源：人结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb,H37Rv)引自南京市胸科医院，堪萨斯分支杆菌(Mycobacterium kansasii,Mk)和海鱼分支杆菌(Mycobacterium marinum, Mm)均引自法国巴斯德研究所。
2.整分支杆菌抗原的制备：将上述各待试菌培养在改良罗氏培养基(Lowenstein-Jensen medium)上，Mtb和Mk于37℃孵育，Mm于33℃孵育，待菌落丰富时于无菌操作条件下用白金耳将之刮下和在玻璃研磨器中研磨以分散菌团，高压灭菌后，低速离心除去未分散之菌，取上清液按吸光度值(A值)调整菌悬液浓度，并用标准阳性血清标化其包被浓度。
3.抗原的包被：将标化的上述各分支杆菌抗原，按0.1mL/孔包被于40孔聚苯乙烯微量滴盘，37℃存放使去掉挥发缓冲液至干，待用。
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(三)间接酶联免疫吸附试验(ELISA)[1]：程序简述如下：1将已包被整菌抗原的微量滴盘用pH7.4 PBS/吐温20泡30min，再用PBS/吐温20 冲洗3次；2按0.2mL/孔，加5%脱脂奶粉(SM)封闭，37℃×30min；3加以2.5%SM-PBS 做1:200稀释的待试血清0.1mL于每孔，37℃×60min；4以PBS/吐温20冲洗3次后加以2.5%SM-PBS 做1:2000稀释的HRP-羊抗人IgA、IgG、IgM, 37℃×30min；5以PBS/吐温20冲洗3次，加底物和显色剂(OPD/H2O2)，37℃×30min；6以2.5N H2SO4中止反应，于波长490nm处测A值。实验设阳性及阴性对照，用空白校零点。
(四)统计学处理：取平均A值(
)=标准差(s)表示A总体均数水平和个体离散度，用Walters公式设定分界值和用卡方检验各抗原间检测结果是否有差异。, 百拇医药
二、结果
从表1可见：1在受检的各型银屑病患者均显示血清抗Mtb、Mm和Mk抗体，从银屑病总体平均值(x)看Mm(1.20)>Mtb(1.06)>Mk(0.83)；2在正常人对照血清也显示有一定量的抗体，从总体平均值看Mm(0.42)>Mtb(0.39)>Mk(0.28)；3在3种分支杆菌，全部银屑病血清抗体水平与正常人之比>2.1倍，受检的各型银屑病患者血清抗体水平亦显示同样的规律；4在红皮病型银屑病，3种抗原都显示相当高的抗体水平和高的P/N；5在Mm，各型(类)银屑病均显示高抗体水平；6在点滴状和脓疱型银屑病，Mtb、Mk的抗体水平偏低；7在正常人对照亦显示有一定的抗体水平。
表1 银屑病患者及正常人血清中抗3种致病分支杆菌的抗体水平 受检标准
例数
人结核分支杆菌
, 百拇医药
海鱼分支杆菌
堪萨斯分支杆菌
±sP/N
±sP/N
±sP/N
寻常型银屑病
30
1.15±0.31
2.90
, 百拇医药
1.18±0.21
2.81
0.85±0.33
3.00
点滴状银屑病
11
0.85±0.35
2.20
1.16±0.25
2.76
0.70±0.35
2.50
, 百拇医药
斑块状银屑病
10
0.96±0.31
2.46
1.14±0.20
2.71
1.00±0.42
3.57
红皮病型银屑病
7
1.10±0.22
2.82
, 百拇医药 1.37±0.11
3.26
0.87±0.32
3.11
脓胞型银屑病
5
0.85±0.35
2.20
1.16±0.25
2.76
0.70±0.35
2.50
银屑病合计
, 百拇医药
63
1.06±0.34
2.70
1.20±0.24
2.86
0.83±0.35
2.96
正常人对照
30
0.39±0.29
-
0.42±0.62
-
, 百拇医药
0.28±0.27
-
注：寻常型银屑病包括点滴状银屑病和斑块状银屑病.P/N为患者与正常人平均水平之比；*检测28例，**检测29例
表2列出在银屑病和正常人对照测定抗Mtb、Mm和Mk抗体的定量分析结果。从表可见：1在分界值CV1(为正常人对照的平均A值)，几乎所有被检银屑病患者的血清抗体水平均高于此限，特别在Mm,100%的受检银屑病患者血清抗体含量超过此限，但在对应的正常人对照，亦有1/3～1/2超过此限；2在CV2(为正常人对照平均A值的2.1倍)，在Mtb则仅3.4%的正常人对照超过此限，在Mm和Mk仍有16.7%和20%的正常人对照超过此限。3在点滴状银屑病和斑块状银屑病，Mtb和Mk检测率低；4在Mm和Mk，亦有16%～20%的正常人对照超过CV2。
表2 在两个抗体分界值时银屑病患者及正常人检测抗体阳性例数[阳性例数/检查例数(%)] 受检标本
, http://www.100md.com
人结核分支杆菌
海鱼分支杆菌
堪萨斯分支杆菌
CV1
CV2
CV1
CV2
CV1
CV2
寻常型
28/28(100)
, 百拇医药
26/28(92.9)
30/30(100)
26/30(86.7)
30/30(100)
26/30(86.7)
点滴状
9/11(81.8)
6/11(54.5)
11/11(90.9)
10/11(90.9)
10/11(90.9)
, 百拇医药
8/11(72.7)
斑块状
9/10
7/10
10/10
10/10
9/10
6/10
红皮病型
7/7
7/7
7/7
7/7
, 百拇医药
7/7
6/7
脓胞型
5/5
4/5
4/5
4/5
5/5
5/5
银屑病合计
58/61(95.1)
50/61(82.0)
63(100)
, 百拇医药
57(90.5)
61(96.8)
51(81.0)
正常人对照
14/29(48.3)
1/29(3.4)
11/30(36.7)
5/30(16.7)
11/30(36.7)
6/30(20.0)
注：寻常型银屑病包括点滴状银屑病和斑块状银屑病.CV1=正常对照之
；CV2=正常对照之×2.1值，括号内数字为百分数率, http://www.100md.com
表3列出在银屑病和正常人对照用ELISA评价3种抗原检测结果的差异性和个体符合率结果。从表3可见：1除Mm与Mk在银屑病显示检测结果有显著差异外，其余的均显示无显著性差异；2在点滴状银屑病和斑块状银屑病：Mm与Mk和Mtb与Mk的个体符合率明显偏低，从而在银屑病也显偏低，而Mm与 Mtb无论在哪种银屑病均有很高的个体符合率，特别在红皮病型银屑病和脓疱型银屑病。
表3 银屑病患者及正常人ELISA检测结果差异性的显著检验 抗原匹配
寻常型银屑病
点滴状银屑病
斑块状银屑病
红皮病型银屑病
脓胞型银屑病
银屑病合计
, http://www.100md.com
正常人对照
P值
A
P值
A
P值
A
P值
A
P值
A
P值
A
P值
, 百拇医药
A
Mm与Mk
>0.1
80.0
>0.1
63.6
>0.2
60.0
>0.99
85.7
>0.99
80.0
<0.02
, 百拇医药
73.0
>0.1
86.6
Mm与Mtb
>0.1
85.7
>0.99
81.8
>0.5
70.0
>0.99
100.0
>0.99
, http://www.100md.com
100.0
>0.99
85.2
>0.1
79.3
Mtb与Mk
>0.3
75.0
>0.99
45.5
>0.99
70.0
>0.99
, 百拇医药
85.0
>0.99
80.0
>0.1
68.8
>0.3
82.7
注：Mm：海鱼分支杆菌；Mk：堪萨斯分支杆菌；Mtb：人结核分支杆菌；A：个体符合率；*：包括点滴状银屑病和斑块状银屑病
三、讨论
我们报道了用Mtb/ELISA、Mm/ELISA和Mk/ELISA 3种方法检测银屑病和正常人对照血清中抗Mtb、Mm、和Mk 3种致病分支杆菌的抗体水平(以下简称APM-Ab)，结果显示，银屑病与正常人对照间抗体含量有清晰的分界线。银屑病患者有很高的APM-Ab，且阳性率高达80%～90%，正常人对照阳性率约为3%～20%。银屑病患者的阳性率明显高于正常人对照，提示银屑病患者血清中存在APM-Ab。
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(一)选择致病分支杆菌做抗原的设想： 我们之所以选择3种致病分支杆菌(Mtb、Mm、Mk)做抗原主要受启于以下几点：1有人报道许多微生物如链球菌、葡萄球菌、糠秕孢子菌等与银屑病有关，特别是A族溶血性链球菌超抗原与点滴状银屑病相关已被广泛接受[2]；2当代研究倾向于银屑病是一种与免疫(含自身免疫)有关的疾病，而有人认为慢生长分支杆菌可能有作用[3]；3我们以往研究表明分支杆菌之间存在交叉反应抗体[1]，分支杆菌与人表皮抗原间有相似性[4]。基于上述，我们拟定先从3种致病分支杆菌入手进行探索。
(二)对研究结果的分析和解释： 实验结果表明，银屑病患者血清和正常人对照血清中均含有一定量的APM-Ab(表1)。1虽然有相当比例的银屑病患者和正常人对照均显示有APM-Ab(表1), 但当提高分界值时银屑病患者和正常人对照之间的阳性率最少相差60%～70%(表2)；2虽然正常人对照有的A值超过分界值，但80%以上的正常人对照 A值低于分界值(表2)，而在银屑病患者80%以上A值比分界值高，>0.6，且患者与正常人平均抗体水平之比>2.2～3.57(表1)；3虽然分型(类)后的病例偏少，但综合比较时病例数较多；4本实验方法的间接酶联免疫吸附试验是定量性的试验。据上分析，我们认为在银屑病患者血清中存在抗Mtb、Mm和Mk抗体。其意义尚待进一步研究。
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参考文献
1 吴勤学，魏万惠，刘琦，等. 用Ms-ELISA检测麻风病人血清抗体水平. 中国医学科学院学报，1988, 10:451-455.
2 Rosenberg EW, Noah PW, Skinner RB, et al. Microorganisms and psoriasis. J Natl Med Assoc, 1994, 86:305-310.
3 Rook GAW, Stanford TL. Slow bacterial infetions or autoimmunity? Immunol Today, 1992, 13:160-164.
4 Van den Akker THW, Naafs B, Kolk AHJ, et al. Similarity between mycobacterial and human epidermal antigens. Br J Dermatol, 1992, 127:352-358.
(收稿：1998-03-26 修回：1998-11-02), 百拇医药