解脲支原体第一群的分型研究
作者：孔繁荣 周向昭 马燕燕 朱学骏
单位：孔繁荣，马燕燕，朱学骏 100034北京，北京医科大学第一医院皮肤科，周向昭 张家口医学院附属第一医院皮肤科
关键词：解脲支原体血清分型
中华皮肤科杂志990304
【摘要】目的 利用分子生物学方法对解脲支原体(Ureaplasmaurealyticum,Uu)第一群进行分型，建立简便、可靠的分型方法。方法设计分型引物，用PCR和限制性内切酶消化的方法进行分型。结果 设计了解脲支原体的分型引物UMS51|UMAU1和UMS51|UMAU3，前者扩增出Uu1型和Uu6型，后者扩增出Uu3型和Uu14型。对于Uu1型和Uu6型，用限制性内切酶消化的方法区分。结论 根据MB抗原基因的N端，利用PCR结合限制性内切酶消化的方法可以对解脲支原体第一群进行分型，但不能将Uu3型与Uu14型区分开。
, 百拇医药
Serotyping of Biovar One of Ureaplasma Urealyticum by
Molecular Biological Methods
KONG Fanrong,ZHOU Xiangzhao, Ma Yanyan,et al. Department of Dermatology, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034
【 Abstract】 Objective To set up serotyping methods of Ureaplasma urealyticum by molecular biological techniques. Methods Primers for typing were designed and different serotypes of Ureaplasma urealyticum were identified by PCR and restriction endonuclease digestion. Results PCR primers UMS51, UMAU1 and UMS51,UMAU3 was specific to Uu1,Uu6 and Uu3, Uu14 respecitively. To distinguish Uu1 and Uu6, restriction endonuclease digestion were used. Conclusion By PCR and restriction endonuclease digestion on the basis of DNA sequence of N terminal of multiple banded antigen gene, serovars of biovar one of Uu can be distinguished but Uu3 and Uu14 can not be distinguished.
, 百拇医药
【 Key words】 Ureaplasma urealyticum Serotyping
解脲支原体(Ureaplasmaurealyticum,Uu)分为2个生物群和14个血清型，第1群包括1、3、6、14四个血清型,第2群包括其余10个血清型。人类泌尿生殖道寄居或感染的Uu绝大部分为第1群[1]，其中某些型与疾病有关，所以Uu的分型对疾病的发病机制研究有重要的作用。MB(multiplebanded)抗原是Uu的主要外膜抗原，是Uu感染时被识别的主要抗原[2]。MB抗原基因长1200多个碱基，N端1/3是保守区，C端2/3是可变区。C端的大小可变，而N端在同一生物群各血清型和同一血清型各变异株中长度一致[3]。我们利用MB抗原基因N端，通过PCR扩增结合限制性内切酶消化的方法对Uu第1群进行分型，初步建立了一个特异性强、可靠性好的分型方法。
材料与方法
(一)分群研究:
, 百拇医药
1.标准菌株：Uu1、3、6、8、14血清型标准株由首都儿科研究所细菌室提供。
2.DNA模板的制备：按我科实验室常规进行DNA模板的制备[4]。
3.分群引物：参照Teng等[5]的设计,设计合成了下列引物(由美国Cybersyn公司合成)。①Uu通用引物：UMS125：5′GTATTTGCAATCTTTATATGTTTTCG3′，UMA226：5′CAGCTGATGTAAGTGCAGCATTAAATTTC3′。第1群扩增片段长度为403bp,第2群为448bp。②Uu第1群特异引物：UMS51：5′TGTGGATCCTTCTGGGCTATGACATTAGGTGTTACC3′,UMA427：5′CTCGAATTTCACCTGGTTGTGTAGTTTCAAAGTTCAC3′，第1群扩增片段长度为429bp。第2群不被扩增。
4.PCR扩增：反应体系25μL，10×缓冲液2.5μL,2.5mmol/LdNTP1μL,Taq酶1U(中国科学院遗传研究所),引物UMS,UMA各0.5μL(50pmol/L),DNA模板1μL,超纯水补足25μL；94℃、62℃、72℃各1min,共进行35个循环,最后在72℃延伸5min；扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳在紫外灯上检测。
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(二)分型研究：
1、2同前分群研究中的1、2。
图1Uu通用引物UMS125，UMA226PCR扩增Un1、3、6、8、14型标准株
图2Uu第1群特异引物UMS51，UMA427PCR扩增Un1、3、6、14型标准株
图3分型引物UMS51,UMAU3PCR扩增Un1、3、6、14型标准株
, 百拇医药
图4分型引物UMS51，UMAU1PCR扩增Un1、3、6、14型标准株
图5HinfⅠ酶切Uu1型和Uu6型UMS125，UMA226PCR扩增产物Un1、3、6、14型标准株
3.根据我们对Uu第1群MB抗原基因N端克隆测序[6]结果,设计合成了Uu1、Uu3型分型引物(由美国Cybersyn公司合成)。①Uu1型引物：UMS51：5′ATCCTTCTGGGCTATGACATTAGGTGTTACC3′，UMAU1：5′ATGACCTTTTGTAACTAGAT3′，扩增片段长度为230bp。②Uu3型引物：UMS51：5′TGTGGATCCTTCTGGGCTATGACATTAGGTGTTACC3′，UMAU3：5′CTAAATGACCTTTTTCAAGTGTAC3′，扩增片段长度为230bp。
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4.PCR扩增：同分群研究中的4。
5.限制性内切酶HinfI消化：反应体系20μL，限制性内切酶1U,10X缓冲液2μL,BSA0.2μL,模板DNA10μL,超纯水补足20μL，37℃水浴箱孵育3h，2%琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯上观察。
结果
1.分群结果：①引物UMS125,UMA226PCR扩增Uu第1群4个血清型得到的片段长度为403bp,第2群8型扩增片段长448bp，结果见图1。②引物UMS51、UMA427PCR扩增Uu第1群1、3、6、14血清型得到的片段长度为429bp，结果见图2。
2.分型结果：①引物UMS51、UMAU3PCR扩增第1群4个标准血清型，Uu3型和Uu14型被扩增出230bp的条带，Uu1型和Uu6型未出现条带，结果见图3。②引物UMS51、UMAU1PCR扩增Uu第1群4个标准血清型，Uu1型和Uu6型被扩增出230bp的条带，Uu3型和Uu14型未出现条带，结果见图4。③用HinfI酶切Uu1型和Uu6型UMS125,UMA226PCR扩增产物,Uu1型被切开，得到142bp和261bp的两个片段，Uu6型未被切开，结果见图5。
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讨论
Teng等[5]的研究表明，解脲支原体第1群UMS125、UMA226PCR扩增产物用限制性内切酶HinfI消化，Uu1、3、14型被切开，得到142bp和261bp两个片段，Uu6型不被切开。
我们对1、3、14血清型MB抗原基因UMS51、UMA427的PCR产物克隆测序结果发现，Uu3型与Uu14型N端DNA序列只有3个碱基的差异，而与Uu1型有21个碱基的差异，根据它们DNA序列的不同，我们设计了Uu1、3型的分型引物UMS51、UMAU1和UMS51、UMAU3。其中，UMS51、UMAU3扩增出Uu3型和Uu14型，而UMS51、UMAU1可以扩增出Uu1型和Uu6型。
首先，我们利用UMS51、UMAU3和MS51、UMSU1对标本进行扩增，将Uu3型和Uu14型与Uu1型和Uu6型区分开。对于Uu1型和Uu6型，我们用UMS125、UMA226进行PCR扩增，PCR产物用限制性内切酶HinfI消化，Uu1型被切开，得到142bp和261bp的2个片段，Uu6型不被切开，又将Uu1型和Uu6型区分开。
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DNA克隆测序结果发现，Uu3型和Uu14型MB抗原基因DNA序列只有3处碱基不同，而且它们的酶切结果完全一致，利用MB抗原基因的N端不能将Uu3型和Uu14型分开。因此，我们只设计了Uu3型的特异引物。Zheng等的[7]研究认为此二型的区别可能在MB抗原基因的C端，所以Uu3型和Uu14型的区分需进一步研究。由于我们没有对Uu6型进行克隆测序，未能设计出Uu1型和Uu6型的特异引物，所以要对这二型利用PCR方法进行区分还需进一步的研究。
参考文献
1孔繁荣，朱学骏，周骏马，等.泌尿生殖道解脲脲原体的分群研究.中华流行病学杂志，1995，16(1A):41-42.
2 Watson HL, Blalock DK， Cassell GH. Variable antigens of Ureaplasma urealyticum containing both serovar specific and serovar cross reactive epitopes. Infect Immun， 1990， 58:3679- 3688.
, 百拇医药
3 Zheng X, Teng L J, Watson HL， et al. Small repeating units within the Ureaplasma urealyticum MB antigen gene encode serovar specificity and are associated with antigen size variation. Infect Immun, 1995.63:891- 898.
4 孔繁荣，朱学骏，陈洪，等.聚合酶链反应及组织病理诊断尖锐湿疣的比较研究.中华皮肤科杂志，1993，26:340-342.
5 Teng LJ, Zheng XT, Glass JI， et al. Ureaplasma urealyticum biovar specificity and diversity are encoded in multiple banded antigen gene. J Clin Microbiol, 1994， 32: 1464- 1469.
, http://www.100md.com
6 Blanchard A, Hentschel L, Duffy L， et al. Detection of Ureaplasma urealyticum by polymerase chain reaction in the urogenital tract of adults, in amniotic fluid and in the respiratory tract of newborns. Clin Infect Dis, 1993,17(Suppl): S148- S153.
7 Zheng X, Lau K, Frazier M, et al. Epitope mapping of the variable repetitive region with the MB antigen of Ureaplasma urealyticum. Clin Diagn Lab Immunol, 1996,3: 774- 778.
(收稿：1998-09-28修回：1998-12-18), http://www.100md.com
单位：孔繁荣，马燕燕，朱学骏 100034北京，北京医科大学第一医院皮肤科，周向昭 张家口医学院附属第一医院皮肤科
关键词：解脲支原体血清分型
中华皮肤科杂志990304
【摘要】目的 利用分子生物学方法对解脲支原体(Ureaplasmaurealyticum,Uu)第一群进行分型，建立简便、可靠的分型方法。方法设计分型引物，用PCR和限制性内切酶消化的方法进行分型。结果 设计了解脲支原体的分型引物UMS51|UMAU1和UMS51|UMAU3，前者扩增出Uu1型和Uu6型，后者扩增出Uu3型和Uu14型。对于Uu1型和Uu6型，用限制性内切酶消化的方法区分。结论 根据MB抗原基因的N端，利用PCR结合限制性内切酶消化的方法可以对解脲支原体第一群进行分型，但不能将Uu3型与Uu14型区分开。
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Serotyping of Biovar One of Ureaplasma Urealyticum by
Molecular Biological Methods
KONG Fanrong,ZHOU Xiangzhao, Ma Yanyan,et al. Department of Dermatology, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034
【 Abstract】 Objective To set up serotyping methods of Ureaplasma urealyticum by molecular biological techniques. Methods Primers for typing were designed and different serotypes of Ureaplasma urealyticum were identified by PCR and restriction endonuclease digestion. Results PCR primers UMS51, UMAU1 and UMS51,UMAU3 was specific to Uu1,Uu6 and Uu3, Uu14 respecitively. To distinguish Uu1 and Uu6, restriction endonuclease digestion were used. Conclusion By PCR and restriction endonuclease digestion on the basis of DNA sequence of N terminal of multiple banded antigen gene, serovars of biovar one of Uu can be distinguished but Uu3 and Uu14 can not be distinguished.
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【 Key words】 Ureaplasma urealyticum Serotyping
解脲支原体(Ureaplasmaurealyticum,Uu)分为2个生物群和14个血清型，第1群包括1、3、6、14四个血清型,第2群包括其余10个血清型。人类泌尿生殖道寄居或感染的Uu绝大部分为第1群[1]，其中某些型与疾病有关，所以Uu的分型对疾病的发病机制研究有重要的作用。MB(multiplebanded)抗原是Uu的主要外膜抗原，是Uu感染时被识别的主要抗原[2]。MB抗原基因长1200多个碱基，N端1/3是保守区，C端2/3是可变区。C端的大小可变，而N端在同一生物群各血清型和同一血清型各变异株中长度一致[3]。我们利用MB抗原基因N端，通过PCR扩增结合限制性内切酶消化的方法对Uu第1群进行分型，初步建立了一个特异性强、可靠性好的分型方法。
材料与方法
(一)分群研究:
, 百拇医药
1.标准菌株：Uu1、3、6、8、14血清型标准株由首都儿科研究所细菌室提供。
2.DNA模板的制备：按我科实验室常规进行DNA模板的制备[4]。
3.分群引物：参照Teng等[5]的设计,设计合成了下列引物(由美国Cybersyn公司合成)。①Uu通用引物：UMS125：5′GTATTTGCAATCTTTATATGTTTTCG3′，UMA226：5′CAGCTGATGTAAGTGCAGCATTAAATTTC3′。第1群扩增片段长度为403bp,第2群为448bp。②Uu第1群特异引物：UMS51：5′TGTGGATCCTTCTGGGCTATGACATTAGGTGTTACC3′,UMA427：5′CTCGAATTTCACCTGGTTGTGTAGTTTCAAAGTTCAC3′，第1群扩增片段长度为429bp。第2群不被扩增。
4.PCR扩增：反应体系25μL，10×缓冲液2.5μL,2.5mmol/LdNTP1μL,Taq酶1U(中国科学院遗传研究所),引物UMS,UMA各0.5μL(50pmol/L),DNA模板1μL,超纯水补足25μL；94℃、62℃、72℃各1min,共进行35个循环,最后在72℃延伸5min；扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳在紫外灯上检测。
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(二)分型研究：
1、2同前分群研究中的1、2。
图1Uu通用引物UMS125，UMA226PCR扩增Un1、3、6、8、14型标准株
图2Uu第1群特异引物UMS51，UMA427PCR扩增Un1、3、6、14型标准株
图3分型引物UMS51,UMAU3PCR扩增Un1、3、6、14型标准株
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图4分型引物UMS51，UMAU1PCR扩增Un1、3、6、14型标准株
图5HinfⅠ酶切Uu1型和Uu6型UMS125，UMA226PCR扩增产物Un1、3、6、14型标准株
3.根据我们对Uu第1群MB抗原基因N端克隆测序[6]结果,设计合成了Uu1、Uu3型分型引物(由美国Cybersyn公司合成)。①Uu1型引物：UMS51：5′ATCCTTCTGGGCTATGACATTAGGTGTTACC3′，UMAU1：5′ATGACCTTTTGTAACTAGAT3′，扩增片段长度为230bp。②Uu3型引物：UMS51：5′TGTGGATCCTTCTGGGCTATGACATTAGGTGTTACC3′，UMAU3：5′CTAAATGACCTTTTTCAAGTGTAC3′，扩增片段长度为230bp。
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4.PCR扩增：同分群研究中的4。
5.限制性内切酶HinfI消化：反应体系20μL，限制性内切酶1U,10X缓冲液2μL,BSA0.2μL,模板DNA10μL,超纯水补足20μL，37℃水浴箱孵育3h，2%琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯上观察。
结果
1.分群结果：①引物UMS125,UMA226PCR扩增Uu第1群4个血清型得到的片段长度为403bp,第2群8型扩增片段长448bp，结果见图1。②引物UMS51、UMA427PCR扩增Uu第1群1、3、6、14血清型得到的片段长度为429bp，结果见图2。
2.分型结果：①引物UMS51、UMAU3PCR扩增第1群4个标准血清型，Uu3型和Uu14型被扩增出230bp的条带，Uu1型和Uu6型未出现条带，结果见图3。②引物UMS51、UMAU1PCR扩增Uu第1群4个标准血清型，Uu1型和Uu6型被扩增出230bp的条带，Uu3型和Uu14型未出现条带，结果见图4。③用HinfI酶切Uu1型和Uu6型UMS125,UMA226PCR扩增产物,Uu1型被切开，得到142bp和261bp的两个片段，Uu6型未被切开，结果见图5。
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讨论
Teng等[5]的研究表明，解脲支原体第1群UMS125、UMA226PCR扩增产物用限制性内切酶HinfI消化，Uu1、3、14型被切开，得到142bp和261bp两个片段，Uu6型不被切开。
我们对1、3、14血清型MB抗原基因UMS51、UMA427的PCR产物克隆测序结果发现，Uu3型与Uu14型N端DNA序列只有3个碱基的差异，而与Uu1型有21个碱基的差异，根据它们DNA序列的不同，我们设计了Uu1、3型的分型引物UMS51、UMAU1和UMS51、UMAU3。其中，UMS51、UMAU3扩增出Uu3型和Uu14型，而UMS51、UMAU1可以扩增出Uu1型和Uu6型。
首先，我们利用UMS51、UMAU3和MS51、UMSU1对标本进行扩增，将Uu3型和Uu14型与Uu1型和Uu6型区分开。对于Uu1型和Uu6型，我们用UMS125、UMA226进行PCR扩增，PCR产物用限制性内切酶HinfI消化，Uu1型被切开，得到142bp和261bp的2个片段，Uu6型不被切开，又将Uu1型和Uu6型区分开。
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DNA克隆测序结果发现，Uu3型和Uu14型MB抗原基因DNA序列只有3处碱基不同，而且它们的酶切结果完全一致，利用MB抗原基因的N端不能将Uu3型和Uu14型分开。因此，我们只设计了Uu3型的特异引物。Zheng等的[7]研究认为此二型的区别可能在MB抗原基因的C端，所以Uu3型和Uu14型的区分需进一步研究。由于我们没有对Uu6型进行克隆测序，未能设计出Uu1型和Uu6型的特异引物，所以要对这二型利用PCR方法进行区分还需进一步的研究。
参考文献
1孔繁荣，朱学骏，周骏马，等.泌尿生殖道解脲脲原体的分群研究.中华流行病学杂志，1995，16(1A):41-42.
2 Watson HL, Blalock DK， Cassell GH. Variable antigens of Ureaplasma urealyticum containing both serovar specific and serovar cross reactive epitopes. Infect Immun， 1990， 58:3679- 3688.
, 百拇医药
3 Zheng X, Teng L J, Watson HL， et al. Small repeating units within the Ureaplasma urealyticum MB antigen gene encode serovar specificity and are associated with antigen size variation. Infect Immun, 1995.63:891- 898.
4 孔繁荣，朱学骏，陈洪，等.聚合酶链反应及组织病理诊断尖锐湿疣的比较研究.中华皮肤科杂志，1993，26:340-342.
5 Teng LJ, Zheng XT, Glass JI， et al. Ureaplasma urealyticum biovar specificity and diversity are encoded in multiple banded antigen gene. J Clin Microbiol, 1994， 32: 1464- 1469.
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6 Blanchard A, Hentschel L, Duffy L， et al. Detection of Ureaplasma urealyticum by polymerase chain reaction in the urogenital tract of adults, in amniotic fluid and in the respiratory tract of newborns. Clin Infect Dis, 1993,17(Suppl): S148- S153.
7 Zheng X, Lau K, Frazier M, et al. Epitope mapping of the variable repetitive region with the MB antigen of Ureaplasma urealyticum. Clin Diagn Lab Immunol, 1996,3: 774- 778.
(收稿：1998-09-28修回：1998-12-18), http://www.100md.com