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编号:10275988
某些致病真菌的聚合酶链反应检测
http://www.100md.com 《中华皮肤科杂志》 1999年第6期
     作者:朴英兰 李冬梅 王文莉 李若瑜 王端礼

    单位:李冬梅 王文莉 李若瑜 王端礼 北京医科大学第一医院皮肤科;朴英兰现在上海铁道大学医学院甘泉医院皮肤科,200065

    关键词:

    中华皮肤科杂志/990615

    分子生物学技术的发展为深部真菌感染的诊断提供了新的手段。我们建立一种比其它常规方法更为快速、稳定的体系,以协助临床的早期诊断和治疗。

    一、材料和方法

    (一)实验菌株:共收集临床株56株,包括白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、光滑念珠菌、乳酒念珠菌、毛孢子菌和新生隐球菌。另外,ATCC模式株7株。烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉及构巢曲霉各1株。外瓶霉4株。均为北京医科大学真菌研究中心保存菌株。对照包括金黄色葡萄球菌,溶血性链球菌,绿脓杆菌,支原体和4份健康人血DNA标本。
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    (二)模板DNA的制备:①酵母菌DNA制备:首先于10mL酵母浸膏培养液基中接种一个事先在平皿上培养48h的单菌落,37℃温室中振荡培养48h,再用微波法提取酵母菌DNA[1]。②临床标本DNA提取:1mL血+混合物1mL离心2min,弃上清液加1mL0.05mol/LTrispH7.50.01mol/LMgCl2,2min离心,重复2次。弃上清液加入DNaseI缓冲液300~500μL。37℃孵育15min。加300μL0.01mol/LEDTA,85℃30min。2min13000r/min离心,弃上清液。然后用微波法提取酵母菌的DNA。曲霉和外瓶霉DNA采用氯化苄法提取[2]

    (三)细胞色素P450L1A1基因序列引物:14406CATAACTCAATATGGCTATT,14407CTTTTGACGACATGATTCGA,DHATGGGTGGTCAACATACTTC,1558TACATCTATGTCTACCACC,ITSⅠ区引物ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGG,ITS2GCTGCGTTCTT
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    CATCGATGC。

    (四)目的片段PCR扩增:PCR反应体积为25μL,反应程序为95℃3min→95℃1min→55℃1min→72℃1min(35个循环)→72℃3min。然后取反应产物10μL在2%琼脂糖凝胶电泳上分析,照像。

    二、结果

    (一)真菌通用引物(ITS1 ITS2):应用ITS内转录间隔区通用引物,我们从所有受试真菌DNA中均获得阳性PCR扩增产物,出现预期的148bp~478bp唯一条带。见图1。

    上图1~4为曲霉,5~8为外瓶霉。下图1~8为白念珠菌,M为标记

    图1 真菌通用引物ITS1 ITS2
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    (二)应用DH-1558念珠菌属特异引物:根据实验中的摸索其扩增产物出现多条非特异性条带,未能达到预期目的。

    (三)应用14406/14407白念珠菌特异性引物:经PCR扩增白念珠菌均出现243bp的特异带,见图2。另外,在相同条件下,近平滑念珠菌2条带,季也蒙念珠菌2~4条带,热带念珠菌2条带,克柔念珠菌与新生隐球菌均出现1条特别弱的带。但白念珠菌的带型明显有别于其它念珠菌,使念珠菌种特异性引物首先能鉴别出临床发病率最高的白念珠菌。

    1~5白念珠菌,6~8近平滑念珠菌,M为标记

    图2 细胞色素P450L1A1白念珠菌特异性引物14406/14407

    (四)血标本的检测:采用撒菌方法,血液来自健康志愿者,白念珠菌倍比稀释(106~101个菌)后加入血液中,DNA提取所需时间约6h左右,经PCR扩增出现与预期结果相同的条带。在血液中60~70cfu/mL即可出现阳性结果。阴性对照株应用上述引物PCR扩增结果均为阴性。
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    三、讨论

    有文献报道选用编码rRNA基因的可变区设计引物,扩增ITS2区,我们亦选用ITS为扩增片段,用ITS1、ITS2为通用引物,与基因数据库的有关序列进行比较,所有菌株均扩增出1条清晰的DNA带型,片段为150~480bp之间,与预期结果一致。在扩增时引物浓度也尤为重要,ITS1∶ITS2=50/(1~2.5)pmol/μL时条带才会出现,否则其PCR结果检测不稳定。

    我们根据Buchman等[3,4]1994年报道,从中选择了细胞色素P450L1A1基因片段DH-1558为属通用引物,同时与啤酒酵母、白念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌P450L1A1基因序列相比较:用引物分析软件分析这对引物发现,在上游引物间有一发夹结构,在下游引物的3′端亦有一发夹结构,去除了下游引物3′端的两个碱基AC后,发夹结构就消失了。与光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、酿酒酵母比较,引物在其它位置均有不同程度的错配。由于其结构的复杂性,扩增产物出现较多条带,摸索多种不同浓度的比例仍未能扩增出预期所需条带。
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    卫生部部属院校临床学科重点项目资助课题

    参考文献

    1 Goodwin DC, Lee SB.Microwave miniprep of total genomic DNA from fungi,plant,protists and animals for PCR. Biotechniques,1993, 15:438.

    2 Zhu H, Jun F, Zhu LH. Isolation of genomic DNA from plant, fungi and bacteriol using benzyl chloride. Nucl Acid Res,1993, 21:5279.

    3 Vernon FK, Connie WW, Thomas GT, et al. Primary structure of the P450 lanosterol demethylase gene from Saccharomyces cerevisiae. DNA,1997,6:529- 537.

    4 Chen C, Vemon FK, Thomas GT, et al. Primary structure of the cytochrome P450 lanosterol 14α demethylase gene from Candida tropicalis. DNA,1998, 7: 617-627.

    (收稿:1999-01-29修回:1999-05-07), http://www.100md.com