银屑病郎格汉斯细胞与降钙素基因相关肽相互关系初探
作者：何焱玲 丁桂凤 张波 黄大无 王宪 朱铁君 范少光
单位：何焱玲( 朱铁君(100044 北京医科大学人民医院皮肤科)；黄大无 丁桂凤(北京医科大学免疫学系)；张波(北京医科大学分子肿瘤室)；王宪(北京医科大学心血管研究所)；范少光(北京医科大学生理学系)
关键词：
中华皮肤科杂志000212
神经系统与皮肤免疫系统之间的相互作用已引起关注[1]，作为皮肤重要神经递质的降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptid,CGRP)与表皮和真皮内的多种靶细胞接触，可直接影响角质形成细胞、郎格汉斯细胞、微血管内皮细胞的功能，尤其是与表皮树枝状细胞-郎格汉斯细胞的接触，可能调节皮肤的免疫系统，影响免疫细胞的活化及细胞因子的释放。为探讨CGRP与银屑病郎格汉斯细胞的关系，我们用免疫组化法研究证明CGRP存在于银屑病表皮树枝状细胞上，本实验进一步用双相间接免疫荧光染色及激光共聚焦扫描观察，同时利用RNA探针原位杂交技术研究，获得了有意义的结果。
, 百拇医药
一、材料和方法
(一)材料：
1.病例：选择寻常型银屑病12例(经临床和组织病理确诊)，男8例，女4例；年龄22～65岁，病程2～32年。取背及四肢伸侧肥厚斑块型皮损。并以8例正常人的皮肤组织作对照。
2.试剂与仪器：兔抗人CGRP抗体(美国半岛公司)，鼠抗人CD1amAb(NA1/34,IgG2a,丹麦Dako公司)，PE标记抗鼠IgG抗体(PE-αMIgG抗体，北京医科大学免疫系)，FITC标记抗兔IgG抗体(FITC-αRIgG抗体，军事医学科学院)。
CGRPcDNA质粒pBKSⅡ-Exon5(由北京医科大学王宪教授惠赠，来自美国JoYeokley教授)，限制性内切酶XhoⅠ(宝泰克公司)，地戈辛标记NTP(Dig-NTP)，抗地戈辛-AP(抗Dig-AP)和NBT-BCIP(德国宝灵曼公司)，T7和T3RNA聚合酶(Gibco公司)，内切酶XbaⅠ(鼎国生物公司)，杂交液Hyb(ssDNA、DTT、Denhardt、SSC、10%葡聚糖硫酸酯、甲酰胺)。激光共聚焦扫描显微镜(TCSNT型，德国Leica公司)，DMRIXA显微镜和荧光显微镜(德国Leica公司),Olympus显微镜(日本)。
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(二)方法：
1.双相间接免疫荧光染色及激光共聚焦扫描观察：取银屑病斑块型皮损及正常皮肤组织新鲜标本，OCT包埋冰冻切片(厚5μm)，经丙酮固定10min后PBS清洗。加第一抗体，先用鼠抗人CD1amAb(1∶100)，37℃孵育60min,PBS清洗，加兔抗人CGRP抗体(1∶100)37℃孵育60min,PBS清洗；再加第二抗体，先用PE标记抗鼠IgG抗体(1∶20)，37℃孵育60min,PBS清洗，后加FITC标记抗兔IgG抗体(1∶10)，37℃孵育60min,PBS清洗，缓冲甘油封片，在荧光显微镜及激光共聚焦扫描显微镜下观察。并以PBS和正常兔血清代替一抗作阴性对照，以鼠脊神经节细胞作阳性对照。
2.CGRP原位杂交：
(1)制备CGRP的RNA探针：取CGRP质粒pBKSⅡ-Exon5(3.2kb，含165bp的CGRP核苷酸系列)加入限制性内切酶XhoⅠ，经37℃孵育酶切使质粒线性化，用Tris酚∶氯仿/异戊醇提取，乙醇沉淀及水重悬回收，以线性CGRPcDNA作为模板，转录RNA，加入地戈辛标记NTP缓冲液(含Dig-NTP)和T7RNA聚合酶，混合后在37℃孵育2～3h，利用T7启动子从5′端合成反向地戈辛标记CGRP单链RNA探针，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定探针标记完成。另外，用内切酶XbaⅠ在CGRPcDNA的另一端切开质粒，用T3RNA聚合酶，从3′端合成正向CGRP单链RNA探针做对照。
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(2)组织切片原位杂交：寻常型银屑病斑块型皮损10%中性福尔马林固定，石蜡包埋切片，并将CGRP免疫组化阳性的皮损石蜡连续切片，常规脱蜡水化，0.05%TritonX-100室温孵育10min，用1∶200蛋白酶K37℃消化20min，4%多聚甲醛固定，90%冰乙醇脱水。将杂交液Hyb与反向CGRP探针预处理，80℃加热10min，把含探针的杂交液加入组织切片，置42℃孵育16～22h，杂交后用50%甲酰胺SSC液在50℃洗2次各20min，马血清(1∶100)封闭，37℃孵育30min，加抗Dig-Ap(1∶500)，37℃孵育60min，缓冲液Ⅰ洗3次各5min，缓冲液Ⅲ洗15min，NBT-BCIP染色，缓冲甘油封片，显微镜下观察。以脊神经节的神经细胞为阳性对照，无探针杂交液Hyb和PBS作阴性对照，并用正向CGRP单链RNA探针同时对照。
二、结果
1.双相间接免疫荧光染色及激光共聚焦扫描观察：在激光共聚焦扫描显微镜下可见，银屑病斑块型皮损增厚的表皮内，CD1a+的郎格汉斯细胞与PE-αMIgG抗体结合发红色荧光，同时其表面有CGRP与FITC-αRIgG抗体结合发绿色荧光，两种荧光信号同时在一个细胞上发出，经计算机处理显示呈黄棕色，说明CGRP阳性的细胞为CD1a+的郎格汉斯细胞。经4个断层的光切扫描此双阳性细胞，可见CGRP和CD1a+都分布于郎格汉斯细胞的膜表面，A、B两个外层光切面显示细胞膜表面的双阳性信号；C、D两个深层光切面则显示细胞浆内呈阴性，而细胞膜的阳性信号在边缘呈环状。正常皮肤组织及阴性对照未见此双阳性细胞。
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2.CGRP原位杂交：寻常型银屑病斑块型(静止期)皮损组织石蜡连续切片，经反向CGRP的RNA探针原位杂交可见，皮损增厚的表皮树枝状细胞内CGRP的mRNA表达(图1)，而PBS和无探针杂交液Hyb阴性对照则未见阳性表达，同时连续切片的银屑病皮损组织用正向CGRP探针作对照，同步进行原位杂交，也未见阳性表达。
图1 银屑病皮表皮郎格汉斯细胞CGRP mRNA表达(×60)
三、讨论
郎格汉斯细胞是表皮重要的免疫细胞，携带MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子，属于抗原呈递细胞,也是表皮唯一表达CD1a+抗原的细胞[2]。由于皮肤感觉神经末梢CGRP反应阳性神经纤维，可从真皮突触伸出穿过基底膜进入表皮内，释放神经递质-CGRP作用于表皮细胞[3]。因此，CGRP与表皮细胞，尤其是郎格汉斯细胞的相互关系，反映了皮肤神经系统与免疫系统之间的相互作用。我们以往的研究表明，寻常型银屑病斑块型皮损内CGRP的含量显著高于正常，而且免疫组化显示CGRP表达于表皮的树枝状细胞。为鉴别这种CGRP阳性树枝状细胞的性质，本实验用CGRP和CD1a抗体作用于银屑病斑块型皮损组织，并用PE-αMIgG和FITC-αRIgG抗体进行双相免疫荧光染色，通过激光共聚焦扫描显微镜观察，CGRP存在于表皮CD1a+郎格汉斯细胞上，经断层光切扫描此阳性细胞显示，CD1a+和CGRP都存在于郎格汉斯细胞膜表面，表明寻常型银屑病斑块型皮损内神经肽CGRP与表皮郎格汉斯细胞密切接触，这种接触可能与CGRP受体的介导有关。
, 百拇医药
为进一步明确银屑病皮损表皮郎格汉斯细胞表面CGRP的来源，本实验用反向CGRP的RNA探针作用于银屑病斑块型皮损组织，进行原位杂交研究，发现在表皮郎格汉斯细胞有CGRPmRNA的表达。以前我们的免疫组化研究也证明，郎格汉斯细胞上有CGRP的阳性表达。但是，以双相免疫荧光染色及激光共聚焦扫描显微镜观察表皮郎格汉斯细胞不同断面发现，CGRP存在于细胞膜，胞浆内未见阳性着色。对这一结果的原因还不完全清楚。是否可能郎格汉斯细胞CGRPmRNA的表达量很少，CGRP形成后很快被运往表面，以自分泌/旁分泌的形式发挥作用，还有待我们进一步的研究。
参 考 文 献
1.Schelzen T, Armstrong CA, Bunnett NW, et al. Neuropeptides in the skin: interaction between the neuroendocrine and the skin immune system.Exp Dermatol, 1998,7:81- 96 .
, http://www.100md.com
2.Prignano F. Immunophenotype analysis of normal human dendritic cells isolated from epidermis and dermis. Int J Dermatol, 1998,37:116- 119 .
3.Hosoi J, Murphy GF, Egan CL, et al. Regulation of Langerhans cell function by nerves containing calcitonin gene- related peptide. Nature, 1993,363:159- 163.
收稿日期：1999-01-11, 百拇医药
单位：何焱玲( 朱铁君(100044 北京医科大学人民医院皮肤科)；黄大无 丁桂凤(北京医科大学免疫学系)；张波(北京医科大学分子肿瘤室)；王宪(北京医科大学心血管研究所)；范少光(北京医科大学生理学系)
关键词：
中华皮肤科杂志000212
神经系统与皮肤免疫系统之间的相互作用已引起关注[1]，作为皮肤重要神经递质的降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptid,CGRP)与表皮和真皮内的多种靶细胞接触，可直接影响角质形成细胞、郎格汉斯细胞、微血管内皮细胞的功能，尤其是与表皮树枝状细胞-郎格汉斯细胞的接触，可能调节皮肤的免疫系统，影响免疫细胞的活化及细胞因子的释放。为探讨CGRP与银屑病郎格汉斯细胞的关系，我们用免疫组化法研究证明CGRP存在于银屑病表皮树枝状细胞上，本实验进一步用双相间接免疫荧光染色及激光共聚焦扫描观察，同时利用RNA探针原位杂交技术研究，获得了有意义的结果。
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一、材料和方法
(一)材料：
1.病例：选择寻常型银屑病12例(经临床和组织病理确诊)，男8例，女4例；年龄22～65岁，病程2～32年。取背及四肢伸侧肥厚斑块型皮损。并以8例正常人的皮肤组织作对照。
2.试剂与仪器：兔抗人CGRP抗体(美国半岛公司)，鼠抗人CD1amAb(NA1/34,IgG2a,丹麦Dako公司)，PE标记抗鼠IgG抗体(PE-αMIgG抗体，北京医科大学免疫系)，FITC标记抗兔IgG抗体(FITC-αRIgG抗体，军事医学科学院)。
CGRPcDNA质粒pBKSⅡ-Exon5(由北京医科大学王宪教授惠赠，来自美国JoYeokley教授)，限制性内切酶XhoⅠ(宝泰克公司)，地戈辛标记NTP(Dig-NTP)，抗地戈辛-AP(抗Dig-AP)和NBT-BCIP(德国宝灵曼公司)，T7和T3RNA聚合酶(Gibco公司)，内切酶XbaⅠ(鼎国生物公司)，杂交液Hyb(ssDNA、DTT、Denhardt、SSC、10%葡聚糖硫酸酯、甲酰胺)。激光共聚焦扫描显微镜(TCSNT型，德国Leica公司)，DMRIXA显微镜和荧光显微镜(德国Leica公司),Olympus显微镜(日本)。
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(二)方法：
1.双相间接免疫荧光染色及激光共聚焦扫描观察：取银屑病斑块型皮损及正常皮肤组织新鲜标本，OCT包埋冰冻切片(厚5μm)，经丙酮固定10min后PBS清洗。加第一抗体，先用鼠抗人CD1amAb(1∶100)，37℃孵育60min,PBS清洗，加兔抗人CGRP抗体(1∶100)37℃孵育60min,PBS清洗；再加第二抗体，先用PE标记抗鼠IgG抗体(1∶20)，37℃孵育60min,PBS清洗，后加FITC标记抗兔IgG抗体(1∶10)，37℃孵育60min,PBS清洗，缓冲甘油封片，在荧光显微镜及激光共聚焦扫描显微镜下观察。并以PBS和正常兔血清代替一抗作阴性对照，以鼠脊神经节细胞作阳性对照。
2.CGRP原位杂交：
(1)制备CGRP的RNA探针：取CGRP质粒pBKSⅡ-Exon5(3.2kb，含165bp的CGRP核苷酸系列)加入限制性内切酶XhoⅠ，经37℃孵育酶切使质粒线性化，用Tris酚∶氯仿/异戊醇提取，乙醇沉淀及水重悬回收，以线性CGRPcDNA作为模板，转录RNA，加入地戈辛标记NTP缓冲液(含Dig-NTP)和T7RNA聚合酶，混合后在37℃孵育2～3h，利用T7启动子从5′端合成反向地戈辛标记CGRP单链RNA探针，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定探针标记完成。另外，用内切酶XbaⅠ在CGRPcDNA的另一端切开质粒，用T3RNA聚合酶，从3′端合成正向CGRP单链RNA探针做对照。
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(2)组织切片原位杂交：寻常型银屑病斑块型皮损10%中性福尔马林固定，石蜡包埋切片，并将CGRP免疫组化阳性的皮损石蜡连续切片，常规脱蜡水化，0.05%TritonX-100室温孵育10min，用1∶200蛋白酶K37℃消化20min，4%多聚甲醛固定，90%冰乙醇脱水。将杂交液Hyb与反向CGRP探针预处理，80℃加热10min，把含探针的杂交液加入组织切片，置42℃孵育16～22h，杂交后用50%甲酰胺SSC液在50℃洗2次各20min，马血清(1∶100)封闭，37℃孵育30min，加抗Dig-Ap(1∶500)，37℃孵育60min，缓冲液Ⅰ洗3次各5min，缓冲液Ⅲ洗15min，NBT-BCIP染色，缓冲甘油封片，显微镜下观察。以脊神经节的神经细胞为阳性对照，无探针杂交液Hyb和PBS作阴性对照，并用正向CGRP单链RNA探针同时对照。
二、结果
1.双相间接免疫荧光染色及激光共聚焦扫描观察：在激光共聚焦扫描显微镜下可见，银屑病斑块型皮损增厚的表皮内，CD1a+的郎格汉斯细胞与PE-αMIgG抗体结合发红色荧光，同时其表面有CGRP与FITC-αRIgG抗体结合发绿色荧光，两种荧光信号同时在一个细胞上发出，经计算机处理显示呈黄棕色，说明CGRP阳性的细胞为CD1a+的郎格汉斯细胞。经4个断层的光切扫描此双阳性细胞，可见CGRP和CD1a+都分布于郎格汉斯细胞的膜表面，A、B两个外层光切面显示细胞膜表面的双阳性信号；C、D两个深层光切面则显示细胞浆内呈阴性，而细胞膜的阳性信号在边缘呈环状。正常皮肤组织及阴性对照未见此双阳性细胞。
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2.CGRP原位杂交：寻常型银屑病斑块型(静止期)皮损组织石蜡连续切片，经反向CGRP的RNA探针原位杂交可见，皮损增厚的表皮树枝状细胞内CGRP的mRNA表达(图1)，而PBS和无探针杂交液Hyb阴性对照则未见阳性表达，同时连续切片的银屑病皮损组织用正向CGRP探针作对照，同步进行原位杂交，也未见阳性表达。
图1 银屑病皮表皮郎格汉斯细胞CGRP mRNA表达(×60)
三、讨论
郎格汉斯细胞是表皮重要的免疫细胞，携带MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子，属于抗原呈递细胞,也是表皮唯一表达CD1a+抗原的细胞[2]。由于皮肤感觉神经末梢CGRP反应阳性神经纤维，可从真皮突触伸出穿过基底膜进入表皮内，释放神经递质-CGRP作用于表皮细胞[3]。因此，CGRP与表皮细胞，尤其是郎格汉斯细胞的相互关系，反映了皮肤神经系统与免疫系统之间的相互作用。我们以往的研究表明，寻常型银屑病斑块型皮损内CGRP的含量显著高于正常，而且免疫组化显示CGRP表达于表皮的树枝状细胞。为鉴别这种CGRP阳性树枝状细胞的性质，本实验用CGRP和CD1a抗体作用于银屑病斑块型皮损组织，并用PE-αMIgG和FITC-αRIgG抗体进行双相免疫荧光染色，通过激光共聚焦扫描显微镜观察，CGRP存在于表皮CD1a+郎格汉斯细胞上，经断层光切扫描此阳性细胞显示，CD1a+和CGRP都存在于郎格汉斯细胞膜表面，表明寻常型银屑病斑块型皮损内神经肽CGRP与表皮郎格汉斯细胞密切接触，这种接触可能与CGRP受体的介导有关。
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为进一步明确银屑病皮损表皮郎格汉斯细胞表面CGRP的来源，本实验用反向CGRP的RNA探针作用于银屑病斑块型皮损组织，进行原位杂交研究，发现在表皮郎格汉斯细胞有CGRPmRNA的表达。以前我们的免疫组化研究也证明，郎格汉斯细胞上有CGRP的阳性表达。但是，以双相免疫荧光染色及激光共聚焦扫描显微镜观察表皮郎格汉斯细胞不同断面发现，CGRP存在于细胞膜，胞浆内未见阳性着色。对这一结果的原因还不完全清楚。是否可能郎格汉斯细胞CGRPmRNA的表达量很少，CGRP形成后很快被运往表面，以自分泌/旁分泌的形式发挥作用，还有待我们进一步的研究。
参 考 文 献
1.Schelzen T, Armstrong CA, Bunnett NW, et al. Neuropeptides in the skin: interaction between the neuroendocrine and the skin immune system.Exp Dermatol, 1998,7:81- 96 .
, http://www.100md.com
2.Prignano F. Immunophenotype analysis of normal human dendritic cells isolated from epidermis and dermis. Int J Dermatol, 1998,37:116- 119 .
3.Hosoi J, Murphy GF, Egan CL, et al. Regulation of Langerhans cell function by nerves containing calcitonin gene- related peptide. Nature, 1993,363:159- 163.
收稿日期：1999-01-11, 百拇医药