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编号:10276071
生殖器疱疹患者病毒DNA的定量测定研究
http://www.100md.com 《中华皮肤科杂志》 2000年第3期
     作者:程培华

    单位:541001广西省桂林医学院附属医院皮肤科

    关键词:HSVDNA定量;聚合酶链反应;酶联免疫吸附法;DNA印迹

    中华皮肤科杂志000310

    【摘要】目的对生殖器疱疹病毒(HSV)患者病毒DNA进行定量测定。方法以标准的HSV质粒作为标准,用聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA),定量测定HSVDNA。结果100例生殖器疱疹患者中93例HSV测定阳性,7例阴性。在93例阳性者中有58例为HSV-2(占62.4%),35例为HSV-1(占37.6%)。93例阳性者定量测定结果,250μL标本混悬液中DNA质粒数为115~1.1×105个,平均7.1×104个;58例HSV-2阳性者,250μL标本悬液DNA质粒数为136~1.1×105个,平均7.6×104个;35例HSV-1阳性者DNA质粒数为115~9.4×104个,平均6.3×104个。分别随机取HSV-2和HSV-1阳性患者各8例已淬取和纯化的DNA混悬液10μL,定量测定结果显示:HSV-2患者最高为2.7×104个DNA质粒数,最低35个,平均1.8×104个。HSV-1最高2.5×104个,最低29个,平均1.6×104个。结论所用几种检测法中ELISA定量总阳性率为93%,与DNA印迹法阳性率相同。诊断PCR阳性率为91%,HSV分型PCR阳性率为88%。
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    Quantitation of Genital Herpesvirus DNA with Polymerase Chain Reaction and ELISA

    CHENG Peihua

    (Department of Dermatology, Affiliated Hospital, Guilin Medical College, Guilin, Guangxi 541001)

    【 Abstract】 Objective To detect and quantitate genital herpesvirus DNA in clinical specimens samples from 100 cases of genital herpes. Methods Using PCR and enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA) and a standard curve of DNA copies of HSV as the quantitative contrast. Results Ninety three cases were HSV positive and 7 cases negative among 100 samples. There were 58 cases of HSV- 2(62.4% ) and 35 cases of HSV- 1(37.6% ) among 93 positive cases. The results of quantitation showed the number of DNA plasmids ranged from 115 to 1.1× 105/250 μ L of specimen among total 93 positive samples and the mean was 7.1× 104/250 μ L. The number of HSV DNA plasmids ranged from 136 to 1.1× 105 copies per 250 μ L, and the mean was 7.6× 104 among 58 positive samples of HSV- 2; the number of HSV DNA plasmids ranged from 115 to 9.4× 104 per 250 μ L, and the mean was 6.3× 104 among 35 positive samples of HSV- 1. Meanwhile 10 μ L of extracted and dissolved DNA randomly taken from 8 out of 58 cases of HSV- 2 and 35 cases of HSV- 1, respectively, were tested, the results indicated the number of HSV- 2 DNA plasmids ranged from 35 copies to 2.7× 104 and the mean was 1.8× 104 and the number of HSV- 1 DNA ranged from 29 to 2.5× 104 and the mean was 1.6× 104. In 7 negative cases, the results of quantitation were zero. Conclusions The sensitivity of ELISA quantitation (93% ) equals to that of Southern blot, and the sensitivity of PCR for diagnosis is 91% , and the PCR for typing is 88% .
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    【 Key words】 HSV DNA quantitation PCR ELISA Southern blot

    泌尿生殖道单纯疱疹病毒2型(HSV-2)或1型(HSV-1)感染是一种临床上常见和复发性疾病。虽然已有几种抗病毒药用于临床治疗,但并不是非常有效或效果不稳定[1,2],这已经成为一个世界问题[3]。我们采用标准的HSVDNA质粒作为定量测定标准,用聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)对100例生殖器疱疹患者HSV-2和HSV-1DNA质粒数进行了定量测定研究。旨在检测临床泌尿生殖道HSVDNA感染的质粒数量情况及本文所使用的方法实用情况。现将有关结果报道如下。

    材料和方法

    一、材料

    1.标本来源:渥太华大学医学院附属儿童医院、附属总医院就诊的青年男女患者,部分孕妇生殖器疱疹患者。其中男56例,女44例(含孕妇12例)。年龄14~57岁,平均32岁。取材时病期从初发1周到2个月,其中多数为初发患者,少数为复发患者。
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    2.取材方法:用棉拭子直接涂皮损处,然后将棉拭子转浸入内装有1mL“转移病毒液”(该液可使细胞内病毒保持存活,但不分裂增殖)的试管盖紧送检。转移病毒液组成成分为每升含明胶5g,Hanks平衡盐9.80g,2-氮羟乙基哌嗪-2氮′乙烷磺酸(HEPES)5.96g,碳酸氢钠0.35g,硫酸庆大霉素10mL。

    二、方法

    1.病毒模板DNA的制备:用“液体标本RNA/DNA蛋白质分离提取盒”(由美国MolecularResearchCenterInc提供)。其方法是取标本混悬液0.25mL加入至上述试剂盒DNA提取液0.75mL中,总容量为1mL。按试剂盒试验程序提取,最后将各标本提取的HSVDNA分别溶入40μL8mmol/L的氢氧化钠溶液中,并置-20℃备PCR分析。

    2.PCR引物和条件:取上样10μL加入到90μLPCR反应液中,总反应容量为100μL/反应管。标准的HSV-1或HSV-2DNA质粒(107个质粒/μL,由美国ViralandCellularDNAControl提供),分别用高压过的蒸馏水系列稀释为5×105DNA质粒/10μL,5×103质粒/10μL,5×101质粒/10μL和5×10-1质粒/10μL。然后分别加入到90μLPCR反应液中,总容量100μL。据此制出标准DNA测量曲线。PCR引物[3,4]:HSV引物-1序列为:1603CAGTACGGCCCCGAGTTCGTGA1624;HSV引物-2序列为:2059AACATCACCCGCACCATCTAC2079,但是HSV引物-22079的5′端被生物素化。分型PCR正向引物序列(DNAP5)为:5′-ATCGTGAACATCGACATGTACGG-3′;反向引物可分为:①DNAP3-1:5′-CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC-3′,可扩增HSV-1DNA;②DNAP3-2:5′-CCTCCTTGTTGTCGAGGCCCCGAAAC-3′,可扩增HSV-2DNA。PCR条件:使用480PCR机(Perkin-Elmer)DNA在94℃下变性60s,引物在65℃退火1.5min,引物在72℃下延伸2min,循环总数为30。最后1个循环,72℃下10min,在做HSVPCR时,每个标本均同时做β-肌动蛋白PCR加以验证。
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    3.DNA印迹分析[3,4]:电泳后的PCR产品转入硝酸纤维膜上,用生物素标记寡聚探针HSV-P3杂交。

    4.PCR产物定量测定:各取PCR产物5μL,以及系列稀释过的标准HSV-1或HSV-2PCR产物5μL进行ELISA。反应1~2h,用2mol/L碳酸氢钠液终止反应后,经ELISA盘阅读机和电脑在405μm波长下阅读吸收值,其各标本产色吸收值与标准曲线色值相比较,便可得出各标本的病毒质粒数[5]。

    结果

    详见表1和表2。

    表1 诊断PCR、HSV-1、HSV-2分型PCR、DNA印迹与ELISA DNA测量阳性率比较

    测定方法 总例数 阳性例数(%) 阴性例数(%) 诊断PCR 100 91(91%) 9(9%) 分型PCR 100 88(88%) 12(12%) DNA印迹 100 93(93%) 7(7%) ELISA DNA定量 100 93(93%) 7(7%) 表2 PCR和ELISA测定93例阳性患者DNA质粒数结果讨论
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    HSV分型 测定例数 标本容量(μL) DNA质粒数 最高值 最低值 平均值 HSV-2 8 10 2.7×104 35 1.8×104 HSV-1 8 10 2.5×104 29 1.6×104 HSV-2 58 250 1.1×105 136 7.6×104 HSV-1 35 250 9.4×104 115 6.3×104 HSV-1和HSV-2 93 250 1.1×105 115 7.1×104

    注:7例阴性患者DNA质粒数测定均为0

    讨论

    从本文结果可看出,DNA质粒数最高与最低值之间存在一个巨大差距。其确切原因还不清楚,可能与患者取材的病期长短和初发或复发患者等因素有关。Cone等[6]报告用基因组同等物测定HSVDNA质粒数为11571/50μL标本混悬液,本文测定结果高于他们的结果(按几何平均值),这可能与本文使用的方法更敏感有关。本文检测方法阳性率比较,DNA印迹法与ELISA测量均为93%,高于诊断PCR91%和HSV分型PCR88%。因此,PCR和ELISADNA测量同时使用可提高单用PCR对HSV的阳性诊断率。在实验中也同时发现在93例阳性患者中,HVS-1患者为35例,占阳性患者中的37.6%。表明近年来HSV-1在泌尿生殖器疱疹病毒感染中已有明显升高。
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    志谢中国医学科学院皮肤病研究所吴绍熙教授

    本文在加拿大渥太华大学医学院附属儿童医院研究所FranciscoDiazMitoma教授指导下完成

    参 考 文 献

    1,de Jong MD, Boucher CA, Cooper DA, et al. Summary of the Ⅱ international consensus symposium on combined antiviral therapy and implications for future therapies. Antiviral Res, 1997,35:65- 82.

    2,Orozco- Topete R, Sierra Madero J, Cano Dominguez C, et al. Safety and efficacy of Virend for topical treatment of genital and anal herpes simplex lesions in patients with AIDS. Antiviral Res, 1997,35:91- 103.
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    3,Diaz- Mitoma F, Ruben M, Sacks S, et al. Detection of viral DNA to evaluate the outcome of antiviral treatment of patients with recurrent genital herpes. J Clin Microbiol, 1996,34:657- 663.

    4,Kimura H, Shibata M, Kuzushima K, et al. Detection and direct typing of herpes simplex virus by polymerase chain reaction. Med Microbiol Immunol, 1990,179:177- 184.

    5,Hammerle T, Falkner FG, Dorner F. A sensitive PCR assay system for the quantitation of viral genome equivalents: hepatitis C virus (HCV). Arch Virol, 1996,141:2103- 2114.

    6,Cone RW, Hobson AC, Brown Z, et al. Frequent detection of genital herpes simplex virus DNA by polymerase chain reaction among pregnant women. JAMA, 1994,272:792- 796.

    ( 收 稿 日 期 : 1999- 09- 16), http://www.100md.com