生殖支原体粘附蛋白基因片段重组后的表达
作者：张秀英 孔繁荣 朱学骏
单位：张秀英(100034北京医科大学第一临床医院皮肤科)；孔繁荣 朱学骏(现在北京红十字朝阳医院皮肤科100020)
关键词：
中华皮肤科杂志000319
生殖支原体寄生于泌尿生殖道，可引起人类的非淋菌性尿道炎。目前研究表明生殖支原体细胞膜上的特异顶端结构可能是致病的主要原因[1]。具有粘附功能的相对分子质量为140000粘附蛋白即位于该结构中[2]。我们利用分子克隆技术得到了生殖支原体粘附蛋白一基因片段所编码的蛋白，获得了相对分子质量约为35000的融合蛋白。通过免疫印迹方法检测证实该基因产物具有免疫活性。
一、材料和方法
1.生殖支原体标准菌株G37、生殖支原体抗血清由首都儿科研究所提供。受体菌大肠杆菌DH-5α由中国科学院动物所提供。
, 百拇医药
2.主要试剂：LB培养液(Luria-Bertani培养液)，2×SDS加样缓冲液，磷酸盐缓冲液(PBS)pH7.4，质量分数为10%聚丙烯酰胺凝胶(10%SDS-PAGE)均参照文献配制[3]。异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，联苯二胺(DAB)，硝酸纤维素膜(NC膜)均购自华美公司。
3.重组质粒的构建和转化：按分子克隆进行[3]，即PCR产物和PGEX-2T载体经酶切处理，在T4DNA连接酶作用下，进行连接反应，构成重组质粒，然后转化到大肠杆菌DH-5α中，并经酶切分析证实[4]。
4.克隆化基因在受体菌的诱导表达：挑取单一菌落放于2mLLB培养液中，于37℃摇动培养过夜，然后取1/10体积接种于新的LB培养液中，37℃培养2h。加入IPTG至终浓度1mmol/L进行诱导表达。离心收集细胞，并超声处理破坏细胞壁，加等体积的2×SDS加样缓冲液，于100℃煮沸3min，离心，取上清液在10%SDS-PAGE上加样电泳分析表达产物，做阴性和空白对照。分离包含体。
, 百拇医药
5.克隆化基因表达蛋白的检测(免疫印迹法)：表达产物经10%SDS-PAGE电泳，转移至NC膜上，染色观察后，脱色，PBS冲洗后剪下各条带，分别浸入不同浓度的生殖支原体抗血清中，室温孵育4h，PBS液冲洗，加入1∶500酶标抗兔IgG室温孵育1h，PBS液冲洗，加DAB显色，蒸馏水冲洗，分析结果。
二、结果
1.重组克隆的诱导表达：经诱导后，含生殖支原体粘附蛋白基因片段的重组克隆在受体菌大肠杆菌DH-5α中成功表达。结果表达了相对分子质量为35000的融合蛋白，含PGEX-2T载体的大肠杆菌表达相对分子质量约26000的蛋白，未转化的受体菌大肠杆菌DH-5α未见表达产物。
2.免疫印迹法检测表达蛋白的免疫活性：表达产物转移至NC膜上。用生殖支原体特异的抗血清，经免疫印迹法检测证实表达蛋白具有免疫活性。以未转化宿主菌DH-5α培养物作空白对照，在相对分子质量为35000处显示很强的一条带。正常兔血清和空白对照无反应。
, http://www.100md.com
三、讨论
我们首先通过PCR扩增特异性外源基因片段，插入到PGEX-2T载体内，然后转化到大肠杆菌DH-5α中，并加以证实。经诱导后，使外源基因大量转录并表达，获得相对分子质量为35000融合蛋白。与我们预期结果相一致。Jacobs等[5]证实生殖支原体粘附蛋白是免疫优势蛋白，具有抗原性。1993年Opitz等[6]对生殖支原体粘附蛋白表面抗原进行深入研究后发现，其表面存在特异及非特异抗原决定簇。这为我们的研究提供了有利的证据。我们采用免疫印迹法检测表达产物是否具有免疫学和生物学活性及其活性高低，结果显示相对分子质量为35000重组蛋白带与生殖支原体的抗血清呈强阳性反应，与文献有关粘附蛋白抗原性的研究结果相一致。
参 考 文 献
1，Hu PC, Schapr U, Collier A, et al. A Mycoplasma genitalium protein resembling the Mycoplasma pneumoniae attachment protein. Infect Immun, 1987,55:1126- 1131.
, 百拇医药
2，Hu PC, Collier AM, Baseman JB. Surface parasitism by Mycoplasma pneumoniae of respiratory epithelium. J Exp Med, 1991,145:1328- 1343.
3，卢圣栋，李尹，胡小年，等.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社,1993.365.
4，张秀英，孔繁荣，朱学骏，等.生殖支原体粘附蛋白基因片段的克隆和表达.中华医学杂志，1997，77：551.
5，Jacobs E, Watter T, Schaefer HE, et al. Comparison of host responses after intranasal infection of guinea pigs with Mycoplasma genitalium or with Mycoplasma pneumoniae. Microb Pathog, 1991,10:221- 229.
6，Opitz O, Jacobs E. Adherence epitopes of Mycoplasma genitalium adhesin. J Gen Microbiol, 1993,138:1785- 1790.
(收 稿 日 期 ： 1999- 06- 18), 百拇医药
单位：张秀英(100034北京医科大学第一临床医院皮肤科)；孔繁荣 朱学骏(现在北京红十字朝阳医院皮肤科100020)
关键词：
中华皮肤科杂志000319
生殖支原体寄生于泌尿生殖道，可引起人类的非淋菌性尿道炎。目前研究表明生殖支原体细胞膜上的特异顶端结构可能是致病的主要原因[1]。具有粘附功能的相对分子质量为140000粘附蛋白即位于该结构中[2]。我们利用分子克隆技术得到了生殖支原体粘附蛋白一基因片段所编码的蛋白，获得了相对分子质量约为35000的融合蛋白。通过免疫印迹方法检测证实该基因产物具有免疫活性。
一、材料和方法
1.生殖支原体标准菌株G37、生殖支原体抗血清由首都儿科研究所提供。受体菌大肠杆菌DH-5α由中国科学院动物所提供。
, 百拇医药
2.主要试剂：LB培养液(Luria-Bertani培养液)，2×SDS加样缓冲液，磷酸盐缓冲液(PBS)pH7.4，质量分数为10%聚丙烯酰胺凝胶(10%SDS-PAGE)均参照文献配制[3]。异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，联苯二胺(DAB)，硝酸纤维素膜(NC膜)均购自华美公司。
3.重组质粒的构建和转化：按分子克隆进行[3]，即PCR产物和PGEX-2T载体经酶切处理，在T4DNA连接酶作用下，进行连接反应，构成重组质粒，然后转化到大肠杆菌DH-5α中，并经酶切分析证实[4]。
4.克隆化基因在受体菌的诱导表达：挑取单一菌落放于2mLLB培养液中，于37℃摇动培养过夜，然后取1/10体积接种于新的LB培养液中，37℃培养2h。加入IPTG至终浓度1mmol/L进行诱导表达。离心收集细胞，并超声处理破坏细胞壁，加等体积的2×SDS加样缓冲液，于100℃煮沸3min，离心，取上清液在10%SDS-PAGE上加样电泳分析表达产物，做阴性和空白对照。分离包含体。
, 百拇医药
5.克隆化基因表达蛋白的检测(免疫印迹法)：表达产物经10%SDS-PAGE电泳，转移至NC膜上，染色观察后，脱色，PBS冲洗后剪下各条带，分别浸入不同浓度的生殖支原体抗血清中，室温孵育4h，PBS液冲洗，加入1∶500酶标抗兔IgG室温孵育1h，PBS液冲洗，加DAB显色，蒸馏水冲洗，分析结果。
二、结果
1.重组克隆的诱导表达：经诱导后，含生殖支原体粘附蛋白基因片段的重组克隆在受体菌大肠杆菌DH-5α中成功表达。结果表达了相对分子质量为35000的融合蛋白，含PGEX-2T载体的大肠杆菌表达相对分子质量约26000的蛋白，未转化的受体菌大肠杆菌DH-5α未见表达产物。
2.免疫印迹法检测表达蛋白的免疫活性：表达产物转移至NC膜上。用生殖支原体特异的抗血清，经免疫印迹法检测证实表达蛋白具有免疫活性。以未转化宿主菌DH-5α培养物作空白对照，在相对分子质量为35000处显示很强的一条带。正常兔血清和空白对照无反应。
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三、讨论
我们首先通过PCR扩增特异性外源基因片段，插入到PGEX-2T载体内，然后转化到大肠杆菌DH-5α中，并加以证实。经诱导后，使外源基因大量转录并表达，获得相对分子质量为35000融合蛋白。与我们预期结果相一致。Jacobs等[5]证实生殖支原体粘附蛋白是免疫优势蛋白，具有抗原性。1993年Opitz等[6]对生殖支原体粘附蛋白表面抗原进行深入研究后发现，其表面存在特异及非特异抗原决定簇。这为我们的研究提供了有利的证据。我们采用免疫印迹法检测表达产物是否具有免疫学和生物学活性及其活性高低，结果显示相对分子质量为35000重组蛋白带与生殖支原体的抗血清呈强阳性反应，与文献有关粘附蛋白抗原性的研究结果相一致。
参 考 文 献
1，Hu PC, Schapr U, Collier A, et al. A Mycoplasma genitalium protein resembling the Mycoplasma pneumoniae attachment protein. Infect Immun, 1987,55:1126- 1131.
, 百拇医药
2，Hu PC, Collier AM, Baseman JB. Surface parasitism by Mycoplasma pneumoniae of respiratory epithelium. J Exp Med, 1991,145:1328- 1343.
3，卢圣栋，李尹，胡小年，等.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社,1993.365.
4，张秀英，孔繁荣，朱学骏，等.生殖支原体粘附蛋白基因片段的克隆和表达.中华医学杂志，1997，77：551.
5，Jacobs E, Watter T, Schaefer HE, et al. Comparison of host responses after intranasal infection of guinea pigs with Mycoplasma genitalium or with Mycoplasma pneumoniae. Microb Pathog, 1991,10:221- 229.
6，Opitz O, Jacobs E. Adherence epitopes of Mycoplasma genitalium adhesin. J Gen Microbiol, 1993,138:1785- 1790.
(收 稿 日 期 ： 1999- 06- 18), 百拇医药