角化棘皮瘤与鳞状细胞癌患者表皮细胞凋亡和增殖的研究
作者：李利 王琳 成娘 杨毅 杜晓萍 周光平
单位：610041成都，华西医科大学附属第一医院皮肤性病科
关键词：角化棘皮瘤；癌；鳞状细胞；脱噬作用
中华皮肤科杂志000409
【摘要】目的探讨角化棘皮瘤与皮肤鳞状细胞癌患者表皮细胞凋亡和增殖的差异。方法采用末端特异性DNA标记技术和免疫组化法，原位检测了20例角化棘皮瘤和25例鳞状细胞癌患者表皮的细胞凋亡、凋亡相关基因bax及bcl-2和代表细胞增殖的核抗原Ki-67的表达。结果角化棘皮瘤的细胞凋亡率(48.83%)明显高于鳞状细胞癌(26.08%)，前者的增殖率(9.03%)明显低于后者(27.20%)。鳞状细胞癌分化程度越低，凋亡细胞越少，增殖率越高。bcl-2抗原仅在两病少数边缘瘤细胞中微弱表达。两病均表达bax抗原，与凋亡率呈显著正相关。结论角化棘皮瘤和鳞状细胞癌在凋亡的形态和基因调控方面有相似的特点，但鳞状细胞癌的增殖活性更高。
, http://www.100md.com
Comparative Studies on Apoptosis and Cellular Proliferation Between Keratoacanthoma and Squamous Cell Carcinoma
LI Li，WANG Lin，CHENG Niang，et al.
(Department of Dermatovenereology, First Affiliated Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
【 Abstract】 Objective To explore the difference of apoptosis and cellular proliferation between keratoacanthoma (KA) and cutaneous squamous cell carcinoma (SCC). Methods Programmed cell death (apoptosis) was identified by an in situ terminal deoxynucleotidyl transferas (TdT)- mediated dUTP - biotin nick and labelling staining (TUNEL) in 20 KA and 25 SCC cases. Expression of nuclear antigen Ki- 67 and two protooncogenes, bcl- 2 and bax, recently recognized to be involved in apoptosis, were detected by immunohistochemical technique. Results Apoptotic cells distributed densely at the cancer nests of KA and well differentiated SCC or diffusely in poorly differentiated SCC. The percentages of apoptotic cells were significantly higher in KA (48.83% ) than those in SCC (26.08% )( t=2.274,P=0.028) . The densities of Ki- 67 staining were greater in SCC than those in KA. The percentages of cellular proliferation were 9.03% in KA and 27.20% in SCC(t=3.281,P=0.002). In SCC, the poorer the differentiation, the less the apoptosis, and the higher proliferative activity.Weakly staining bcl- 2 antigen was observed in KA (6/20) and SCC (6/25)(P >0.05).Bax staining was positive in all cases,and stronger in KA than that in SCC (U=2.489,P=0.013). There were a positive correlation between apoptosis and intensity of bax expression and a negative correlation between apoptosis and intensity of bcl- 2 expression. Conclusion It is suggested that there are similar biological characteristics in cellular apoptosis and gene regulation of apoptosis in KA and SCC. However, proliferative activity in SCC was higher than that in KA.
, 百拇医药
【 Key words】 Keratoacanthoma Carcinoma， squamous cell Apoptosis
角化棘皮瘤(keratoacanthoma,KA)和皮肤鳞状细胞癌(squamouscellcarcinoma,SCC)均为来源于棘细胞 、好发于皮肤暴光部位的肿瘤。但多数KA在半年内自行消退，仅少数能远处转移。 SCC则包括一组分化程度不同的恶性肿瘤。近年来对KA和SCC是两个独立的疾病还是同 一疾病的不同病谱观点不一。我们采用末端特异性DNA标记技术(TUNEL)和免疫组化法， 原位检测了20例KA和25例SCC的凋亡细胞、bax及bcl-2基因和核抗原Ki-67的表达。研究 两病凋亡与 增殖的特点，寻找导致不同转归的原因。
资料和方法
(一)病例：KA20例，男14例，女6例。年龄48～83岁，平均68.55岁。病程1～30个月，平 均8.65个月；按文献[1]作组织学分期：增生期6例，成熟期12例，消退期2例。SCC25例， 男15例，女10例。年龄34～85岁，平均59.88岁。病程1～10年，平均2.4年；按病理恶性程度 分为3组(Broders分型标准)：Ⅰ组(Ⅰ级)10例，Ⅱ组(Ⅱ级)8例，Ⅲ组(Ⅲ～Ⅳ级) 7例。所有患者取活检前均未接受特殊治疗。
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(二)TUNEL法：主要染色步骤按TUNEL原位末端标记试剂盒说明进行。NBT/BCIP显色， 核固红复染。阳性对照为正常扁桃体组织，不加dUTP作为空白对照。
(三)免疫组化法：采用标准的链霉亲和素-过氧化酶法(SP法),试剂盒购自Zymedy公司 。第一抗体：bcl-2、bax和Ki-67(MIB-1)分别购自SantaCruz、Dako和SantaCruz公司。稀 释浓度分别为1∶50、1∶100、1∶50。阳性对照：bcl-2用肺癌转移的淋巴结，bax为正常 人皮肤，Ki-67为淋巴瘤。以PBS代替一抗作为空白对照，余同前。
(四)统计学分析：采用SPSS统计软件，计量资料用t检验；半定量资料用非参数秩和检 验。凋亡与其它指标的关系作等级相关分析。
结果
(一)TUNEL法：凋亡细胞为核固缩呈圆形或椭圆形深紫蓝色团块，在KA和分化较高的 SCC瘤中心呈巢状分布，在低分化SCC散在分布。选每张阳性切片中凋亡细胞较多的高倍 视野10个，计数每个视野100个瘤细胞中凋亡细胞数，取10个视野的平均值为凋亡率。 16例KA染色阳性，平均凋亡率为48.83%。其中2例消退期凋亡率分别为62%和66%。19例 SCC染色阳性，平均凋亡率为26.08%，显著低于KA(t=2.27，P<0.05)。SCC分化越低，凋 亡细胞越少，见表1。另有一些阳性染色细胞，核仁可见，与核膜间有一亮晕，其性质 尚待确定。
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(二)免疫组化法：
1.Ki-67阳性染色为程度不同的黄色，呈均质状分布于细胞核。计数法同凋亡率，以增 殖率表示。12例KA阳性着色，平均增殖率为9.03%。三期间增殖率比较差异有显著性( t组间=5.47，P<0.05)，增生期最高，2例消退期为0。19例SCC阳性着色，平均增殖率为 27.20%，明显高于KA(t=3.28,P<0.01)。SCC分化越低，增殖率越高(t组间=21.18,P<0.01) 。见表1。
2.bcl-2阳性反应定位于胞浆，呈黄色或棕黄色颗粒。取5个染色均匀的高倍视野，计数 每个视野中阳性细胞数，以平均百分率表示。根据bcl-2染色强度和(或)阳性细胞率分为 四级：阴性(-)：胞浆无黄色或阳性细胞<5%；弱阳性(+)：胞浆呈淡黄色或仅有 6%～20%瘤细胞着色；中度阳性(
)：胞浆呈棕黄色或有21%～60%瘤细胞着色；强 阳性(
)：见棕黄色颗粒或阳性细胞>60%。正常表皮局灶性基底细胞胞浆bcl-2染色 阳性。KA和SCC各6例与正常表皮交界处的瘤细胞呈弱阳性染色。两组比较差异无显著性 (U=0.15，P>0.05)。
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3.bax阳性反应为胞浆呈淡黄色或棕黄色，也可见于胞膜或核膜。染色强度分级方法同 bcl-2。全部KA和SCC表达bax抗原，染色强度+～不等。KA染色强度明显高于 SCC(U=2.49，P<0.05)。
(三)相关性分析：KA凋亡率与bax基因表达呈正相关(r=0.70,P<0.01)，与bcl-2基因表达呈负 相关(r=-0.50,P<0.05)；增殖率与bax呈负相关(r=-0.60,P<0.01)，与bcl-2呈正相关(r=0.76,P< 0.01)；bax与bcl-2呈负相关(r=-0.81,P<0.01)；增殖率与凋亡率呈负相关(r=-0.49,P>0.05)，但 差异无显著性。SCC凋亡率与bax呈显著正相关(r=0.65,P<0.01),其它指标相关性趋势同KA近 似，但相关性不强，差异均无显著性。
讨论
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KA和SCC的转归截然不同。细胞的增殖与分化是肿瘤发生和转归的重要基础。Ki-67抗 原在除G0期外的其它细胞周期中表达，是较为敏感的细胞增殖指标[2]。本文发现和 Sagol等[3]报道基本一致，即Ki-67抗原在SCC中弥散分布，分化越低，阳性细胞越多。在 KA肿瘤周边分布，在消退期趋于零。Ki-67抗原在KA中的表达强度(9.33%)明显低于 SCC(27.20%)。KA与高分化SCC比较差异无显著性，与中分化、低分化比较，差异均有 显著性。
表1 角化棘皮瘤和皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡和增殖的比较
病种
例数
凋亡率(%)
增殖率(%)
, 百拇医药
范围
均数
中位数
t 值*
P值*
范围
均数
中位数
t 值*
P值*
角化棘皮瘤
20
0-88
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48.83
58.80
0-25
9.03
7.50
鳞状细胞癌
25
0-75
26.08
20.00
2.27
<0.05
0-75
, 百拇医药
27.20
25.50
3.28
<0.01
I组
10
0-75
36.10
37.50
1.05
>0.05
0-61
20.70
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13.05
1.49
>0.05
II组
8
5-74
29.12
19.0
1.61
>0.05
0-65
27.50
22.53
, 百拇医药
2.80
<0.05
III组
7
065
17.57
8.00
2.47
<0.05
8.75
36.14
30.02
3.78
, 百拇医药
<0.01
原癌基因异常，使细胞凋亡障碍，也是肿瘤的重要病理机制。我们应用Boehringer Mannheim细胞凋亡药盒，原位检测发现16例KA呈阳性染色，凋亡细胞集 中在瘤中心。5例增生期即有凋亡发生，2例消退期凋亡较高。在KA早期，增生和凋亡即 同时存在；在消退期，凋亡占优势，最终导致KA的自然消退。19例SCC染色阳性。高、 中分化组凋亡率与KA比较差异无显著性，低分化组与KA比较差异有显著性。可见随 SCC分化程度降低，增生逐渐大于凋亡，造成肿瘤浸润和转移。
bcl-2是凋亡抑制原癌基因。国内SCC阴性染色报道居多[4]。国外报道差异较大[5]。本文 KA和SCC各6例染色阳性，均位于边缘瘤细胞。bax为bcl-2同源基因，其作用为促进凋亡 。细胞内bcl-2和bax基因产物的比例决定细胞生存还是死亡。全部病例均表达bax抗原， KA染色强度明显高于SCC。在瘤中心染色更强，与凋亡细胞在瘤中心呈巢状分布相吻合 。相关性分析发现，KA凋亡率与bax呈正相关，与bcl-2负相关。SCC的多数指标相关性趋 势基本同KA。提示两病可能有相似的凋亡调控机制。
, 百拇医药
参考文献
[1]李成明，单伟化.角化棘皮瘤.国外医学皮肤性病学分册,1995,21:99-100.
[2] Rose DS， Maddox PH， Brown DC. Which proliferation markers for routine immunohistology? A comparison of five antibodies.J Clin Pathol， 1994,47:1010- 1014.
[3]Sagol O, Kurtoglu B, Ozer E, et al. Serological estimation of mean nuclear volume and staining pattern of Ki- 67 antigen in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas. Gen Diagn Pathol， 1998， 143:305- 309.
[4]王秀丽,徐世正,熊腊元.在基底细胞癌和鳞状细胞癌皮损中bcl-2和Fas的表达.中华皮肤科
杂志,1997,30:371-373.
[5] Wikonkal NM, Berg RJ, van Haselen CW, et al. Bcl- 2 vs p53 protein expression and apoptotic rate in human nonmelanoma skin cancers. Arch Dermatol， 1997,133:599- 602.
(收稿日期：1999-08-07), 百拇医药
单位：610041成都，华西医科大学附属第一医院皮肤性病科
关键词：角化棘皮瘤；癌；鳞状细胞；脱噬作用
中华皮肤科杂志000409
【摘要】目的探讨角化棘皮瘤与皮肤鳞状细胞癌患者表皮细胞凋亡和增殖的差异。方法采用末端特异性DNA标记技术和免疫组化法，原位检测了20例角化棘皮瘤和25例鳞状细胞癌患者表皮的细胞凋亡、凋亡相关基因bax及bcl-2和代表细胞增殖的核抗原Ki-67的表达。结果角化棘皮瘤的细胞凋亡率(48.83%)明显高于鳞状细胞癌(26.08%)，前者的增殖率(9.03%)明显低于后者(27.20%)。鳞状细胞癌分化程度越低，凋亡细胞越少，增殖率越高。bcl-2抗原仅在两病少数边缘瘤细胞中微弱表达。两病均表达bax抗原，与凋亡率呈显著正相关。结论角化棘皮瘤和鳞状细胞癌在凋亡的形态和基因调控方面有相似的特点，但鳞状细胞癌的增殖活性更高。
, http://www.100md.com
Comparative Studies on Apoptosis and Cellular Proliferation Between Keratoacanthoma and Squamous Cell Carcinoma
LI Li，WANG Lin，CHENG Niang，et al.
(Department of Dermatovenereology, First Affiliated Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
【 Abstract】 Objective To explore the difference of apoptosis and cellular proliferation between keratoacanthoma (KA) and cutaneous squamous cell carcinoma (SCC). Methods Programmed cell death (apoptosis) was identified by an in situ terminal deoxynucleotidyl transferas (TdT)- mediated dUTP - biotin nick and labelling staining (TUNEL) in 20 KA and 25 SCC cases. Expression of nuclear antigen Ki- 67 and two protooncogenes, bcl- 2 and bax, recently recognized to be involved in apoptosis, were detected by immunohistochemical technique. Results Apoptotic cells distributed densely at the cancer nests of KA and well differentiated SCC or diffusely in poorly differentiated SCC. The percentages of apoptotic cells were significantly higher in KA (48.83% ) than those in SCC (26.08% )( t=2.274,P=0.028) . The densities of Ki- 67 staining were greater in SCC than those in KA. The percentages of cellular proliferation were 9.03% in KA and 27.20% in SCC(t=3.281,P=0.002). In SCC, the poorer the differentiation, the less the apoptosis, and the higher proliferative activity.Weakly staining bcl- 2 antigen was observed in KA (6/20) and SCC (6/25)(P >0.05).Bax staining was positive in all cases,and stronger in KA than that in SCC (U=2.489,P=0.013). There were a positive correlation between apoptosis and intensity of bax expression and a negative correlation between apoptosis and intensity of bcl- 2 expression. Conclusion It is suggested that there are similar biological characteristics in cellular apoptosis and gene regulation of apoptosis in KA and SCC. However, proliferative activity in SCC was higher than that in KA.
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【 Key words】 Keratoacanthoma Carcinoma， squamous cell Apoptosis
角化棘皮瘤(keratoacanthoma,KA)和皮肤鳞状细胞癌(squamouscellcarcinoma,SCC)均为来源于棘细胞 、好发于皮肤暴光部位的肿瘤。但多数KA在半年内自行消退，仅少数能远处转移。 SCC则包括一组分化程度不同的恶性肿瘤。近年来对KA和SCC是两个独立的疾病还是同 一疾病的不同病谱观点不一。我们采用末端特异性DNA标记技术(TUNEL)和免疫组化法， 原位检测了20例KA和25例SCC的凋亡细胞、bax及bcl-2基因和核抗原Ki-67的表达。研究 两病凋亡与 增殖的特点，寻找导致不同转归的原因。
资料和方法
(一)病例：KA20例，男14例，女6例。年龄48～83岁，平均68.55岁。病程1～30个月，平 均8.65个月；按文献[1]作组织学分期：增生期6例，成熟期12例，消退期2例。SCC25例， 男15例，女10例。年龄34～85岁，平均59.88岁。病程1～10年，平均2.4年；按病理恶性程度 分为3组(Broders分型标准)：Ⅰ组(Ⅰ级)10例，Ⅱ组(Ⅱ级)8例，Ⅲ组(Ⅲ～Ⅳ级) 7例。所有患者取活检前均未接受特殊治疗。
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(二)TUNEL法：主要染色步骤按TUNEL原位末端标记试剂盒说明进行。NBT/BCIP显色， 核固红复染。阳性对照为正常扁桃体组织，不加dUTP作为空白对照。
(三)免疫组化法：采用标准的链霉亲和素-过氧化酶法(SP法),试剂盒购自Zymedy公司 。第一抗体：bcl-2、bax和Ki-67(MIB-1)分别购自SantaCruz、Dako和SantaCruz公司。稀 释浓度分别为1∶50、1∶100、1∶50。阳性对照：bcl-2用肺癌转移的淋巴结，bax为正常 人皮肤，Ki-67为淋巴瘤。以PBS代替一抗作为空白对照，余同前。
(四)统计学分析：采用SPSS统计软件，计量资料用t检验；半定量资料用非参数秩和检 验。凋亡与其它指标的关系作等级相关分析。
结果
(一)TUNEL法：凋亡细胞为核固缩呈圆形或椭圆形深紫蓝色团块，在KA和分化较高的 SCC瘤中心呈巢状分布，在低分化SCC散在分布。选每张阳性切片中凋亡细胞较多的高倍 视野10个，计数每个视野100个瘤细胞中凋亡细胞数，取10个视野的平均值为凋亡率。 16例KA染色阳性，平均凋亡率为48.83%。其中2例消退期凋亡率分别为62%和66%。19例 SCC染色阳性，平均凋亡率为26.08%，显著低于KA(t=2.27，P<0.05)。SCC分化越低，凋 亡细胞越少，见表1。另有一些阳性染色细胞，核仁可见，与核膜间有一亮晕，其性质 尚待确定。
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(二)免疫组化法：
1.Ki-67阳性染色为程度不同的黄色，呈均质状分布于细胞核。计数法同凋亡率，以增 殖率表示。12例KA阳性着色，平均增殖率为9.03%。三期间增殖率比较差异有显著性( t组间=5.47，P<0.05)，增生期最高，2例消退期为0。19例SCC阳性着色，平均增殖率为 27.20%，明显高于KA(t=3.28,P<0.01)。SCC分化越低，增殖率越高(t组间=21.18,P<0.01) 。见表1。
2.bcl-2阳性反应定位于胞浆，呈黄色或棕黄色颗粒。取5个染色均匀的高倍视野，计数 每个视野中阳性细胞数，以平均百分率表示。根据bcl-2染色强度和(或)阳性细胞率分为 四级：阴性(-)：胞浆无黄色或阳性细胞<5%；弱阳性(+)：胞浆呈淡黄色或仅有 6%～20%瘤细胞着色；中度阳性(
)：胞浆呈棕黄色或有21%～60%瘤细胞着色；强 阳性()：见棕黄色颗粒或阳性细胞>60%。正常表皮局灶性基底细胞胞浆bcl-2染色 阳性。KA和SCC各6例与正常表皮交界处的瘤细胞呈弱阳性染色。两组比较差异无显著性 (U=0.15，P>0.05)。, http://www.100md.com
3.bax阳性反应为胞浆呈淡黄色或棕黄色，也可见于胞膜或核膜。染色强度分级方法同 bcl-2。全部KA和SCC表达bax抗原，染色强度+～
不等。KA染色强度明显高于 SCC(U=2.49，P<0.05)。(三)相关性分析：KA凋亡率与bax基因表达呈正相关(r=0.70,P<0.01)，与bcl-2基因表达呈负 相关(r=-0.50,P<0.05)；增殖率与bax呈负相关(r=-0.60,P<0.01)，与bcl-2呈正相关(r=0.76,P< 0.01)；bax与bcl-2呈负相关(r=-0.81,P<0.01)；增殖率与凋亡率呈负相关(r=-0.49,P>0.05)，但 差异无显著性。SCC凋亡率与bax呈显著正相关(r=0.65,P<0.01),其它指标相关性趋势同KA近 似，但相关性不强，差异均无显著性。
讨论
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KA和SCC的转归截然不同。细胞的增殖与分化是肿瘤发生和转归的重要基础。Ki-67抗 原在除G0期外的其它细胞周期中表达，是较为敏感的细胞增殖指标[2]。本文发现和 Sagol等[3]报道基本一致，即Ki-67抗原在SCC中弥散分布，分化越低，阳性细胞越多。在 KA肿瘤周边分布，在消退期趋于零。Ki-67抗原在KA中的表达强度(9.33%)明显低于 SCC(27.20%)。KA与高分化SCC比较差异无显著性，与中分化、低分化比较，差异均有 显著性。
表1 角化棘皮瘤和皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡和增殖的比较
病种
例数
凋亡率(%)
增殖率(%)
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范围
均数
中位数
t 值*
P值*
范围
均数
中位数
t 值*
P值*
角化棘皮瘤
20
0-88
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48.83
58.80
0-25
9.03
7.50
鳞状细胞癌
25
0-75
26.08
20.00
2.27
<0.05
0-75
, 百拇医药
27.20
25.50
3.28
<0.01
I组
10
0-75
36.10
37.50
1.05
>0.05
0-61
20.70
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13.05
1.49
>0.05
II组
8
5-74
29.12
19.0
1.61
>0.05
0-65
27.50
22.53
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2.80
<0.05
III组
7
065
17.57
8.00
2.47
<0.05
8.75
36.14
30.02
3.78
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<0.01
原癌基因异常，使细胞凋亡障碍，也是肿瘤的重要病理机制。我们应用Boehringer Mannheim细胞凋亡药盒，原位检测发现16例KA呈阳性染色，凋亡细胞集 中在瘤中心。5例增生期即有凋亡发生，2例消退期凋亡较高。在KA早期，增生和凋亡即 同时存在；在消退期，凋亡占优势，最终导致KA的自然消退。19例SCC染色阳性。高、 中分化组凋亡率与KA比较差异无显著性，低分化组与KA比较差异有显著性。可见随 SCC分化程度降低，增生逐渐大于凋亡，造成肿瘤浸润和转移。
bcl-2是凋亡抑制原癌基因。国内SCC阴性染色报道居多[4]。国外报道差异较大[5]。本文 KA和SCC各6例染色阳性，均位于边缘瘤细胞。bax为bcl-2同源基因，其作用为促进凋亡 。细胞内bcl-2和bax基因产物的比例决定细胞生存还是死亡。全部病例均表达bax抗原， KA染色强度明显高于SCC。在瘤中心染色更强，与凋亡细胞在瘤中心呈巢状分布相吻合 。相关性分析发现，KA凋亡率与bax呈正相关，与bcl-2负相关。SCC的多数指标相关性趋 势基本同KA。提示两病可能有相似的凋亡调控机制。
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参考文献
[1]李成明，单伟化.角化棘皮瘤.国外医学皮肤性病学分册,1995,21:99-100.
[2] Rose DS， Maddox PH， Brown DC. Which proliferation markers for routine immunohistology? A comparison of five antibodies.J Clin Pathol， 1994,47:1010- 1014.
[3]Sagol O, Kurtoglu B, Ozer E, et al. Serological estimation of mean nuclear volume and staining pattern of Ki- 67 antigen in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas. Gen Diagn Pathol， 1998， 143:305- 309.
[4]王秀丽,徐世正,熊腊元.在基底细胞癌和鳞状细胞癌皮损中bcl-2和Fas的表达.中华皮肤科
杂志,1997,30:371-373.
[5] Wikonkal NM, Berg RJ, van Haselen CW, et al. Bcl- 2 vs p53 protein expression and apoptotic rate in human nonmelanoma skin cancers. Arch Dermatol， 1997,133:599- 602.
(收稿日期：1999-08-07), 百拇医药