热休克蛋白70在皮肤肿瘤中的表达及与增殖细胞核抗原、p53蛋白表达的相关性研究
作者：宋辉 易传勋
单位：易传勋(430022武汉，同济医科大学附属协和医院整形外科)；宋辉(现在南京铁道医学院附属医院烧伤整形科，210009)
关键词：热休克蛋白质类；增殖细胞核抗原；蛋白质p53；皮肤肿瘤
中华皮肤科杂志000407
【摘要】目的研究热休克蛋白70在皮肤癌中的表达水平和分布特点及与增殖细胞核抗原
(PCNA)、p53蛋白表达的相关性。方法应用免疫组化方法(SABC)，用特异性热休克蛋白70单
抗、p53蛋白单抗、PCNA单抗检测热休克蛋白70、PCNA、p53蛋白在皮肤良恶性病变和正
常皮肤组织中的表达和分布。结果热休克蛋白70在鳞状细胞癌、基底细胞癌癌细胞核内
, http://www.100md.com
有异常增高表达，其中鳞状细胞癌、基底细胞癌中阳性与阴性标本的PC10指数差异有显
著性，而p53蛋白阳性率未见明显差异。鳞状细胞癌中热休克蛋白70表达在Ⅰ～Ⅱ和Ⅳ级
间差异有显著性。结论热休克蛋白70在皮肤癌中存在异常增高的核表达，并与细胞的增
殖程度和病理分级有关，提示其可能参与肿瘤生长，其在皮肤肿瘤中的诊断价值和与临
床预后的关系需要进一步研究。
Study on Heat Shock Protein 70 Expression in Skin Carcinomas and Its Relationship with PCNA and p53 Protein SONG
, 百拇医药 Junhui，YI Chuanxun.
(Department of Burns and Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Nanjing Railway College, Nanjing 210009)
【 Abstract】 Objective To study heat shock protein (HSP)70 expression in skin carcinomas and its relationship with proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and p53 protein. Methods The expression of HSP70, p53 protein, and PCNA was determined by an immunohistochemical technique (SABC) using specific antibodies against HSP 70, p53 protein and PCNA in a variety of benign and malignant skin tissues. Results The overexpression of HSP 70 was found in 60% of squamous cell carcinoma (SCC) and 25% of basal cell carcinoma (BCC). HSP 70 was located mainly in the nuclei of tumor cells. There was a significant difference of PC 10 indexes, which represent the positive rates of PCNA, between HSP 70 positive and negative tissues in SCC and BCC. In view of p53 protein, no significant difference was observed between HSP 70 positive and negative tissues in those tumors. The differences of HSP 70 expression were significant between gradeⅠ ～ Ⅱ and grade Ⅳ of SCC. Conclusion The results demonstrate that HSP 70 is associated with cellular proliferation and pathological grading of skin cancers. It is suggested that HSP 70 may be involved in the progression of tumor cells. Further research is needed to elucidate the value of diagnosis and prognosis of HSP 70 in skin tumors.
, 百拇医药
【 Key words】Heat shock proteins Proliferating cell nuclear antigen Protein p53 Skin neoplasms
热休克蛋白70(HSP70)在很多癌组织中均有异常表达，且其表达水平与肿瘤分化程度、临 床转归、抗药性形成等有着不同程度的关系[1-4]。在某些肿瘤研究中发现HSP70的表达 与增殖细胞核抗原(PCNA)、p53蛋白表达在数量和分布上有相关性[2,4]。我们采用免疫组 化技术(SABC)，观察HSP70、PCNA、p53蛋白在皮肤癌中的表达和分布以及他们的相互关系 。
资料和方法
(一)临床资料：收集本院皮肤肿瘤患者手术切除或活检的病变组织和正常皮肤组织，其中正常 皮肤14例，基底细胞癌(基癌)16例，鳞状细胞癌(鳞癌)15例(其中Ⅰ～Ⅱ级8例，Ⅲ级4例， Ⅳ级3例，暴光部位8例，非暴光部位7例)。
, 百拇医药
(二)免疫组化染色步骤：按常规制成石蜡切片，常规切片涂于涂有APES的干净玻片。
HSP70染色：常规脱蜡至水，蒸馏水冲洗2遍。3%H2O2室温5～10min灭活内源性酶，蒸馏 水冲洗，0.05%胰蛋白酶消化30min(37℃)，蒸馏水冲洗，PBS浸泡20min。加正常山羊血清 ，室温下置30min。加HSP70一抗(1∶200)，4℃过夜，PBS洗2min2次。加生物素化羊抗鼠 IgG,37℃温育60min，PBS洗2min2次。加SABC试剂，37℃温育30min，PBS洗5min4次。DAB/H2O2显色，苏木素复染，蒸馏水冲洗。常规脱水，树脂封片。
PCNA、p53：染色常规脱蜡至水，蒸馏水冲洗2遍。将切片浸入0.01mol/L，pH6.0的柠檬酸盐 缓冲液中，置微波炉加热至90℃～100℃，持续10min，冷却后滴加抗原修复液，室温10 min，蒸馏水洗2min2次，以下步骤与HSP70染色相同。
, http://www.100md.com
(三)观察和结果判定：将切片于镜下相同强度光线下观察表皮、真皮中HSP70、PCNA、 p53蛋白表达和分布情况，以出现棕黄色颗粒为阳性细胞，无可见颗粒或可疑者为阴性。 对每张阳性皮肤癌切片在高倍镜下(×400)选择含瘤细胞或浸润淋巴细胞的5个视野计数。 计算HSP70、p53阳性细胞数占总细胞数的百分率，以<10%为+，10%～25%为(
)， >25%为(
)。PCNA染色结果以PC10指数表示，PC10(%)=(PCNA阳性细胞数/总细胞数)× 100%。
表1 不同皮肤组织中HSP70、P53蛋白，PCNA染色结果
标本
被检例数
, http://www.100md.com
HSP70阳性例数
P53阳性例数
PC10
(
±s,%)
+
+
正常皮肤
, 百拇医药
14
0
0
0
0
0
0
6.3±2.2
基底细胞癌
16
3
1
0
2
, http://www.100md.com
1
0
24.2±8.3
鳞状细胞癌
15
4
3
2
3
2
0
50.6±21.3
I-II级
, 百拇医药
8
2
0
0
1
0
0
40.6±19.0
III级
4
2
2
0
1
, http://www.100md.com
1
0
52.7±8.6
IV级
3
0
1
2
1
1
0
74.3±11.0
结果
(一)HSP70表达：14例正常皮肤内可见基底层表皮细胞内胞浆少量表达，未见核阳性细胞 。癌细胞内HSP70于核内表达明显增加。9例鳞癌(60%)见HSP70核阳性细胞，多位于癌巢边 缘及角化珠周围，角化珠中央未见HSP70核阳性细胞。4例基癌(25%)可见HSP70核阳性细胞 ，散在于癌巢内。见表1。
, 百拇医药
Ⅰ～Ⅳ级鳞癌中，HSP70核阳性率随恶性程度增高而增加。Ⅰ～Ⅱ级与Ⅳ级阳性率比较 ，χ2=4.95,P<0.05。鳞癌中暴光部位8例，阳性5例，非暴光部位7例，阳性4例。两者阳性 率之间比较，χ2=0.71,P>0.05。
(二)PCNA表达：PCNA多于核内表达。14例正常皮肤细胞内于基底细胞层及毛囊根部周围 偶见PCNA阳性细胞，真皮内未见PCNA阳性细胞。在Ⅰ～Ⅳ级鳞癌中，随瘤细胞分化程 度降低，PC10指数均值逐渐增大。经方差分析，Ⅰ～Ⅱ与Ⅳ级鳞癌间PC10指数均值差异 有显著性(F=10.80,P<0.01)。基癌癌巢中散在PCNA阳性细胞。见表1。
(三)p53表达：14例正常皮肤细胞内未见p53阳性细胞，p53阳性细胞多见于肿瘤细胞核内， 极少数位于胞浆。15例鳞癌中5例见p53阳性细胞，多散在于癌巢外周。Ⅰ～Ⅱ级鳞癌与 Ⅳ级间比较，χ2=3.22,P>0.05。鳞癌暴光部位8例，阳性6例，非暴光部位7例，阳性1例， 两者阳性率比较，χ2=5.52,P<0.05。16例基癌中3例见p53阳性细胞，散在于癌巢内。
, 百拇医药
(四)HSP70、p53蛋白表达与PC10之间的关系：基癌、鳞癌中HSP70阳性与阴性标本间PC10差 异有显著性，χ2=4.32,P<0.05。基癌、鳞癌中HSP70阳性与阴性标本间p53阳性率差异无显 著性。
讨论
本研究发现基癌中，HSP70表达较低，鳞癌中HSP70表达水平较高，而Ⅰ～Ⅱ级与Ⅳ级鳞 癌之间HSP70表达差异有显著性。说明HSP70与肿瘤的细胞分化有密切关系。本文选取癌 巢处计数，发现鳞癌和基癌HSP70阳性病例和阴性病例间PC10差异有显著性，提示 HSP70与肿瘤细胞的增殖程度成正相关。在表皮黑素瘤中已发现，HSP70与Clark分级呈正相 关[2]。本文也提示HSP70在皮肤肿瘤中具有一定的鉴别诊断价值，并可能与临床预后有关 。
本研究发现p53蛋白表达在鳞癌分级之间未见明显差异，提示突变型p53蛋白的表达与皮 肤肿瘤的良恶性程度无明显的相关性。而多种研究表明p53突变可能是作为光化性致癌的 早期表现。p53也参与HSP70的表达调控，野生型p53可抑制HSP70启动子，从而抑制其转录 ，而p53突变后可能失去该抑制作用。在某些肿瘤研究已发现HSP70与p53形成复合物，如 口腔鳞癌和癌前病变、胰腺癌、乳腺癌。在本文中HSP70与p53的表达未发现明显相关性 ，需进一步的研究。
, 百拇医药
参考文献
[1]Conroy SE, Latchman DS. Do heat shock proteins have a role in breast cancer? Br J Cancer, 1996,74:717- 721.
[2]Lazaris AC, Theodoropoulos GE, Aroni K, et al. Immunohistochemical expression of C-myc oncogene, heat shock protein 70 and HLA DR molecules in malignant cutaneous melanoma. Virchows Arch, 1995,426:461- 467.
[3]Sugerman PB, Savage NW, Xu LJ, et al. Heat shock protein expression in oral epithelial dysplasia and squamous cell
carcinoma. Eur J Cancer B Oral Oncol, 1995,31B:63- 67.
[4]Kaur J, Ralhan R. Differential expression of 70kD heat shock protein in human oral tumorigenesis. Int J Cancer,1995,63:774- 779.
(收稿日期：1999-07-26), 百拇医药
单位：易传勋(430022武汉，同济医科大学附属协和医院整形外科)；宋辉(现在南京铁道医学院附属医院烧伤整形科，210009)
关键词：热休克蛋白质类；增殖细胞核抗原；蛋白质p53；皮肤肿瘤
中华皮肤科杂志000407
【摘要】目的研究热休克蛋白70在皮肤癌中的表达水平和分布特点及与增殖细胞核抗原
(PCNA)、p53蛋白表达的相关性。方法应用免疫组化方法(SABC)，用特异性热休克蛋白70单
抗、p53蛋白单抗、PCNA单抗检测热休克蛋白70、PCNA、p53蛋白在皮肤良恶性病变和正
常皮肤组织中的表达和分布。结果热休克蛋白70在鳞状细胞癌、基底细胞癌癌细胞核内
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有异常增高表达，其中鳞状细胞癌、基底细胞癌中阳性与阴性标本的PC10指数差异有显
著性，而p53蛋白阳性率未见明显差异。鳞状细胞癌中热休克蛋白70表达在Ⅰ～Ⅱ和Ⅳ级
间差异有显著性。结论热休克蛋白70在皮肤癌中存在异常增高的核表达，并与细胞的增
殖程度和病理分级有关，提示其可能参与肿瘤生长，其在皮肤肿瘤中的诊断价值和与临
床预后的关系需要进一步研究。
Study on Heat Shock Protein 70 Expression in Skin Carcinomas and Its Relationship with PCNA and p53 Protein SONG
, 百拇医药 Junhui，YI Chuanxun.
(Department of Burns and Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Nanjing Railway College, Nanjing 210009)
【 Abstract】 Objective To study heat shock protein (HSP)70 expression in skin carcinomas and its relationship with proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and p53 protein. Methods The expression of HSP70, p53 protein, and PCNA was determined by an immunohistochemical technique (SABC) using specific antibodies against HSP 70, p53 protein and PCNA in a variety of benign and malignant skin tissues. Results The overexpression of HSP 70 was found in 60% of squamous cell carcinoma (SCC) and 25% of basal cell carcinoma (BCC). HSP 70 was located mainly in the nuclei of tumor cells. There was a significant difference of PC 10 indexes, which represent the positive rates of PCNA, between HSP 70 positive and negative tissues in SCC and BCC. In view of p53 protein, no significant difference was observed between HSP 70 positive and negative tissues in those tumors. The differences of HSP 70 expression were significant between gradeⅠ ～ Ⅱ and grade Ⅳ of SCC. Conclusion The results demonstrate that HSP 70 is associated with cellular proliferation and pathological grading of skin cancers. It is suggested that HSP 70 may be involved in the progression of tumor cells. Further research is needed to elucidate the value of diagnosis and prognosis of HSP 70 in skin tumors.
, 百拇医药
【 Key words】Heat shock proteins Proliferating cell nuclear antigen Protein p53 Skin neoplasms
热休克蛋白70(HSP70)在很多癌组织中均有异常表达，且其表达水平与肿瘤分化程度、临 床转归、抗药性形成等有着不同程度的关系[1-4]。在某些肿瘤研究中发现HSP70的表达 与增殖细胞核抗原(PCNA)、p53蛋白表达在数量和分布上有相关性[2,4]。我们采用免疫组 化技术(SABC)，观察HSP70、PCNA、p53蛋白在皮肤癌中的表达和分布以及他们的相互关系 。
资料和方法
(一)临床资料：收集本院皮肤肿瘤患者手术切除或活检的病变组织和正常皮肤组织，其中正常 皮肤14例，基底细胞癌(基癌)16例，鳞状细胞癌(鳞癌)15例(其中Ⅰ～Ⅱ级8例，Ⅲ级4例， Ⅳ级3例，暴光部位8例，非暴光部位7例)。
, 百拇医药
(二)免疫组化染色步骤：按常规制成石蜡切片，常规切片涂于涂有APES的干净玻片。
HSP70染色：常规脱蜡至水，蒸馏水冲洗2遍。3%H2O2室温5～10min灭活内源性酶，蒸馏 水冲洗，0.05%胰蛋白酶消化30min(37℃)，蒸馏水冲洗，PBS浸泡20min。加正常山羊血清 ，室温下置30min。加HSP70一抗(1∶200)，4℃过夜，PBS洗2min2次。加生物素化羊抗鼠 IgG,37℃温育60min，PBS洗2min2次。加SABC试剂，37℃温育30min，PBS洗5min4次。DAB/H2O2显色，苏木素复染，蒸馏水冲洗。常规脱水，树脂封片。
PCNA、p53：染色常规脱蜡至水，蒸馏水冲洗2遍。将切片浸入0.01mol/L，pH6.0的柠檬酸盐 缓冲液中，置微波炉加热至90℃～100℃，持续10min，冷却后滴加抗原修复液，室温10 min，蒸馏水洗2min2次，以下步骤与HSP70染色相同。
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(三)观察和结果判定：将切片于镜下相同强度光线下观察表皮、真皮中HSP70、PCNA、 p53蛋白表达和分布情况，以出现棕黄色颗粒为阳性细胞，无可见颗粒或可疑者为阴性。 对每张阳性皮肤癌切片在高倍镜下(×400)选择含瘤细胞或浸润淋巴细胞的5个视野计数。 计算HSP70、p53阳性细胞数占总细胞数的百分率，以<10%为+，10%～25%为(
)， >25%为()。PCNA染色结果以PC10指数表示，PC10(%)=(PCNA阳性细胞数/总细胞数)× 100%。表1 不同皮肤组织中HSP70、P53蛋白，PCNA染色结果
标本
被检例数
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HSP70阳性例数
P53阳性例数
PC10
(
±s,%)+
+
正常皮肤
, 百拇医药
14
0
0
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0
0
0
6.3±2.2
基底细胞癌
16
3
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0
2
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1
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24.2±8.3
鳞状细胞癌
15
4
3
2
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50.6±21.3
I-II级
, 百拇医药
8
2
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40.6±19.0
III级
4
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52.7±8.6
IV级
3
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74.3±11.0
结果
(一)HSP70表达：14例正常皮肤内可见基底层表皮细胞内胞浆少量表达，未见核阳性细胞 。癌细胞内HSP70于核内表达明显增加。9例鳞癌(60%)见HSP70核阳性细胞，多位于癌巢边 缘及角化珠周围，角化珠中央未见HSP70核阳性细胞。4例基癌(25%)可见HSP70核阳性细胞 ，散在于癌巢内。见表1。
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Ⅰ～Ⅳ级鳞癌中，HSP70核阳性率随恶性程度增高而增加。Ⅰ～Ⅱ级与Ⅳ级阳性率比较 ，χ2=4.95,P<0.05。鳞癌中暴光部位8例，阳性5例，非暴光部位7例，阳性4例。两者阳性 率之间比较，χ2=0.71,P>0.05。
(二)PCNA表达：PCNA多于核内表达。14例正常皮肤细胞内于基底细胞层及毛囊根部周围 偶见PCNA阳性细胞，真皮内未见PCNA阳性细胞。在Ⅰ～Ⅳ级鳞癌中，随瘤细胞分化程 度降低，PC10指数均值逐渐增大。经方差分析，Ⅰ～Ⅱ与Ⅳ级鳞癌间PC10指数均值差异 有显著性(F=10.80,P<0.01)。基癌癌巢中散在PCNA阳性细胞。见表1。
(三)p53表达：14例正常皮肤细胞内未见p53阳性细胞，p53阳性细胞多见于肿瘤细胞核内， 极少数位于胞浆。15例鳞癌中5例见p53阳性细胞，多散在于癌巢外周。Ⅰ～Ⅱ级鳞癌与 Ⅳ级间比较，χ2=3.22,P>0.05。鳞癌暴光部位8例，阳性6例，非暴光部位7例，阳性1例， 两者阳性率比较，χ2=5.52,P<0.05。16例基癌中3例见p53阳性细胞，散在于癌巢内。
, 百拇医药
(四)HSP70、p53蛋白表达与PC10之间的关系：基癌、鳞癌中HSP70阳性与阴性标本间PC10差 异有显著性，χ2=4.32,P<0.05。基癌、鳞癌中HSP70阳性与阴性标本间p53阳性率差异无显 著性。
讨论
本研究发现基癌中，HSP70表达较低，鳞癌中HSP70表达水平较高，而Ⅰ～Ⅱ级与Ⅳ级鳞 癌之间HSP70表达差异有显著性。说明HSP70与肿瘤的细胞分化有密切关系。本文选取癌 巢处计数，发现鳞癌和基癌HSP70阳性病例和阴性病例间PC10差异有显著性，提示 HSP70与肿瘤细胞的增殖程度成正相关。在表皮黑素瘤中已发现，HSP70与Clark分级呈正相 关[2]。本文也提示HSP70在皮肤肿瘤中具有一定的鉴别诊断价值，并可能与临床预后有关 。
本研究发现p53蛋白表达在鳞癌分级之间未见明显差异，提示突变型p53蛋白的表达与皮 肤肿瘤的良恶性程度无明显的相关性。而多种研究表明p53突变可能是作为光化性致癌的 早期表现。p53也参与HSP70的表达调控，野生型p53可抑制HSP70启动子，从而抑制其转录 ，而p53突变后可能失去该抑制作用。在某些肿瘤研究已发现HSP70与p53形成复合物，如 口腔鳞癌和癌前病变、胰腺癌、乳腺癌。在本文中HSP70与p53的表达未发现明显相关性 ，需进一步的研究。
, 百拇医药
参考文献
[1]Conroy SE, Latchman DS. Do heat shock proteins have a role in breast cancer? Br J Cancer, 1996,74:717- 721.
[2]Lazaris AC, Theodoropoulos GE, Aroni K, et al. Immunohistochemical expression of C-myc oncogene, heat shock protein 70 and HLA DR molecules in malignant cutaneous melanoma. Virchows Arch, 1995,426:461- 467.
[3]Sugerman PB, Savage NW, Xu LJ, et al. Heat shock protein expression in oral epithelial dysplasia and squamous cell
carcinoma. Eur J Cancer B Oral Oncol, 1995,31B:63- 67.
[4]Kaur J, Ralhan R. Differential expression of 70kD heat shock protein in human oral tumorigenesis. Int J Cancer,1995,63:774- 779.
(收稿日期：1999-07-26), 百拇医药