肿瘤坏死因子α及其受体对银屑病患者外周血单一核细胞产生白介素8的影响
作者：李萍 马骏驰 张开明 尹兴平
单位：李萍 马骏驰(030001太原，山西医科大学第二医院皮肤科)；张开明 尹兴平(太原市中心医院皮肤科)
关键词：
中华皮肤科杂志000420
白介素8(IL-8)是银屑病免疫炎症网络中具有致病作用的细胞因子[1]，肿瘤坏死因子α (TNFα)是IL-8的有效诱导 剂[2]。有研究表明，银屑病患者皮损和血清中有高水平IL-8和TNFα[2,3]。新近研究显示 ，协助TNFα发挥生物学作用的受体即sTNFR在银屑病发病中同样具有重要意义[4]，并且 sTNFR作为TNFα的拮抗剂可能为临床提供新的治疗途径。我们对银屑病患者和正常人对 照者的外周血单一核细胞(PBMC)在不同比例sTNFα/sTNFRⅡ作用下产生IL-8进行了研究 ，现将结果报道如下。
, 百拇医药
一、研究对象
患者组36例，为门诊和住院患者中确诊为进行期银屑病患者，就诊前1个月内未系统使用 过皮质类固醇和免疫抑制剂。男21例，女15例；急性点滴状银屑病12例，寻常型21例，关 节病型3例，年龄8～53岁，病程6d至30年，皮损范围10%～85%。正常人对照组18例为本 院健康职工，性别、年龄与患者组匹配。
二、主要试剂
重组人可溶性肿瘤坏死因子α(rHusTNFα)、重组人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ(rHu sTNFRⅡ)及IL-8ELISA试剂盒(批号：132483)均购于Genzyme公司；IL-8、β-肌动蛋白 探针及引物由北京医科大学病理室合成，序列如下：IL-8(272bp)5′- CTCTCTTGGCAGCCTTCCTG-3′，3′-AAAACTTCTCCCGACTCTTA-5′;β-肌动蛋白(326bp) 5′-GAATTCATGTTTG AGACCTTCAA-3′，3′-ACCTGAAGCTCG TTCTCTACCTAGGCC-5′；地高辛检测试剂盒(BochringerManrhein)，根据试剂盒中提供方 法测定IL-8和β-肌动蛋白标记探针的工作浓度为40pg/mL。
, 百拇医药
三、方法
(一)方法1：
1.PBMC分离、培养：无菌常规分离PBMC，然后用含10%灭活FCS、100U/mL青霉素、链霉 素的RPMI-1640完全培养基调整细胞浓度至4×106个/mL，加入24孔细胞培养板内，每孔 500μL。每份标本设为4孔，第1孔为自然增殖孔，其余3孔sTNFα终质量浓度均为40 pg/mL，第2孔为单纯sTNFα刺激孔，第3、4孔为sTNFα与sTNFRⅡ结合孔，sTNFRⅡ终质量 浓度分别为400pg/mL(sTNFα/sTNFRⅡ为1/10)和800pg/mL(sTNFα/sTNFRⅡ为1/20)，最后置37℃ ，相对湿度95%，体积分数为5%CO2细胞培养箱中孵育12h。培养上清液及细胞-40℃冻 存，待测IL-8含量及备提取总RNA。
2.IL-8测定：严格按IL-8ELISA试剂盒说明操作。每份样品均设复孔，最后置芬兰 Labsystem全自动酶标仪450nm处测吸光度(A值)，然后从标准曲线上得出含量(单位pg/mL)。
, 百拇医药
3.培养细胞总RNA的提取：参照一步法[5]，略作改动。106培养细胞中加入600μL变性液， 60μL2mol/LpH4.0乙酸钠，600μL水饱和酚，120μL(49∶1)氯仿-异戊醇，充分混匀后4 ℃离心，吸取水相加等体积异丙醇-20℃沉淀过夜，次日重复抽提1次，异丙醇-20℃ 沉淀1h，16.3mol/L(75%)乙醇洗涤沉淀,干燥后溶于DEPC水中，紫外分光光度计上测260nm及 280nm处吸光度得RNA量和纯度(A260/A280>1.7)，质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳证实含 18S、28S2条带。
(二)方法2：
1.cDNA第一链的合成：于25μLRT体积中含5×RT缓冲液5μL，随机引物1μL，dNTPs(各 2.5mmol/L)4.0μL，RNA酶抑制剂0.5μL(20U),总RNA10μL(1～5μg),双蒸水3.5μL,AMV1μ L(9U),42℃温育2h，95℃5min灭活逆转录酶。
, 百拇医药
2.PCR扩增：总反应体积25μL。置MJ-PTC-100基因扩增仪扩增，PCR条件：预变性94℃ 5min,94℃1min,58℃1min(β-肌动蛋白)/60℃1min(IL-8),72℃2min,循环35次，终延伸72℃5 min。
3.硝酸纤维素膜印迹加样、DNA探针分子杂交和激光密度仪扫描。
(1)取硝酸纤维素膜于10×SSC浸泡30min，然后固定于斑点杂交器上，每孔加入经变性液处 理的扩增产物20μL(同时设立阴性对照)。80℃烤膜2h。将膜封于杂交袋中，68℃预 杂交2～3h，68℃(β-肌动蛋白)/85℃(IL-8)杂交16h。
(2)检测：主要步骤为：彻底洗膜后,100mL1×封闭液中温育30min,加地高辛-AP抗体(1∶ 10000)70mU/mL作用40min，再次洗膜，避光显色16h。取膜在GELMATtm1000激光密度扫描 仪上测定结果，得分子杂交点A值，求相对单位[IL-8A值/β-肌动蛋白A值(0.2425)]。
, 百拇医药
表1 银屑病患者组与对照组各自4孔培养上清液中IL-8含量的两两比较
对照组
患者组
对照组
IL-8差值(pg/mL)
q值
P值
IL-8差值(pg/mL)
q值
P值
1与2
44.39
, 百拇医药
4.04
<0.05
65.9
3.79
<0.05
1与3
0.90
0.08
>0.05
4.29
0.25
>0.05
1与4
, 百拇医药
31.60
2.88
>0.05
26.75
1.54
>0.05
2与3
43.48
3.96
<0.05
61.20
3.51
<0.05
, 百拇医药
2与4
12.75
1.16
>0.05
38.74
2.22
>0.05
3与4
30.74
2.80
>0.05
22.46
1.29
, 百拇医药
>0.05
四、统计学处理
患者组和对照组4个培养孔中IL-8含量(或mRNA相对单位)分别进行配伍组设计的方差分析 和多个样本均数两两比较的q检验；两组各平行孔之间分别进行两样本t检验。
五、结果
患者组和对照组PBMCsTNFα刺激孔中IL-8水平(含量或相对单位)均明显高于各自相应自 然增殖孔；与PBMCsTNFα刺激孔比较，两组中PBMC加sTNFα与sTNFRⅡ培养孔IL-8水平 均降低，以sTNFα/sTNFRⅡ为1/10培养孔降低最明显，但sTNFα/sTNFRⅡ为1/20培养孔与 sTNFα刺激孔比较差异无显著性；两组中PBMC加sTNFα和sTNFRⅡ培养孔中IL- 8水平与各自相应自然增殖孔比较差异均无显著性(见表1)。 患者组4个培养孔中IL-8水平明显高于正常人对照组相应孔(见表2)。
, http://www.100md.com
六、讨论
研究结果显示：患者组和正常人对照组PBMC加sTNFα培养孔中IL-8水平均显著高于自然 增殖孔，表明TNFα对患者和正常人的PBMC均有很强的刺激作用，可诱导PBMC产生IL- 8；患者组自然增殖孔和PBMC加TNFα刺激孔IL-8水平明显高于正常人对照相应培养孔， 表明银屑病患者PBMC处于明显活化状态。Okubo等[6]曾对银屑病患者PBMC进行体外培养 ，得出相似结论。但本研究还显示患者PBMC对TNFα的刺激反应性增强；患者组与对照 组在给予相同浓度比例的
sTNFα/sTNFRⅡ作用后产生IL-8的规律相似，提示患者能够产生高水平IL-8可能与其 PBMC在刺激前就处于活化状态有关，所以降低PBMC的活化状态对银屑病可能有益；加 有sTNFRⅡ的培养孔中IL-8水平较sTNFα刺激孔均有降低，提示sTNFRⅡ在一定浓度下对 TNFα有拮抗作用；各培养孔中IL-8mRNA相对单位与相应蛋白含量结果一致，表明 TNFα从转录及蛋白水平对PBMC产生IL-8进行调控。
, 百拇医药
Piguet等[7]利用与类风湿性关节炎极相似的慢性多发性关节炎小鼠模型，证明了基因重组 sTNFR可以通过阻断TNFα的病理性损害作用治疗自身免疫性疾病。目前大量研究结果表 明，银屑病患者体内存在免疫异常，以受累皮损部位和血清中炎症前细胞因子TNFα水 平与活性增高为特征[2]，而sTNFR最具有应用价值的生物学活性是拮抗TNF的作用，因此 ，sTNFR作为拮抗剂可能为探索新的银屑病治疗途径提供一些思路，但sTNFR对TNFα具有 双相作用即高浓度sTNFR抑制TNF的活性，低浓度则可以促进TNF的某些生物学活性，而 sTNFR究竟对TNF的活性起抑制还是增强作用，要根据sTNFR在TNF作用部位的浓度，特别 是sTNFR浓度和TNF浓度之间的比例而定[8]。到目前为止，这一确切的浓度比例仍处于研 究阶段。我们的研究显示sTNFR对TNFα有一定抑制作用，但此浓度或浓度比是否能达到 最佳抑制效果，尚有待进一步研究。
参考文献
, 百拇医药
[1]李新宇综述.银屑病发病机制的现代概念.国外医学皮肤性病学分册，1998，24：137-140.
[2] Nickoloff BJ, Karabin GD, Barker JN, et al. Cellular localization of interleukin- 8 and its inducer, tumor necrosis factoralpha in psoriasis. Am J Pathol， 1991， 138:129- 140.
[3]Schroder J M,Gregory H,Young J, et al. Neutrophil activating proteins in psoriasis. J Invest Dermatol,1992,98:241-247.
[4]张开明，刘梅青,尹兴平,等.银屑病患者血清可溶性肿瘤坏死因子受体水平的检测.中华
, 百拇医药
医学杂志，1998，78：524-525.
[5]Chomczynski P, Sacchi N. Single step method of RNA isolation by guanidinium thiocyanate phenol chioroform extration. Anal Biochem, 1987,162:156- 159.
[6]Okubo Y, Koga M. Peripheral blood monocyte in psoriasis patients overproduce cytokines. J Dermatol Sci,1998,17:223-232.
[7]Piguet PF， Grau GE, Vesin C, et al. Evolution of collagen arthritis in mice is arrested by treatment with anti- tumor necrosis factor(TNF),antibody or a recombinant soluble TNF receptor. Immunology,1992,77:510- 514.
[8]Aderka D, Engelmann H, Maor Y, et al. Stabilization of the bioactivity of tumor necrosis factor by its soluble receptors. J Exp Med, 1992,175:323- 329.
(收稿日期：1999-10-08), http://www.100md.com
单位：李萍 马骏驰(030001太原，山西医科大学第二医院皮肤科)；张开明 尹兴平(太原市中心医院皮肤科)
关键词：
中华皮肤科杂志000420
白介素8(IL-8)是银屑病免疫炎症网络中具有致病作用的细胞因子[1]，肿瘤坏死因子α (TNFα)是IL-8的有效诱导 剂[2]。有研究表明，银屑病患者皮损和血清中有高水平IL-8和TNFα[2,3]。新近研究显示 ，协助TNFα发挥生物学作用的受体即sTNFR在银屑病发病中同样具有重要意义[4]，并且 sTNFR作为TNFα的拮抗剂可能为临床提供新的治疗途径。我们对银屑病患者和正常人对 照者的外周血单一核细胞(PBMC)在不同比例sTNFα/sTNFRⅡ作用下产生IL-8进行了研究 ，现将结果报道如下。
, 百拇医药
一、研究对象
患者组36例，为门诊和住院患者中确诊为进行期银屑病患者，就诊前1个月内未系统使用 过皮质类固醇和免疫抑制剂。男21例，女15例；急性点滴状银屑病12例，寻常型21例，关 节病型3例，年龄8～53岁，病程6d至30年，皮损范围10%～85%。正常人对照组18例为本 院健康职工，性别、年龄与患者组匹配。
二、主要试剂
重组人可溶性肿瘤坏死因子α(rHusTNFα)、重组人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ(rHu sTNFRⅡ)及IL-8ELISA试剂盒(批号：132483)均购于Genzyme公司；IL-8、β-肌动蛋白 探针及引物由北京医科大学病理室合成，序列如下：IL-8(272bp)5′- CTCTCTTGGCAGCCTTCCTG-3′，3′-AAAACTTCTCCCGACTCTTA-5′;β-肌动蛋白(326bp) 5′-GAATTCATGTTTG AGACCTTCAA-3′，3′-ACCTGAAGCTCG TTCTCTACCTAGGCC-5′；地高辛检测试剂盒(BochringerManrhein)，根据试剂盒中提供方 法测定IL-8和β-肌动蛋白标记探针的工作浓度为40pg/mL。
, 百拇医药
三、方法
(一)方法1：
1.PBMC分离、培养：无菌常规分离PBMC，然后用含10%灭活FCS、100U/mL青霉素、链霉 素的RPMI-1640完全培养基调整细胞浓度至4×106个/mL，加入24孔细胞培养板内，每孔 500μL。每份标本设为4孔，第1孔为自然增殖孔，其余3孔sTNFα终质量浓度均为40 pg/mL，第2孔为单纯sTNFα刺激孔，第3、4孔为sTNFα与sTNFRⅡ结合孔，sTNFRⅡ终质量 浓度分别为400pg/mL(sTNFα/sTNFRⅡ为1/10)和800pg/mL(sTNFα/sTNFRⅡ为1/20)，最后置37℃ ，相对湿度95%，体积分数为5%CO2细胞培养箱中孵育12h。培养上清液及细胞-40℃冻 存，待测IL-8含量及备提取总RNA。
2.IL-8测定：严格按IL-8ELISA试剂盒说明操作。每份样品均设复孔，最后置芬兰 Labsystem全自动酶标仪450nm处测吸光度(A值)，然后从标准曲线上得出含量(单位pg/mL)。
, 百拇医药
3.培养细胞总RNA的提取：参照一步法[5]，略作改动。106培养细胞中加入600μL变性液， 60μL2mol/LpH4.0乙酸钠，600μL水饱和酚，120μL(49∶1)氯仿-异戊醇，充分混匀后4 ℃离心，吸取水相加等体积异丙醇-20℃沉淀过夜，次日重复抽提1次，异丙醇-20℃ 沉淀1h，16.3mol/L(75%)乙醇洗涤沉淀,干燥后溶于DEPC水中，紫外分光光度计上测260nm及 280nm处吸光度得RNA量和纯度(A260/A280>1.7)，质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳证实含 18S、28S2条带。
(二)方法2：
1.cDNA第一链的合成：于25μLRT体积中含5×RT缓冲液5μL，随机引物1μL，dNTPs(各 2.5mmol/L)4.0μL，RNA酶抑制剂0.5μL(20U),总RNA10μL(1～5μg),双蒸水3.5μL,AMV1μ L(9U),42℃温育2h，95℃5min灭活逆转录酶。
, 百拇医药
2.PCR扩增：总反应体积25μL。置MJ-PTC-100基因扩增仪扩增，PCR条件：预变性94℃ 5min,94℃1min,58℃1min(β-肌动蛋白)/60℃1min(IL-8),72℃2min,循环35次，终延伸72℃5 min。
3.硝酸纤维素膜印迹加样、DNA探针分子杂交和激光密度仪扫描。
(1)取硝酸纤维素膜于10×SSC浸泡30min，然后固定于斑点杂交器上，每孔加入经变性液处 理的扩增产物20μL(同时设立阴性对照)。80℃烤膜2h。将膜封于杂交袋中，68℃预 杂交2～3h，68℃(β-肌动蛋白)/85℃(IL-8)杂交16h。
(2)检测：主要步骤为：彻底洗膜后,100mL1×封闭液中温育30min,加地高辛-AP抗体(1∶ 10000)70mU/mL作用40min，再次洗膜，避光显色16h。取膜在GELMATtm1000激光密度扫描 仪上测定结果，得分子杂交点A值，求相对单位[IL-8A值/β-肌动蛋白A值(0.2425)]。
, 百拇医药
表1 银屑病患者组与对照组各自4孔培养上清液中IL-8含量的两两比较
对照组
患者组
对照组
IL-8差值(pg/mL)
q值
P值
IL-8差值(pg/mL)
q值
P值
1与2
44.39
, 百拇医药
4.04
<0.05
65.9
3.79
<0.05
1与3
0.90
0.08
>0.05
4.29
0.25
>0.05
1与4
, 百拇医药
31.60
2.88
>0.05
26.75
1.54
>0.05
2与3
43.48
3.96
<0.05
61.20
3.51
<0.05
, 百拇医药
2与4
12.75
1.16
>0.05
38.74
2.22
>0.05
3与4
30.74
2.80
>0.05
22.46
1.29
, 百拇医药
>0.05
四、统计学处理
患者组和对照组4个培养孔中IL-8含量(或mRNA相对单位)分别进行配伍组设计的方差分析 和多个样本均数两两比较的q检验；两组各平行孔之间分别进行两样本t检验。
五、结果
患者组和对照组PBMCsTNFα刺激孔中IL-8水平(含量或相对单位)均明显高于各自相应自 然增殖孔；与PBMCsTNFα刺激孔比较，两组中PBMC加sTNFα与sTNFRⅡ培养孔IL-8水平 均降低，以sTNFα/sTNFRⅡ为1/10培养孔降低最明显，但sTNFα/sTNFRⅡ为1/20培养孔与 sTNFα刺激孔比较差异无显著性；两组中PBMC加sTNFα和sTNFRⅡ培养孔中IL- 8水平与各自相应自然增殖孔比较差异均无显著性(见表1)。 患者组4个培养孔中IL-8水平明显高于正常人对照组相应孔(见表2)。
, http://www.100md.com
六、讨论
研究结果显示：患者组和正常人对照组PBMC加sTNFα培养孔中IL-8水平均显著高于自然 增殖孔，表明TNFα对患者和正常人的PBMC均有很强的刺激作用，可诱导PBMC产生IL- 8；患者组自然增殖孔和PBMC加TNFα刺激孔IL-8水平明显高于正常人对照相应培养孔， 表明银屑病患者PBMC处于明显活化状态。Okubo等[6]曾对银屑病患者PBMC进行体外培养 ，得出相似结论。但本研究还显示患者PBMC对TNFα的刺激反应性增强；患者组与对照 组在给予相同浓度比例的
sTNFα/sTNFRⅡ作用后产生IL-8的规律相似，提示患者能够产生高水平IL-8可能与其 PBMC在刺激前就处于活化状态有关，所以降低PBMC的活化状态对银屑病可能有益；加 有sTNFRⅡ的培养孔中IL-8水平较sTNFα刺激孔均有降低，提示sTNFRⅡ在一定浓度下对 TNFα有拮抗作用；各培养孔中IL-8mRNA相对单位与相应蛋白含量结果一致，表明 TNFα从转录及蛋白水平对PBMC产生IL-8进行调控。
, 百拇医药
Piguet等[7]利用与类风湿性关节炎极相似的慢性多发性关节炎小鼠模型，证明了基因重组 sTNFR可以通过阻断TNFα的病理性损害作用治疗自身免疫性疾病。目前大量研究结果表 明，银屑病患者体内存在免疫异常，以受累皮损部位和血清中炎症前细胞因子TNFα水 平与活性增高为特征[2]，而sTNFR最具有应用价值的生物学活性是拮抗TNF的作用，因此 ，sTNFR作为拮抗剂可能为探索新的银屑病治疗途径提供一些思路，但sTNFR对TNFα具有 双相作用即高浓度sTNFR抑制TNF的活性，低浓度则可以促进TNF的某些生物学活性，而 sTNFR究竟对TNF的活性起抑制还是增强作用，要根据sTNFR在TNF作用部位的浓度，特别 是sTNFR浓度和TNF浓度之间的比例而定[8]。到目前为止，这一确切的浓度比例仍处于研 究阶段。我们的研究显示sTNFR对TNFα有一定抑制作用，但此浓度或浓度比是否能达到 最佳抑制效果，尚有待进一步研究。
参考文献
, 百拇医药
[1]李新宇综述.银屑病发病机制的现代概念.国外医学皮肤性病学分册，1998，24：137-140.
[2] Nickoloff BJ, Karabin GD, Barker JN, et al. Cellular localization of interleukin- 8 and its inducer, tumor necrosis factoralpha in psoriasis. Am J Pathol， 1991， 138:129- 140.
[3]Schroder J M,Gregory H,Young J, et al. Neutrophil activating proteins in psoriasis. J Invest Dermatol,1992,98:241-247.
[4]张开明，刘梅青,尹兴平,等.银屑病患者血清可溶性肿瘤坏死因子受体水平的检测.中华
, 百拇医药
医学杂志，1998，78：524-525.
[5]Chomczynski P, Sacchi N. Single step method of RNA isolation by guanidinium thiocyanate phenol chioroform extration. Anal Biochem, 1987,162:156- 159.
[6]Okubo Y, Koga M. Peripheral blood monocyte in psoriasis patients overproduce cytokines. J Dermatol Sci,1998,17:223-232.
[7]Piguet PF， Grau GE, Vesin C, et al. Evolution of collagen arthritis in mice is arrested by treatment with anti- tumor necrosis factor(TNF),antibody or a recombinant soluble TNF receptor. Immunology,1992,77:510- 514.
[8]Aderka D, Engelmann H, Maor Y, et al. Stabilization of the bioactivity of tumor necrosis factor by its soluble receptors. J Exp Med, 1992,175:323- 329.
(收稿日期：1999-10-08), http://www.100md.com