抗角蛋白自身抗体对家兔接触性皮炎的影响
http://www.100md.com
中华皮肤科杂志 2000年第5期第33卷
作者：李巍 李冰 刘玉峰 赵小东 李承新 黄慧
单位：710032西安，第四军医大学西京医院皮肤科
关键词：
中华皮肤科杂志000524
作为天然自身抗体(natural autoantibody,NAA)家族的一员，抗角蛋白自身抗体(antikeratin autoantibody, AK auto Ab )广泛存在于人和多种动物体内。现已明确NAA具有参与机体对外来损伤的非特异性防御、加速代谢产物的清除、抗炎等作
用[1]。众多学者在对 AK auto Ab 的研究中证实，其参与了机体和皮肤的多种生理和病理过程，对于维持表皮的自身稳定具有重要意义[2]。为了直接观察 AK auto Ab 对皮肤病理状态的影响，明确其在体内的作用，并使 AK auto Ab 的应用向临床过渡，我们对照观察了人 AK auto Ab 对家兔刺激性接触性皮炎的影响。
, http://www.100md.com
一、材料和方法
(一)试剂准备：按李承新等[3]的方法制备 AK auto Ab ，并应用盐析法从亲和纯化 AK auto Ab 后的混合正常人血清中提取丙种球蛋白。
(二)动物处理：取36只成年雄性新西兰白兔(体重1.5～2.5kg；本校实验动物中心提供)，按文献[4]用硫化钠溶液诱发刺激性接触性皮炎。随机将动物分为3组，每组12只，分别对应于 AK auto Ab 组、去除 AK auto Ab 的丙种球蛋白对照组(以下简称丙种球蛋白组)及空白对照组。肌内注射给药， AK auto Ab 组和丙种球蛋白组剂量为5mg/kg，空白对照组给予生理盐水注射。每天给药1次，连续给药12d。硫化钠作用前24h取家兔正常皮肤标本及耳静脉血，作用后8h、第3、7、12天取皮损及对侧正常皮肤标本和耳静脉血。采用盲法，具体操作者不知实验分组情况。
(三)皮肤反应强度分级标准：参照有关文献制定皮肤反应强度分级标准[5,6]。红斑：无反应为0，散在红点为0.5，非连续红斑为1.0，连续红斑为2.0，中度红斑为3.0，重度红斑为4.0。肿胀：无反应为0，轻度水肿为2.0，中度水肿为3.0，重度水肿为4.0。糜烂：无反应为0，轻度糜烂为4.0，中度糜烂为5.0，重度糜烂或溃疡为6.0。由3位未参与实验者进行评分，取其平均值。
, 百拇医药
(四)HE染色及有核细胞计数：冰冻切片，HE染色。高倍镜下每个标本在真皮浅层随机选5个视野，对真皮附属器以外的有核细胞计数，以进行有核细胞密度定量检测[7]。每张切片均由3人观察及评分，取其平均值。
(五)酶联免疫吸附试验：以本室制备人角蛋白为抗原,2%BSA37℃2h,倍比稀释血清4℃过夜,羊抗人IgG-HRP(华美公司)37℃1h,OPD显色，酶标检测仪测492nm吸光值[3]。
(六)S Ab C染色[7]：冰冻切片，冷丙酮固定30min，0.3%H2O2甲醇溶液室温20min，2%BSA37℃1h,1∶4000生物素标兔抗人IgG抗体(Pierce公司)4℃过夜，S Ab C复合物(博士德公司)37℃30min，D Ab 显色。
二、结果
, http://www.100md.com (一)大体观察：饱和硫化钠溶液作用于家兔皮肤立刻引起局部红斑、肿胀及少许糜烂，各组间反应较均匀一致；炎症于1～2d内达到高峰，之后炎症反应减弱，修复增强。各组皮肤反应强度分级及统计结果见表1。第1、3天各组间差异无显著性，第5天 AK auto Ab 组与空白对照组比较差异有显著性，第7～12天 AK auto Ab 组与两个对照组比较差异均有显著性。提示 AK auto Ab 组炎症消退速度明显快于两对照组，皮肤损伤修复快、愈合好。两对照组比较差异无显著性(统计结果未显示)。
(二)HE染色：硫化钠作用后8h，皮损表皮可见严重的细胞内水肿，细胞间水肿较轻；真皮水肿、毛细血管扩张，大量的炎症细胞浸润。炎症反应在3d以后开始减弱。以真皮浅层有核细胞记数来评价皮肤炎症反应强度。各组细胞数及统计结果见表2。第1、3天各组间差异无显著性，第7、12天 AK auto Ab 组与两对照组出现显著性差异。提示 AK auto Ab 组炎症反应消退速度明显快于两对照组。两对照组比较差异无显著性(统计结果未显示)。此外，丙种球蛋白组与空白对照组皮损表皮角质形成细胞增生，真皮成纤维细胞、胶原增生明显强于 AK auto Ab 组。
, 百拇医药
(三)ELISA： AK auto Ab 组动物血清中可检测到人 AK auto Ab 存在，滴度为1∶32～1∶64。丙种球蛋白组及空白对照组动物血清中未检测到人 AK auto Ab 。
表1抗角蛋白自身抗体对家兔刺激性接触性皮炎皮肤反应强度的影响(
±s)
组别
第1天
第3天
第5天
第7天
第9天
第12天
, 百拇医药
AK auto Ab 组
17.83±1.34
15.25±1.82
12.92±1.51
9.83±1.64
6.55±1.51
3.18±1.17
丙种球蛋白组
17.42±1.16
15.92±1.83
14.17±1.75
, http://www.100md.com 13.75±1.54
11.42±1.31
9.33±1.49
空白对照组
17.67±1.30
16.55±1.37
15.00±1.00
14.36±1.21
12.27±1.27
10.27±1.74
t1值
0.80
, http://www.100md.com
0.90
1.87
6.04
8.28
10.94
P1值
>0.05
>0.05
>0.05
<0.01
<0.01
<0.01
t2值
, http://www.100md.com
0.30
1.92
3.86
7.65
9.61
13.62
P2值
>0.05
>0.05
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
, http://www.100md.com
注： AK auto Ab 组与丙种球蛋白组比较结果为t1、P1，与空白对照组的比较结果为t2、P2
表2抗角蛋白自身抗体对家兔刺激性接触性皮炎皮损内有核细胞浸润数的影响(±s)
组别
第1天
第3天
第7天
第12天
AK auto Ab 组
378.7±78.3
355.1±63.3
, http://www.100md.com
167.0±44.6
47.18±23.7
丙种球蛋白组
353.7±64.2
340.3±50.8
288.5±45.9
154.0±21.3
空白对照组
355.7±69.5
350.1±51.3
306.9±30.6
172.9±16.4
, 百拇医药
t1值
0.85
0.63
6.55
11.38
P1值
>0.05
>0.05
<0.01
<0.01
t2值
0.76
0.50
, 百拇医药
11.78
14.47
P2值
>0.05
>0.05
<0.01
<0.01
注： AK auto Ab 组与丙种球蛋白组比较结果为t1、P1，与空白对照组的比较结果为t2、P2
(四)S Ab C：给药第7天以后 AK auto Ab 组动物皮损表皮角质形成细胞胞浆中可见染色，空白对照组和丙种球蛋白组未见染色，对侧正常皮肤表皮角质形成细胞内亦未见染色，提示 AK auto Ab 组动物皮损表皮角质形成细胞胞浆中有人 AK auto Ab 沉积。
, http://www.100md.com
三、讨论
本实验肉眼及光镜观察均显示 AK auto Ab 组动物皮肤炎症消退迅速，皮肤损伤修复快、愈合好，与对照组差异有显著性，而两对照组间差异无显著性。ELISA结果显示 AK auto Ab 组动物血清中人 AK auto Ab 持续存在。S Ab C染色显示动物表皮角质形成细胞内人 AK auto Ab 的沉积。以上结果提示人 AK auto Ab 参与了动物皮肤损伤的炎症及修复过程，并可能发挥了积极的作用。本实验采用去除 AK auto Ab 的丙种球蛋白作为对照，排除了 AK auto Ab 作为免疫球蛋白的非特异性作用。本文结果还显示人 AK auto Ab 具有同动物本身 AK auto Ab 相似的作用，进一步表明 AK auto Ab 积极参与了皮肤炎症反应，并可能起到了促进作用。同时提示不同种属间 AK auto Ab 可能具有较高的同源性和相似的生物学作用。
国家新药研究与产业化开发项目资助课题
, 百拇医药
参考文献
[1] Lacroix Desmazes S, Kaveri SV, Mouthon L,et al. Self reactive antibodies (natural autoantibodies) in healthy individuals. J Immunol Methods, 1998,216:117- 137.
[2] Liu YF, Liu YF, Zhang TS, et al. Immunohistochemical study of anti- keratin autoantibodies in both normal and pathological state. Chin Med J, 1993,106:393- 395.
[3]李承新,刘玉峰,刘彦仿,等.正常人血清中抗角蛋白自身抗体的提取与鉴定.中华皮肤科杂志,1995,28:248-249.
, 百拇医药
[4]刘玉峰,刘彦仿,丁华野,等.家兔皮炎抗角蛋白自身抗体的动态观察.中华皮肤科杂志,1990,23:248-249.
[5] Arlette JP, Fritzler MJ. Reduced skin threshold to irritation in the presence of allergic contact dermatitis in the guinea pigs. Contact Dermatitis,1984,11:31- 33.
[6] Roper SS, Jones HE. An animal model for altering the irritability threshold of normal skin. Contact Dermatitis,1985,13:91- 97. 肤性病学杂志,1992,6:8-9.
(收稿日期：1999-11-18), 百拇医药
单位：710032西安，第四军医大学西京医院皮肤科
关键词：
中华皮肤科杂志000524
作为天然自身抗体(natural autoantibody,NAA)家族的一员，抗角蛋白自身抗体(antikeratin autoantibody, AK auto Ab )广泛存在于人和多种动物体内。现已明确NAA具有参与机体对外来损伤的非特异性防御、加速代谢产物的清除、抗炎等作
用[1]。众多学者在对 AK auto Ab 的研究中证实，其参与了机体和皮肤的多种生理和病理过程，对于维持表皮的自身稳定具有重要意义[2]。为了直接观察 AK auto Ab 对皮肤病理状态的影响，明确其在体内的作用，并使 AK auto Ab 的应用向临床过渡，我们对照观察了人 AK auto Ab 对家兔刺激性接触性皮炎的影响。
, http://www.100md.com
一、材料和方法
(一)试剂准备：按李承新等[3]的方法制备 AK auto Ab ，并应用盐析法从亲和纯化 AK auto Ab 后的混合正常人血清中提取丙种球蛋白。
(二)动物处理：取36只成年雄性新西兰白兔(体重1.5～2.5kg；本校实验动物中心提供)，按文献[4]用硫化钠溶液诱发刺激性接触性皮炎。随机将动物分为3组，每组12只，分别对应于 AK auto Ab 组、去除 AK auto Ab 的丙种球蛋白对照组(以下简称丙种球蛋白组)及空白对照组。肌内注射给药， AK auto Ab 组和丙种球蛋白组剂量为5mg/kg，空白对照组给予生理盐水注射。每天给药1次，连续给药12d。硫化钠作用前24h取家兔正常皮肤标本及耳静脉血，作用后8h、第3、7、12天取皮损及对侧正常皮肤标本和耳静脉血。采用盲法，具体操作者不知实验分组情况。
(三)皮肤反应强度分级标准：参照有关文献制定皮肤反应强度分级标准[5,6]。红斑：无反应为0，散在红点为0.5，非连续红斑为1.0，连续红斑为2.0，中度红斑为3.0，重度红斑为4.0。肿胀：无反应为0，轻度水肿为2.0，中度水肿为3.0，重度水肿为4.0。糜烂：无反应为0，轻度糜烂为4.0，中度糜烂为5.0，重度糜烂或溃疡为6.0。由3位未参与实验者进行评分，取其平均值。
, 百拇医药
(四)HE染色及有核细胞计数：冰冻切片，HE染色。高倍镜下每个标本在真皮浅层随机选5个视野，对真皮附属器以外的有核细胞计数，以进行有核细胞密度定量检测[7]。每张切片均由3人观察及评分，取其平均值。
(五)酶联免疫吸附试验：以本室制备人角蛋白为抗原,2%BSA37℃2h,倍比稀释血清4℃过夜,羊抗人IgG-HRP(华美公司)37℃1h,OPD显色，酶标检测仪测492nm吸光值[3]。
(六)S Ab C染色[7]：冰冻切片，冷丙酮固定30min，0.3%H2O2甲醇溶液室温20min，2%BSA37℃1h,1∶4000生物素标兔抗人IgG抗体(Pierce公司)4℃过夜，S Ab C复合物(博士德公司)37℃30min，D Ab 显色。
二、结果
, http://www.100md.com (一)大体观察：饱和硫化钠溶液作用于家兔皮肤立刻引起局部红斑、肿胀及少许糜烂，各组间反应较均匀一致；炎症于1～2d内达到高峰，之后炎症反应减弱，修复增强。各组皮肤反应强度分级及统计结果见表1。第1、3天各组间差异无显著性，第5天 AK auto Ab 组与空白对照组比较差异有显著性，第7～12天 AK auto Ab 组与两个对照组比较差异均有显著性。提示 AK auto Ab 组炎症消退速度明显快于两对照组，皮肤损伤修复快、愈合好。两对照组比较差异无显著性(统计结果未显示)。
(二)HE染色：硫化钠作用后8h，皮损表皮可见严重的细胞内水肿，细胞间水肿较轻；真皮水肿、毛细血管扩张，大量的炎症细胞浸润。炎症反应在3d以后开始减弱。以真皮浅层有核细胞记数来评价皮肤炎症反应强度。各组细胞数及统计结果见表2。第1、3天各组间差异无显著性，第7、12天 AK auto Ab 组与两对照组出现显著性差异。提示 AK auto Ab 组炎症反应消退速度明显快于两对照组。两对照组比较差异无显著性(统计结果未显示)。此外，丙种球蛋白组与空白对照组皮损表皮角质形成细胞增生，真皮成纤维细胞、胶原增生明显强于 AK auto Ab 组。
, 百拇医药
(三)ELISA： AK auto Ab 组动物血清中可检测到人 AK auto Ab 存在，滴度为1∶32～1∶64。丙种球蛋白组及空白对照组动物血清中未检测到人 AK auto Ab 。
表1抗角蛋白自身抗体对家兔刺激性接触性皮炎皮肤反应强度的影响(
±s)组别
第1天
第3天
第5天
第7天
第9天
第12天
, 百拇医药
AK auto Ab 组
17.83±1.34
15.25±1.82
12.92±1.51
9.83±1.64
6.55±1.51
3.18±1.17
丙种球蛋白组
17.42±1.16
15.92±1.83
14.17±1.75
, http://www.100md.com 13.75±1.54
11.42±1.31
9.33±1.49
空白对照组
17.67±1.30
16.55±1.37
15.00±1.00
14.36±1.21
12.27±1.27
10.27±1.74
t1值
0.80
, http://www.100md.com
0.90
1.87
6.04
8.28
10.94
P1值
>0.05
>0.05
>0.05
<0.01
<0.01
<0.01
t2值
, http://www.100md.com
0.30
1.92
3.86
7.65
9.61
13.62
P2值
>0.05
>0.05
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
, http://www.100md.com
注： AK auto Ab 组与丙种球蛋白组比较结果为t1、P1，与空白对照组的比较结果为t2、P2
表2抗角蛋白自身抗体对家兔刺激性接触性皮炎皮损内有核细胞浸润数的影响(
±s)组别
第1天
第3天
第7天
第12天
AK auto Ab 组
378.7±78.3
355.1±63.3
, http://www.100md.com
167.0±44.6
47.18±23.7
丙种球蛋白组
353.7±64.2
340.3±50.8
288.5±45.9
154.0±21.3
空白对照组
355.7±69.5
350.1±51.3
306.9±30.6
172.9±16.4
, 百拇医药
t1值
0.85
0.63
6.55
11.38
P1值
>0.05
>0.05
<0.01
<0.01
t2值
0.76
0.50
, 百拇医药
11.78
14.47
P2值
>0.05
>0.05
<0.01
<0.01
注： AK auto Ab 组与丙种球蛋白组比较结果为t1、P1，与空白对照组的比较结果为t2、P2
(四)S Ab C：给药第7天以后 AK auto Ab 组动物皮损表皮角质形成细胞胞浆中可见染色，空白对照组和丙种球蛋白组未见染色，对侧正常皮肤表皮角质形成细胞内亦未见染色，提示 AK auto Ab 组动物皮损表皮角质形成细胞胞浆中有人 AK auto Ab 沉积。
, http://www.100md.com
三、讨论
本实验肉眼及光镜观察均显示 AK auto Ab 组动物皮肤炎症消退迅速，皮肤损伤修复快、愈合好，与对照组差异有显著性，而两对照组间差异无显著性。ELISA结果显示 AK auto Ab 组动物血清中人 AK auto Ab 持续存在。S Ab C染色显示动物表皮角质形成细胞内人 AK auto Ab 的沉积。以上结果提示人 AK auto Ab 参与了动物皮肤损伤的炎症及修复过程，并可能发挥了积极的作用。本实验采用去除 AK auto Ab 的丙种球蛋白作为对照，排除了 AK auto Ab 作为免疫球蛋白的非特异性作用。本文结果还显示人 AK auto Ab 具有同动物本身 AK auto Ab 相似的作用，进一步表明 AK auto Ab 积极参与了皮肤炎症反应，并可能起到了促进作用。同时提示不同种属间 AK auto Ab 可能具有较高的同源性和相似的生物学作用。
国家新药研究与产业化开发项目资助课题
, 百拇医药
参考文献
[1] Lacroix Desmazes S, Kaveri SV, Mouthon L,et al. Self reactive antibodies (natural autoantibodies) in healthy individuals. J Immunol Methods, 1998,216:117- 137.
[2] Liu YF, Liu YF, Zhang TS, et al. Immunohistochemical study of anti- keratin autoantibodies in both normal and pathological state. Chin Med J, 1993,106:393- 395.
[3]李承新,刘玉峰,刘彦仿,等.正常人血清中抗角蛋白自身抗体的提取与鉴定.中华皮肤科杂志,1995,28:248-249.
, 百拇医药
[4]刘玉峰,刘彦仿,丁华野,等.家兔皮炎抗角蛋白自身抗体的动态观察.中华皮肤科杂志,1990,23:248-249.
[5] Arlette JP, Fritzler MJ. Reduced skin threshold to irritation in the presence of allergic contact dermatitis in the guinea pigs. Contact Dermatitis,1984,11:31- 33.
[6] Roper SS, Jones HE. An animal model for altering the irritability threshold of normal skin. Contact Dermatitis,1985,13:91- 97. 肤性病学杂志,1992,6:8-9.
(收稿日期：1999-11-18), 百拇医药