急性硒中毒后小鼠肝细胞线粒体损伤的体视学研究
作者：曹晓哲 邢传平 高自芳 刘华福 董 亮
单位：兰州军区兰州总医院病理科，兰州 730050
关键词：硒中毒；小鼠；肝细胞；线粒体；超微结构；体视学
西北国防医学杂志990305 摘要：目的：对急性二氧化硒中毒所致肝细胞线粒体损伤进行定量研究，以利于临床合理使用硒制剂。方法：雄性BALB/C小鼠110只，随机分11组，每组10只。其中10组用于测定口服LD50，用改良寇氏法进行统计处理，求得小鼠口服LD50。剩余一组10只小鼠，再随机分为正常对照组与染毒组，每组5只。染毒组用二氧化硒(SeO2)，以小鼠口服LD50腹腔注射。两组均在1 h后处死。应用体视学方法对肝细胞的体密度(Vv)、比表面(δ)、面密度(Sv)、平均体积(V)和数密度(Nv)进行测算。结果：BALB/C小鼠的口服LD50为2.04 mg/kg。体视学结果显示：硒中毒后小鼠肝细胞线粒体与对照组相比，其比表面减小、平均体积增大及数密度降低(P<0.05)；而体密度和面密度则无显著性差异(P>0.05)。结论：硒中毒可直接导致肝细胞线粒体的损伤，表现为线粒体体积增大，数量减少，从而导致其功能降低。为以后更好地认识和预防硒中毒提供了基础病理资料。
, 百拇医药
中图分类号：R 595.2 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(1999)03-0169-02
Stereological study on the hepatocyte mitochondria damage of mice after acute selenium poisoning
CAO Xiao-zhe,XING Chuan-ping,GAO Zi-fang,et al.
(Department of Pathology,Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA 730050)
Abstract:Purpose:To study the morphological varieties of hepatocyte mitochondria damage in mice after selenium poiso ning with the view of stereology for the rational usage of selenium in clinic. Methods:110 male BALB/C mice were randomly divided into 11 groups. 10 groups were determined for the oral LD50 by karbers method,and the remnant ten were randomly divided into normal contrast group and selenium poisoning group which was injected selenium dioxide(oral LD50) in abdominal cavity.Mice of two groups were executed after one hour,The volume density(Vv),specific surface(δ),surface density(Sv),mean volume(V) and numerical density(Nv) of mitochondria were stereologically analysed. Results:Oral LD50 of BALB/C mice was 2.04 mg/kg.δ and Nv of mitochondria were decreased and V was increased after selenium poisoning.There were significant differences between selenium poisoning group and normal contrast group(P<0.05),but Vv and Sv of mitochondria hadnt significant differences between two groups(P>0.05). Conclusion:Selenium poisoning can directly lead to hepatocyte mitochondria damage.Mitochondria morphological varieties of mice after acute selenium poisoning demonstrate V increasing,δ and Nv decreasing,the function of hepatocyte mitochondria being weakened.It provides a new clue for recognition and prevention of selenium poisoning thereafter.
, 百拇医药
Key words:Selenium Poisoning；Mouse(BALB/C) ；Hepatocyte；Mitochondria；Ultrastructure；Stereology
作为必需营养元素硒，各国学者对其缺乏的研究进展迅速，发现硒缺乏与克山病、白肌病、缺血性心肌病、高血压、关节炎、衰老、白内障、不孕、肿瘤等疾病有关[1]。随着研究的深入，特别是含硒药物及其保健品的滥用，使人们的视野正逐渐从缺硒扩展到硒中毒领域。但国内多为地方性硒中毒(有机硒)的报道[2]，只有梁子东[3]在1994年报道硒化物中毒10例，至今未见无机硒中毒研究的有关文献。所以本实验力图在这一方面有所发现，以利于临床更加合理地使用硒制剂。
1 材料和方法
1.1 测定小鼠口服LD50：雄性BALB/C小鼠100只(兰州生物制品研究所提供)，体重18～24 g，笼养在18±0.5℃下，自然光照，自由进食。随机分10组，每组10只。用于测定二氧化硒(SeO2)(上海金山县兴塔化工厂，批号861008)口服LD50，染毒剂量由最大5.159 mg/kg，等比级数1.2倍，依次分为10组。观察24 h内小鼠死亡情况及中毒表现，用改良寇氏法进行统计处理，求得小鼠口服LD50[4]。
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1.2 电镜样品的制备及显微照片的拍摄：再取雄性BALB/C小鼠10只，随机分为正常对照组与染毒组，每组5只。染毒组在12：00时，用二氧化硒同生理盐水配制成0.1 mg/ml的溶液，以小鼠口服LD50mg/kg，腹腔注射。对照组注射同等体积的生理盐水。两组均在1 h后处死，立即取肝脏左前叶边缘部一小块。常规透射电镜样品固定、包埋、超薄切片及染色。每只小鼠包埋6块，随机取3个包埋块，用LKB-V型超薄切片机切片，捞于两张载网上，在JEM-1200EX透射电镜下，每张载网选定一张切片，随机拍摄肝细胞胞浆的10 000倍照片两张，每只鼠得照片12张，每组60张。拍照前用光栅复型对电镜的放大倍率进行校正。
1.3 体视学方法：所有照片采用Weibel的点计数法，测算了两组小鼠肝细胞线粒体的体密度(Vv)，比表面(δ)，面密度(Sv)，平均体积(V)和数密度(Nv)。具体方法见文献[5，6]。所有数据用北京医科大学郑富盛教授的体视学软件处理，并进行t检验。
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2 结 果
2.1 定性观察：光镜下：对照组肝细胞大小均匀，核大小一致，胞浆丰富、红染、均质状。染毒组肝细胞水肿，以颗粒变性为特征，肝细胞浆内可见多量的嗜酸性细颗粒。
电镜下：对照组肝细胞胞浆丰富，中等电子密度，可见多量的成簇的、花瓣样排列的糖原颗粒；线粒体大小均匀，嵴清晰，嵴上基粒可见；内质网丰富，粗面内质网主要分布在线粒体之间，滑面内质网则主要分布在糖原区；高尔基体偶见，多位于核周及胞膜下。染毒组肝细胞水肿，电子密度降低；糖原颗粒减少，且散在于胞浆内；线粒体减少，体积增大，部分膜破裂，嵴溶解、断裂，脱颗粒明显，髓样体形成；粗面内质网减少，以脱颗粒为主；滑面内质网扩张，部分呈小囊状。
2.2 定量结果
染毒组肝细胞线粒体的δ减小、V增大、Nv减少，与对照组相比P<0.05。而染毒组线粒体的Vv和Sv与对照组相比则未见显著性差异(见表1)。
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表1 线粒体的Vv、δ、Sv、V和Nv(
±
) 组别
Vv(μm3/μm3)
δ(μm2/μm3)
Sv(μm2/μm3)
V(μm3)
Nv(1/μm3)
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对照组
0.1920±0.0087
8.5908±0.2709
1.6496±0.0667
0.3954±0.0374
0.6774±0.0321
染毒组
0.1864±0.0058
6.2376±0.1813
1.5465±0.0732
0.4824±0.041
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0.4356±0.0272
与对照组比P<0.05
3 讨 论
二氧化硒(SeO2)为无色结晶，分子量110.96，比重3.95，立即溶于水形成亚硒酸。Beyer[7]在1987年报道了一例二氧化硒中毒死亡。
硒中毒可致小鼠肝细胞水肿，颗粒变性。其光镜下的粉染颗粒，为增大的线粒体及扩张的内质网。亚细胞结构的改变，以线粒体最为敏感，其平均体积增大(P<0.05)，嵴溶解、断裂，脱颗粒，都提示其功能的降低[6，9]，而线粒体的比表面因是线粒体的表面积与体积之比，不仅和线粒体的大小有关，而且还和它的形状有关。正常状态下，细胞内提供生物能源的主要途径为呼吸作用，线粒体是进行呼吸作用和能量转换的重要场所。线粒体的比表面可以表明其与周围环境接触的程度。比表面大表示线粒体的物质交换面积大，是功能旺盛的表现之一；反之，则是功能减弱的表现。因此，从线粒体比表面来看，硒中毒后肝线粒体的比表面减小(P<0.05)，同样表明硒中毒后线粒体功能减弱。再加上硒中毒后线粒体数密度的降低(P<0.05)，均说明硒中毒后肝线粒体的损伤明显，且功能降低。
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而染毒组肝细胞线粒体的体密度、面密度与对照组相比无显著性差异(P>0.05)，这主要与线粒体数量减少、抵消了线粒体体积增大对体密度的影响及线粒体体积的增大、并不能成比例地引起线粒体面密度的变化有关。
对于硒引起机体中毒的机制，目前认为是硒和硫化物的性质相似，在高等动物体内存在竞争作用，故过量的硒摄入，可以取代体内含硫化物中的硫形成硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸，从而抑制了巯基酶的活性，直接或间接作用于细胞氧化的辅酶GSH、辅酶Q、辅酶A及二氢硫辛酸[1]，进而影响细胞的有氧氧化过程。而线粒体是细胞有氧氧化合成ATP的场所，由于有氧氧化酶的活性降低，将直接影响合成ATP的能力，ATP生成的减少，将直接导致线粒体形态的改变；细胞膜上离子泵由于供能不足而效率低下，引起细胞内水钠潴留、细胞水肿；以及内质网扩张、粗面内质网脱颗粒[6]。而糖原颗粒的减少，则是由于ATP供应不足，无氧酵解代偿性加强，糖原分解加速所致。
肝细胞内滑面内质网的增生，主要是硒中毒引起的解毒性反应。因滑面内质网系毒物与某些细胞内的酶类相互作用的界面，由于毒性刺激使酶代谢活性升高致使滑面内质网增生[8]。
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总之，硒中毒可直接导致肝细胞线粒体的损伤，表现为线粒体体积增大，数量减少，从而导致其功能降低。为以后更好地认识和预防硒中毒提供了基础病理资料。
基金项目：全军“九五”医学科研规划青年基金课题项目(98Q010)
作者简介：曹晓哲(1965-)，男，硕士研究生，副主任医师
参考文献：
[1]曹晓哲，钱震，哈英娣，等.硒中毒的研究概况[J].微量元素与健康研究，1995，12(5)：71-72.
[2]毛大均，苏宏灿，汪永鑫，等.高硒炭质页岩风化及燃烧导致硒中毒的初步研究[J].中国地方病学杂志，1988，7(5)：297-298.
[3]梁子东.急性硒化物中毒10例[J].中华劳动卫生职业病杂志，1994，(6)：364-365.
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[4]朱蓓蕾.动物毒理学[M].上海：上海科学技术出版社，1989.37-41.
[5]Weibel ER.Stereological methods vol.l practical methods for biological morphometry[M].London:Academic Press,1979.101-102.
[6]曹晓哲，卜积康，钱震.体视学分析小鼠肝细胞的时间形态学研究[J].中华物理医学杂志，1994，16(2)：65-66.
[7]Beyer KH.二氧化硒中毒死亡[J].国外学者来访报告，1987，(2)：38-39.
[8]张淑英，陆国才，刘俊平，等.酮康唑连续给药对犬肝毒性的病理学观察[J].解剖学杂志，1996，19(1)：71-72.
[9]郑淑芳，张瑞祥，郑纪宁，等.慢性氟中毒大鼠肝细胞超微结构改变的体视学研究[J].中国地方病防治杂志，1995，10(1)：4-5.
收稿日期：1999-04-16, http://www.100md.com
单位：兰州军区兰州总医院病理科，兰州 730050
关键词：硒中毒；小鼠；肝细胞；线粒体；超微结构；体视学
西北国防医学杂志990305 摘要：目的：对急性二氧化硒中毒所致肝细胞线粒体损伤进行定量研究，以利于临床合理使用硒制剂。方法：雄性BALB/C小鼠110只，随机分11组，每组10只。其中10组用于测定口服LD50，用改良寇氏法进行统计处理，求得小鼠口服LD50。剩余一组10只小鼠，再随机分为正常对照组与染毒组，每组5只。染毒组用二氧化硒(SeO2)，以小鼠口服LD50腹腔注射。两组均在1 h后处死。应用体视学方法对肝细胞的体密度(Vv)、比表面(δ)、面密度(Sv)、平均体积(V)和数密度(Nv)进行测算。结果：BALB/C小鼠的口服LD50为2.04 mg/kg。体视学结果显示：硒中毒后小鼠肝细胞线粒体与对照组相比，其比表面减小、平均体积增大及数密度降低(P<0.05)；而体密度和面密度则无显著性差异(P>0.05)。结论：硒中毒可直接导致肝细胞线粒体的损伤，表现为线粒体体积增大，数量减少，从而导致其功能降低。为以后更好地认识和预防硒中毒提供了基础病理资料。
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中图分类号：R 595.2 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(1999)03-0169-02
Stereological study on the hepatocyte mitochondria damage of mice after acute selenium poisoning
CAO Xiao-zhe,XING Chuan-ping,GAO Zi-fang,et al.
(Department of Pathology,Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA 730050)
Abstract:Purpose:To study the morphological varieties of hepatocyte mitochondria damage in mice after selenium poiso ning with the view of stereology for the rational usage of selenium in clinic. Methods:110 male BALB/C mice were randomly divided into 11 groups. 10 groups were determined for the oral LD50 by karbers method,and the remnant ten were randomly divided into normal contrast group and selenium poisoning group which was injected selenium dioxide(oral LD50) in abdominal cavity.Mice of two groups were executed after one hour,The volume density(Vv),specific surface(δ),surface density(Sv),mean volume(V) and numerical density(Nv) of mitochondria were stereologically analysed. Results:Oral LD50 of BALB/C mice was 2.04 mg/kg.δ and Nv of mitochondria were decreased and V was increased after selenium poisoning.There were significant differences between selenium poisoning group and normal contrast group(P<0.05),but Vv and Sv of mitochondria hadnt significant differences between two groups(P>0.05). Conclusion:Selenium poisoning can directly lead to hepatocyte mitochondria damage.Mitochondria morphological varieties of mice after acute selenium poisoning demonstrate V increasing,δ and Nv decreasing,the function of hepatocyte mitochondria being weakened.It provides a new clue for recognition and prevention of selenium poisoning thereafter.
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Key words:Selenium Poisoning；Mouse(BALB/C) ；Hepatocyte；Mitochondria；Ultrastructure；Stereology
作为必需营养元素硒，各国学者对其缺乏的研究进展迅速，发现硒缺乏与克山病、白肌病、缺血性心肌病、高血压、关节炎、衰老、白内障、不孕、肿瘤等疾病有关[1]。随着研究的深入，特别是含硒药物及其保健品的滥用，使人们的视野正逐渐从缺硒扩展到硒中毒领域。但国内多为地方性硒中毒(有机硒)的报道[2]，只有梁子东[3]在1994年报道硒化物中毒10例，至今未见无机硒中毒研究的有关文献。所以本实验力图在这一方面有所发现，以利于临床更加合理地使用硒制剂。
1 材料和方法
1.1 测定小鼠口服LD50：雄性BALB/C小鼠100只(兰州生物制品研究所提供)，体重18～24 g，笼养在18±0.5℃下，自然光照，自由进食。随机分10组，每组10只。用于测定二氧化硒(SeO2)(上海金山县兴塔化工厂，批号861008)口服LD50，染毒剂量由最大5.159 mg/kg，等比级数1.2倍，依次分为10组。观察24 h内小鼠死亡情况及中毒表现，用改良寇氏法进行统计处理，求得小鼠口服LD50[4]。
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1.2 电镜样品的制备及显微照片的拍摄：再取雄性BALB/C小鼠10只，随机分为正常对照组与染毒组，每组5只。染毒组在12：00时，用二氧化硒同生理盐水配制成0.1 mg/ml的溶液，以小鼠口服LD50mg/kg，腹腔注射。对照组注射同等体积的生理盐水。两组均在1 h后处死，立即取肝脏左前叶边缘部一小块。常规透射电镜样品固定、包埋、超薄切片及染色。每只小鼠包埋6块，随机取3个包埋块，用LKB-V型超薄切片机切片，捞于两张载网上，在JEM-1200EX透射电镜下，每张载网选定一张切片，随机拍摄肝细胞胞浆的10 000倍照片两张，每只鼠得照片12张，每组60张。拍照前用光栅复型对电镜的放大倍率进行校正。
1.3 体视学方法：所有照片采用Weibel的点计数法，测算了两组小鼠肝细胞线粒体的体密度(Vv)，比表面(δ)，面密度(Sv)，平均体积(V)和数密度(Nv)。具体方法见文献[5，6]。所有数据用北京医科大学郑富盛教授的体视学软件处理，并进行t检验。
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2 结 果
2.1 定性观察：光镜下：对照组肝细胞大小均匀，核大小一致，胞浆丰富、红染、均质状。染毒组肝细胞水肿，以颗粒变性为特征，肝细胞浆内可见多量的嗜酸性细颗粒。
电镜下：对照组肝细胞胞浆丰富，中等电子密度，可见多量的成簇的、花瓣样排列的糖原颗粒；线粒体大小均匀，嵴清晰，嵴上基粒可见；内质网丰富，粗面内质网主要分布在线粒体之间，滑面内质网则主要分布在糖原区；高尔基体偶见，多位于核周及胞膜下。染毒组肝细胞水肿，电子密度降低；糖原颗粒减少，且散在于胞浆内；线粒体减少，体积增大，部分膜破裂，嵴溶解、断裂，脱颗粒明显，髓样体形成；粗面内质网减少，以脱颗粒为主；滑面内质网扩张，部分呈小囊状。
2.2 定量结果
染毒组肝细胞线粒体的δ减小、V增大、Nv减少，与对照组相比P<0.05。而染毒组线粒体的Vv和Sv与对照组相比则未见显著性差异(见表1)。
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表1 线粒体的Vv、δ、Sv、V和Nv(
±) 组别Vv(μm3/μm3)
δ(μm2/μm3)
Sv(μm2/μm3)
V(μm3)
Nv(1/μm3)
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对照组
0.1920±0.0087
8.5908±0.2709
1.6496±0.0667
0.3954±0.0374
0.6774±0.0321
染毒组
0.1864±0.0058
6.2376±0.1813
1.5465±0.0732
0.4824±0.041
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0.4356±0.0272
与对照组比P<0.05
3 讨 论
二氧化硒(SeO2)为无色结晶，分子量110.96，比重3.95，立即溶于水形成亚硒酸。Beyer[7]在1987年报道了一例二氧化硒中毒死亡。
硒中毒可致小鼠肝细胞水肿，颗粒变性。其光镜下的粉染颗粒，为增大的线粒体及扩张的内质网。亚细胞结构的改变，以线粒体最为敏感，其平均体积增大(P<0.05)，嵴溶解、断裂，脱颗粒，都提示其功能的降低[6，9]，而线粒体的比表面因是线粒体的表面积与体积之比，不仅和线粒体的大小有关，而且还和它的形状有关。正常状态下，细胞内提供生物能源的主要途径为呼吸作用，线粒体是进行呼吸作用和能量转换的重要场所。线粒体的比表面可以表明其与周围环境接触的程度。比表面大表示线粒体的物质交换面积大，是功能旺盛的表现之一；反之，则是功能减弱的表现。因此，从线粒体比表面来看，硒中毒后肝线粒体的比表面减小(P<0.05)，同样表明硒中毒后线粒体功能减弱。再加上硒中毒后线粒体数密度的降低(P<0.05)，均说明硒中毒后肝线粒体的损伤明显，且功能降低。
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而染毒组肝细胞线粒体的体密度、面密度与对照组相比无显著性差异(P>0.05)，这主要与线粒体数量减少、抵消了线粒体体积增大对体密度的影响及线粒体体积的增大、并不能成比例地引起线粒体面密度的变化有关。
对于硒引起机体中毒的机制，目前认为是硒和硫化物的性质相似，在高等动物体内存在竞争作用，故过量的硒摄入，可以取代体内含硫化物中的硫形成硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸，从而抑制了巯基酶的活性，直接或间接作用于细胞氧化的辅酶GSH、辅酶Q、辅酶A及二氢硫辛酸[1]，进而影响细胞的有氧氧化过程。而线粒体是细胞有氧氧化合成ATP的场所，由于有氧氧化酶的活性降低，将直接影响合成ATP的能力，ATP生成的减少，将直接导致线粒体形态的改变；细胞膜上离子泵由于供能不足而效率低下，引起细胞内水钠潴留、细胞水肿；以及内质网扩张、粗面内质网脱颗粒[6]。而糖原颗粒的减少，则是由于ATP供应不足，无氧酵解代偿性加强，糖原分解加速所致。
肝细胞内滑面内质网的增生，主要是硒中毒引起的解毒性反应。因滑面内质网系毒物与某些细胞内的酶类相互作用的界面，由于毒性刺激使酶代谢活性升高致使滑面内质网增生[8]。
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总之，硒中毒可直接导致肝细胞线粒体的损伤，表现为线粒体体积增大，数量减少，从而导致其功能降低。为以后更好地认识和预防硒中毒提供了基础病理资料。
基金项目：全军“九五”医学科研规划青年基金课题项目(98Q010)
作者简介：曹晓哲(1965-)，男，硕士研究生，副主任医师
参考文献：
[1]曹晓哲，钱震，哈英娣，等.硒中毒的研究概况[J].微量元素与健康研究，1995，12(5)：71-72.
[2]毛大均，苏宏灿，汪永鑫，等.高硒炭质页岩风化及燃烧导致硒中毒的初步研究[J].中国地方病学杂志，1988，7(5)：297-298.
[3]梁子东.急性硒化物中毒10例[J].中华劳动卫生职业病杂志，1994，(6)：364-365.
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[4]朱蓓蕾.动物毒理学[M].上海：上海科学技术出版社，1989.37-41.
[5]Weibel ER.Stereological methods vol.l practical methods for biological morphometry[M].London:Academic Press,1979.101-102.
[6]曹晓哲，卜积康，钱震.体视学分析小鼠肝细胞的时间形态学研究[J].中华物理医学杂志，1994，16(2)：65-66.
[7]Beyer KH.二氧化硒中毒死亡[J].国外学者来访报告，1987，(2)：38-39.
[8]张淑英，陆国才，刘俊平，等.酮康唑连续给药对犬肝毒性的病理学观察[J].解剖学杂志，1996，19(1)：71-72.
[9]郑淑芳，张瑞祥，郑纪宁，等.慢性氟中毒大鼠肝细胞超微结构改变的体视学研究[J].中国地方病防治杂志，1995，10(1)：4-5.
收稿日期：1999-04-16, http://www.100md.com