FGF、FN在临床创面愈合过程中变化的研究
作者：谷廷敏 牛星焘 郭宏 王玉舟 建春 孙志刚
单位：谷廷敏 郭宏 王玉舟 刘建春 孙志刚：白求恩国际和平医院烧伤整形科，河北 石家庄 050082；牛星焘：北京医科大学三院
关键词：创伤；创面愈合；成纤维细胞生长因子；纤维连接蛋白；免疫组织化学
西北国防医学杂志990407 摘要：目的：探讨内源性FGF、FN变化在创面愈合过程中的作用。方法：取25例中厚断层供皮区创面病人术后4 d、10 d和16 d时创面组织行HE和ABC免疫组织化学染色对照创面大体变化，观察创面愈合过程中内源性FGF、FN的变化及其与组织修复的关系。结果：伤后10 d时内源性FGF、FN表达明显，伤后4 d和16 d时表达较弱。FGF和FN的变化和创面愈合的组织学变化较一致。结论：内源性FGF、FN变化为机体的生理变化，可以促进修复，也可避免疤痕形成。
, http://www.100md.com
中图分类号：R 644 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(1999)04-0257-03
Clinic study on the changes of endogenous FGF and FN during wound healing
CU Ting-min,NIU Xing-tao,GUO Hong,et al.
(Department of burn and plastic surgery,Bethune International Peace Hospital,050082)
Abstract:Purpose:To explore the effect of endogenous FGF and FN on the wound healing.Methods:This study detected the expression of FGF and FN during the 4 day,10 day and 16 day of wound healing with ABC immunohistochemistry staining in the 25 patients.Results:There were remarkab exprexssion of endogenous FGF and FN on the 10 day of the wound healing,there were slight expression of endogenous FGF and FN on the 4 day and 16 day of wound healing.Conclusion:The changes of endogenous FGF and FN,as a physiological changes during the wound healing，can promote repair and avoid scar formation.
, 百拇医药
Key words:Trauma; Wound Healing; Fibroblast Growth Factor; Fibronectin; Immunohistochemistry
创面愈合过程是一个极其复杂的病理过程，涉及了机体的许多病理变化，如出血、凝血、修复、重建等。许多研究表明：生长因子可以促进创面的愈合，加快组织的修复[1]。我们曾报道：大鼠供皮区创面愈合过程中组织内源性成纤维细胞生长因子(FGF)的变化，且与创面修复有关[2]。我们又观察了人供皮区创面愈合过程中FGF和纤维连接蛋白(FN)变化，探讨其与组织修复的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本留取：选取烧伤或整形病人中厚断层供皮创面共25例，男15例，女10例；年龄18～50岁。病人无特殊和其它慢性疾患。创面位于大腿和下腹部。征得病人同意，分别于术后4 d、10 d和16 d时局麻下用眼科角膜环钻切取包括创面、创基及少许皮下脂肪在内的标本，正常皮肤作为对照。
, 百拇医药
1.1.2 主要试剂：鼠抗人FGF、兔抗人FN抗体(1：100)；兔抗鼠和羊抗兔生物素化Ig(1：200)，ABC免疫复合物(1：100)。
1.2 方法
1.2.1 留取标本，马上置于4%多聚甲醛固定，脱水透明，石蜡包埋，切成5 μm的薄片，烤片后脱蜡浸水，分别行HE染色，观察组织学变化和ABC免疫组织化学染色，观察组织内FGF和FN蛋白的变化。
1.2.2 创面大体观察：肉眼观察创面表面渗液、渗血情况，以及创面、创缘新生上皮增生情况。
1.2.3 组织学观察
1.2.3.1 HE染色：组织薄片入水后，分别行苏木精、伊红染色，脱水透明封片进行观察。
1.2.3.2 ABC免疫组织化学染色：组织薄片入磷酸缓冲液5 min3次，0.3%H2O2甲醇20 min，二抗血清37℃30 min，一抗4℃过夜，Biotin二抗和ABC复合物37℃各30 min，DBA显色2～7 min。
, 百拇医药
1.2.3.3 光镜观察：在低倍和高倍镜下，分别观察组织结构变化和FGF和FN蛋白的表达变化。免疫组化结果判断以棕黄色阳性细胞在40倍镜下表达情况而分为阴性(视野内无阳性细胞)，弱阳性(视野内可见10个以下阳性细胞)，阳性(阳性细胞在11～30个)，强阳性表达(阳性细胞多于30个)。
2 结果
2.1 创面大体观察：伤后4 d，创面表面仍有明显的渗液和少量渗血，创缘、创基新生上皮不明显。伤后10 d，创面表面有少量渗液，创缘及部分创基已有菲薄的新生上皮，上皮易被撕脱。伤后16 d，大部创面均有薄的新生上皮覆盖，但肉眼仍可见少量创基渗液和上皮不明显。
2.2 一般组织学变化：HE染色正常皮肤光镜下表皮厚度约4～5层细胞。基底细胞完整排列在基底膜，为低柱状，棘细胞和颗粒细胞层约3～4层，表皮角质蛋白较厚。真皮内可见毛囊、汗腺、皮脂腺和少量的纤维细胞、毛细血管。伤后4 d创缘处表皮细胞可见轻度增生，基底细胞排列紧密，真皮内较多的成纤维细胞和毛细血管。伤后10 d，创缘表皮进一步增厚，细胞层数增多，可见散在的表皮细胞迁移，离开创缘覆盖在创缘附近的创面上，皮肤附属器的上皮向创面表面迁移，覆盖创面形成菲薄的上皮层，真皮内成纤维细胞和毛细血管进一步增多(图1)。伤后16 d，创面表面基本上皮化，部分创面表面上皮较薄，无明显的皮肤附属器官，成纤维细胞数量较伤后10 d减少，毛细血管仍较多，真皮内可见粗大的胶原排列密集，平行于表皮，真皮层增厚。
, 百拇医药
图1 伤后10 d，创缘表皮增厚，表皮细胞迁移覆盖在
创缘附近的创面上，皮肤附属器上皮向创面迁移形成菲薄
的上皮层，真皮内成纤维细胞和毛细血管增多(HE 100×)
2.3 FGF、FN免疫组织化学变化
2.3.1 FGF表达变化：正常皮肤内无明显的FGF免疫组化阳性信号。伤后4 d，创面浅层、创缘与真皮连接处有较多的阳性细胞，棕黄色呈胞浆分布、胞核着色较浅，单个散在分布，多数为炎性细胞，少数为成纤维细胞。表面强度达弱阳性～阳性(图2)。伤后10 d，表达较前明显增强，达强阳性，可见许多聚集的阳性细胞；全层真皮内有些成纤维细胞、血管内皮细胞均有一定的表达(图3)。伤后16 d，表达弱阳性，主要分布于真皮部分成纤维细胞内，上皮或内皮细胞基本无表达(图4)。
, 百拇医药
图2 伤后4 d，FGF在创面表达强度达弱阳性～阳性。
阳性细胞呈棕黄色胞浆分布，散布单个分布，多为炎性
细胞，也有成纤维细胞(ABC法 400×)
图3 伤后10 d，FGF表达呈强阳性，可见许多聚集
的阳性细胞存在于创面内，成纤维细胞和内皮细胞
均有一定表达(ABC法 400×)
图4 伤后16 d，FGF表达呈弱阳性，主要分布于真皮内成纤维细胞
, 百拇医药
(ABC法 400×)
2.3.2 FN表达变化：正常皮肤细胞内FN为弱阳性表达，主要分布于基底细胞和少数成纤维细胞。伤后FN表达情况类似于FGF。伤后4 d，FN表达强度可达阳性，表达部位基本相同于伤后4d FGF表达部位，创缘上皮基底细胞较明显，部分真皮内成纤维细胞和炎性细胞也有表达。伤后10 d，FN表达较伤后4 d表达增强，达强阳性，部位仍以创缘上皮细胞、真皮内皮细胞和成纤维细胞表达为主。伤后16 d表达减弱，以上皮基底细胞和真皮浅中层的成纤维细胞为主。强度稍强于正常皮肤，达弱阳性～阳性。
3 讨论
FGF为细胞有丝分裂刺激原，可以加快细胞分裂、促进增殖、改变细胞的趋化性、增加细胞的迁移，创面愈合过程中应用FGF可明显增加创面内胶原和细胞DNA含量，加速创面愈合[3，4]。组织FN是真皮基质中的一种非胶原糖蛋白，在皮肤组织中可以由成纤维细胞、上皮或内皮细胞产生并具有多种生物功能，在创面愈合中可以促进成纤维细胞、上皮细胞的迁移、加速肉芽组织生长，加快创面愈合[5]。
, 百拇医药
本研究组织学观察表明：伤后4 d，创缘和真皮内附属器官的上皮已出现增殖，上皮细胞明显迁移，覆盖创面；伤后10 d，上皮增殖明显，成纤维细胞功能活跃，毛细血管丰富；伤后16 d，创面表面已上皮化，细胞增殖减轻、成纤维细胞数量和功能下降。本研究免疫组织化学结果表明：创面愈合过程中FGF、FN蛋白表达较为一致，均以伤后10 d时强阳性表达，伤后4 d或16 d时，表达强度减弱，为弱阳性或阳性表达。FGF、FN的这些变化与组织学变化较为吻合：伤后10 d时，创面上皮化明显、上皮覆盖加速，各种细胞功能活跃，而创面内FGF、FN表达也最明显，伤后4 d或16 d时，创面修复不明显或已近完成时，创面内FGF、FN蛋白表达相对较弱。从表达部位来看，两种蛋白均以创缘上皮、创面浅层的皮肤附属器官上皮、血管内皮、成纤维细胞表达明显。FGF、FN在这些创面修复细胞增殖的活跃部位内高表达，表明了内源性FGF、FN蛋白在创面愈合中的规律变化，提示两者共同参与了创面愈合的调控。
本研究结果表现的FGF、FN同期表达，且与大体观察及组织学变化相一致，反映了机体调控创面愈合作为一种生理反应，在创面愈合早期，机体为修复进行准备、发生细微的变化，FGF、FN蛋白含量亦少；当达到一定阶段，FGF、FN蛋白表达增强，细胞增殖明显，组织结构变化较大；当创面愈合近于完成时，上皮覆盖创面，内在抑制机制产生作用，FGF、FN蛋白表达减弱，含量减少，引起细胞增殖减慢。FGF、FN这种生理变化作用有利于组织修复，也可避免过度增殖、形成疤痕。临床一些难愈合创面或过度疤痕增生可能和内源性FGF、FN的不正常变化有关。而这种生理变化的机制有待进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39370693)
作者简介：谷廷敏(1959-)，男，博士，副主任医师
参考文献：
[1]Mary HM.Peptide growth factor and wound healing[J].Clin plas Surg，1990，17：421-422.
[2]谷廷敏，牛星焘，陈东明.创面愈合过程中内源性FGF的研究[J].实用美容整形外科杂志，1997，8：327-328.
[3]Michael J.Fibroblast growth factor receptor tyrosine kinase molecular analysis and signal transduction[J].Biochem Biophys Acta，1992，1153：185-186.
[4]Editorials.Enhancement of wound healing by growth factors[J].New Engl Medi，1989，324：453-454.
[5]Grinnell F,Billingham R,Burgess L.Distribution of fibronection during wound healing in vivo[J].J Invest Dermatol，1981，76：181-182.
收稿日期：1999-08-08, 百拇医药
单位：谷廷敏 郭宏 王玉舟 刘建春 孙志刚：白求恩国际和平医院烧伤整形科，河北 石家庄 050082；牛星焘：北京医科大学三院
关键词：创伤；创面愈合；成纤维细胞生长因子；纤维连接蛋白；免疫组织化学
西北国防医学杂志990407 摘要：目的：探讨内源性FGF、FN变化在创面愈合过程中的作用。方法：取25例中厚断层供皮区创面病人术后4 d、10 d和16 d时创面组织行HE和ABC免疫组织化学染色对照创面大体变化，观察创面愈合过程中内源性FGF、FN的变化及其与组织修复的关系。结果：伤后10 d时内源性FGF、FN表达明显，伤后4 d和16 d时表达较弱。FGF和FN的变化和创面愈合的组织学变化较一致。结论：内源性FGF、FN变化为机体的生理变化，可以促进修复，也可避免疤痕形成。
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中图分类号：R 644 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(1999)04-0257-03
Clinic study on the changes of endogenous FGF and FN during wound healing
CU Ting-min,NIU Xing-tao,GUO Hong,et al.
(Department of burn and plastic surgery,Bethune International Peace Hospital,050082)
Abstract:Purpose:To explore the effect of endogenous FGF and FN on the wound healing.Methods:This study detected the expression of FGF and FN during the 4 day,10 day and 16 day of wound healing with ABC immunohistochemistry staining in the 25 patients.Results:There were remarkab exprexssion of endogenous FGF and FN on the 10 day of the wound healing,there were slight expression of endogenous FGF and FN on the 4 day and 16 day of wound healing.Conclusion:The changes of endogenous FGF and FN,as a physiological changes during the wound healing，can promote repair and avoid scar formation.
, 百拇医药
Key words:Trauma; Wound Healing; Fibroblast Growth Factor; Fibronectin; Immunohistochemistry
创面愈合过程是一个极其复杂的病理过程，涉及了机体的许多病理变化，如出血、凝血、修复、重建等。许多研究表明：生长因子可以促进创面的愈合，加快组织的修复[1]。我们曾报道：大鼠供皮区创面愈合过程中组织内源性成纤维细胞生长因子(FGF)的变化，且与创面修复有关[2]。我们又观察了人供皮区创面愈合过程中FGF和纤维连接蛋白(FN)变化，探讨其与组织修复的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本留取：选取烧伤或整形病人中厚断层供皮创面共25例，男15例，女10例；年龄18～50岁。病人无特殊和其它慢性疾患。创面位于大腿和下腹部。征得病人同意，分别于术后4 d、10 d和16 d时局麻下用眼科角膜环钻切取包括创面、创基及少许皮下脂肪在内的标本，正常皮肤作为对照。
, 百拇医药
1.1.2 主要试剂：鼠抗人FGF、兔抗人FN抗体(1：100)；兔抗鼠和羊抗兔生物素化Ig(1：200)，ABC免疫复合物(1：100)。
1.2 方法
1.2.1 留取标本，马上置于4%多聚甲醛固定，脱水透明，石蜡包埋，切成5 μm的薄片，烤片后脱蜡浸水，分别行HE染色，观察组织学变化和ABC免疫组织化学染色，观察组织内FGF和FN蛋白的变化。
1.2.2 创面大体观察：肉眼观察创面表面渗液、渗血情况，以及创面、创缘新生上皮增生情况。
1.2.3 组织学观察
1.2.3.1 HE染色：组织薄片入水后，分别行苏木精、伊红染色，脱水透明封片进行观察。
1.2.3.2 ABC免疫组织化学染色：组织薄片入磷酸缓冲液5 min3次，0.3%H2O2甲醇20 min，二抗血清37℃30 min，一抗4℃过夜，Biotin二抗和ABC复合物37℃各30 min，DBA显色2～7 min。
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1.2.3.3 光镜观察：在低倍和高倍镜下，分别观察组织结构变化和FGF和FN蛋白的表达变化。免疫组化结果判断以棕黄色阳性细胞在40倍镜下表达情况而分为阴性(视野内无阳性细胞)，弱阳性(视野内可见10个以下阳性细胞)，阳性(阳性细胞在11～30个)，强阳性表达(阳性细胞多于30个)。
2 结果
2.1 创面大体观察：伤后4 d，创面表面仍有明显的渗液和少量渗血，创缘、创基新生上皮不明显。伤后10 d，创面表面有少量渗液，创缘及部分创基已有菲薄的新生上皮，上皮易被撕脱。伤后16 d，大部创面均有薄的新生上皮覆盖，但肉眼仍可见少量创基渗液和上皮不明显。
2.2 一般组织学变化：HE染色正常皮肤光镜下表皮厚度约4～5层细胞。基底细胞完整排列在基底膜，为低柱状，棘细胞和颗粒细胞层约3～4层，表皮角质蛋白较厚。真皮内可见毛囊、汗腺、皮脂腺和少量的纤维细胞、毛细血管。伤后4 d创缘处表皮细胞可见轻度增生，基底细胞排列紧密，真皮内较多的成纤维细胞和毛细血管。伤后10 d，创缘表皮进一步增厚，细胞层数增多，可见散在的表皮细胞迁移，离开创缘覆盖在创缘附近的创面上，皮肤附属器的上皮向创面表面迁移，覆盖创面形成菲薄的上皮层，真皮内成纤维细胞和毛细血管进一步增多(图1)。伤后16 d，创面表面基本上皮化，部分创面表面上皮较薄，无明显的皮肤附属器官，成纤维细胞数量较伤后10 d减少，毛细血管仍较多，真皮内可见粗大的胶原排列密集，平行于表皮，真皮层增厚。
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图1 伤后10 d，创缘表皮增厚，表皮细胞迁移覆盖在
创缘附近的创面上，皮肤附属器上皮向创面迁移形成菲薄
的上皮层，真皮内成纤维细胞和毛细血管增多(HE 100×)
2.3 FGF、FN免疫组织化学变化
2.3.1 FGF表达变化：正常皮肤内无明显的FGF免疫组化阳性信号。伤后4 d，创面浅层、创缘与真皮连接处有较多的阳性细胞，棕黄色呈胞浆分布、胞核着色较浅，单个散在分布，多数为炎性细胞，少数为成纤维细胞。表面强度达弱阳性～阳性(图2)。伤后10 d，表达较前明显增强，达强阳性，可见许多聚集的阳性细胞；全层真皮内有些成纤维细胞、血管内皮细胞均有一定的表达(图3)。伤后16 d，表达弱阳性，主要分布于真皮部分成纤维细胞内，上皮或内皮细胞基本无表达(图4)。
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图2 伤后4 d，FGF在创面表达强度达弱阳性～阳性。
阳性细胞呈棕黄色胞浆分布，散布单个分布，多为炎性
细胞，也有成纤维细胞(ABC法 400×)
图3 伤后10 d，FGF表达呈强阳性，可见许多聚集
的阳性细胞存在于创面内，成纤维细胞和内皮细胞
均有一定表达(ABC法 400×)
图4 伤后16 d，FGF表达呈弱阳性，主要分布于真皮内成纤维细胞
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(ABC法 400×)
2.3.2 FN表达变化：正常皮肤细胞内FN为弱阳性表达，主要分布于基底细胞和少数成纤维细胞。伤后FN表达情况类似于FGF。伤后4 d，FN表达强度可达阳性，表达部位基本相同于伤后4d FGF表达部位，创缘上皮基底细胞较明显，部分真皮内成纤维细胞和炎性细胞也有表达。伤后10 d，FN表达较伤后4 d表达增强，达强阳性，部位仍以创缘上皮细胞、真皮内皮细胞和成纤维细胞表达为主。伤后16 d表达减弱，以上皮基底细胞和真皮浅中层的成纤维细胞为主。强度稍强于正常皮肤，达弱阳性～阳性。
3 讨论
FGF为细胞有丝分裂刺激原，可以加快细胞分裂、促进增殖、改变细胞的趋化性、增加细胞的迁移，创面愈合过程中应用FGF可明显增加创面内胶原和细胞DNA含量，加速创面愈合[3，4]。组织FN是真皮基质中的一种非胶原糖蛋白，在皮肤组织中可以由成纤维细胞、上皮或内皮细胞产生并具有多种生物功能，在创面愈合中可以促进成纤维细胞、上皮细胞的迁移、加速肉芽组织生长，加快创面愈合[5]。
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本研究组织学观察表明：伤后4 d，创缘和真皮内附属器官的上皮已出现增殖，上皮细胞明显迁移，覆盖创面；伤后10 d，上皮增殖明显，成纤维细胞功能活跃，毛细血管丰富；伤后16 d，创面表面已上皮化，细胞增殖减轻、成纤维细胞数量和功能下降。本研究免疫组织化学结果表明：创面愈合过程中FGF、FN蛋白表达较为一致，均以伤后10 d时强阳性表达，伤后4 d或16 d时，表达强度减弱，为弱阳性或阳性表达。FGF、FN的这些变化与组织学变化较为吻合：伤后10 d时，创面上皮化明显、上皮覆盖加速，各种细胞功能活跃，而创面内FGF、FN表达也最明显，伤后4 d或16 d时，创面修复不明显或已近完成时，创面内FGF、FN蛋白表达相对较弱。从表达部位来看，两种蛋白均以创缘上皮、创面浅层的皮肤附属器官上皮、血管内皮、成纤维细胞表达明显。FGF、FN在这些创面修复细胞增殖的活跃部位内高表达，表明了内源性FGF、FN蛋白在创面愈合中的规律变化，提示两者共同参与了创面愈合的调控。
本研究结果表现的FGF、FN同期表达，且与大体观察及组织学变化相一致，反映了机体调控创面愈合作为一种生理反应，在创面愈合早期，机体为修复进行准备、发生细微的变化，FGF、FN蛋白含量亦少；当达到一定阶段，FGF、FN蛋白表达增强，细胞增殖明显，组织结构变化较大；当创面愈合近于完成时，上皮覆盖创面，内在抑制机制产生作用，FGF、FN蛋白表达减弱，含量减少，引起细胞增殖减慢。FGF、FN这种生理变化作用有利于组织修复，也可避免过度增殖、形成疤痕。临床一些难愈合创面或过度疤痕增生可能和内源性FGF、FN的不正常变化有关。而这种生理变化的机制有待进一步研究。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39370693)
作者简介：谷廷敏(1959-)，男，博士，副主任医师
参考文献：
[1]Mary HM.Peptide growth factor and wound healing[J].Clin plas Surg，1990，17：421-422.
[2]谷廷敏，牛星焘，陈东明.创面愈合过程中内源性FGF的研究[J].实用美容整形外科杂志，1997，8：327-328.
[3]Michael J.Fibroblast growth factor receptor tyrosine kinase molecular analysis and signal transduction[J].Biochem Biophys Acta，1992，1153：185-186.
[4]Editorials.Enhancement of wound healing by growth factors[J].New Engl Medi，1989，324：453-454.
[5]Grinnell F,Billingham R,Burgess L.Distribution of fibronection during wound healing in vivo[J].J Invest Dermatol，1981，76：181-182.
收稿日期：1999-08-08, 百拇医药