丝素蛋白对表皮细胞生长的影响
作者：姚敏 贾生贤 金曙雯 陆树良 吴徵宇 朱德安
单位：姚敏 贾生贤 金曙雯 陆树良 朱德安：上海第二医科大学附属瑞金医院，上海 200025；吴徵宇：苏州大学丝绸工学院
关键词：表皮；丝素蛋白；细胞生长
西北国防医学杂志990405 摘要：目的：了解丝素的生物学性能和丝素对表皮细胞生长的影响。方法：试验组采用培养液DMEM加5%丝素蛋白原液，对照组采用培养液DMEM加5%生理盐水的方法，对表皮细胞培养结果进行比较观察；观察指标为表皮细胞形态、细胞生长曲线、3H-胸腺嘧啶核苷测定等。结果：培养后3天试验组大量细胞贴壁生长，而对照组在培养后5天才大量贴壁生长；试验组细胞数在5天明显增多，对照组在7天才迅速增加；3H-胸腺嘧啶核苷测定试验组及对照组的增殖活力均在第7天达高峰，但同一时相点试验组增殖活力明显高于对照组。结论：丝素蛋白对表皮细胞生长具有促进作用。
, http://www.100md.com
中图分类号：R 622.+1 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(1999)04-0252-02
The effect of Fitroin Protein on culture of human kerationcytes
YAO Min,JIA Sheng-xian,JIN Shu-wen,et al.
(Burn Institute,Ruijin hospital,Shanghai Second Medical University,200025)
Abstract:Purpose: To investigate the effect of Fitroin Protein on the culture of human skin kreatinocytes.Methods:Human foreskin keratinocyte culture with 5% Fitroin solution and 95% DMEM.A controlled study was performed with keratinocytes culture by 5% normal saline and 95% DMEM system.The Keratinocytes growth curve were measured.The cell proliferation was determined by 3 H-thymidine incorporation assay.Results:Human keratinocytes grew well under the Fitroin and DMEM system.The cell proliferation on the test were more active than those on the control.Conclusion:Fitroin protein can promote the growth of keratinocytes.
, 百拇医药
Key words:Human keratinocytes;Fitroin protein;Cell culture
丝素(Fitroin)是从家蚕丝组织中提取物，它由两种蛋白构成。天然的蚕丝组织相容性好，蚕丝很早就用于外科止血结扎与组织缝合。通过对丝素的提取、研制和不断改进制成了用于烧伤创面治疗的丝素膜[1]，为了解丝素的生物学性能，探讨丝素对烧伤创面愈合的作用，采用在表皮细胞培养中加入丝素蛋白的方法，观察丝素蛋白对表皮细胞生长的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂：DMEM(Gibco)、表皮细胞生长因子(EGF，Sigma)、霍乱毒素(CT，Sigma)、胰岛素(Insulin，国产)、氢化可的松(HC，国产)、青霉素和链霉素(国产)等。
, 百拇医药
1.1.2 丝素蛋白原液(由苏州大学提供)。
1.1.3 氚标胸腺嘧啶核苷(3H-TdR，北京中国原子能科学研究所)。
1.1.4 包皮环切术后健康人皮肤。
1.2 方法
1.2.1 实验分组：试验组：DMEM加5%丝素蛋白原液；对照组：DMEM加5%生理盐水。
1.2.2 包皮片经常规漂洗、去除皮下组织和部分真皮组织，剪成2 mm×4 mm的皮片，按体积比1：5加入0.25%胰蛋白酶，4℃消化16～18 h，分离表皮片，弃真皮片，将表皮片吹打离散，离心1000 r/min，弃上清液，加入培养液使其成为细胞悬液，表皮细胞计数和测定活力，等量细胞稀释(每孔1×105个细胞)，然后分别加入含不同浓度的丝素蛋白原液或者生理盐水(对照组)，置于37℃、5%CO2、饱和湿度恒温培养箱中培养，每3 d更换培养液一次。
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1.3 观察指标
1.3.1 表皮细胞形态学观察：每天用倒置显微镜观察各组表皮细胞生长增殖和特点。
1.3.2 表皮细胞计数和生长曲线检测：对照组和实验组在培养后1、3、5、7、10天各取一组，吸出培养液，加等量0.5%胰蛋白酶液，用吸管吹打混匀，计算每毫升细胞数，并用台盼蓝拒染法测定细胞活性，计算出死活细胞比例，绘制曲线图。
1.3.3 3H-胸腺嘧啶核苷测定：利用同位素标记的3H-胸腺嘧啶核苷的测定，可作为DNA合成物检测表皮细胞增殖活力[2]。按汪南平等的方法[3]进行检测，各检测时相与生长曲线相同。配制含3H-胸腺嘧啶核苷的DMEM培养液加入培养孔内，振荡5 min后，置于37℃、5%CO2的温箱内6 h，加入0.5%胰蛋白酶，置于37℃消化30 min，用微量多头样品收集仪洗涤，转移至玻璃纤维纸上，在56℃恒温箱中烘烤12 h，将样品装入管中，加入闪烁液浸泡12 h，在闪烁测量仪内检测读数。
, 百拇医药
1.4 统计学处理方法：采用配对t检验方法进行处理。
2 结果
2.1 表皮细胞生长特点：以相同的细胞浓度接种培养1 d，实验组与对照组间无明显差异，培养3 d实验组明显可见大量细胞贴壁生长，而对照组贴壁细胞数明显较少。在培养后7 d实验组的细胞已长满培养孔底部，而对照组的细胞在培养后10 d才长满孔底部。
2.2 表皮细胞生长曲线(图1)：实验组在细胞接种后5 d迅速增殖，至第10天开始减慢。而对照组在接种后第7天才开始迅速增殖，在第10天实验组各时相点显著高于对照组(P<0.05)。
χ2＝102.3636 P<0.05
, 百拇医药 图1 表皮细胞生长曲线 Epidermal cells growth curve
2.3 3H-胸腺嘧啶核苷测定(图2)：实验组与对照组在接种后细胞增殖的活力不断增强，在第7天达到高峰，以后开始减弱，组间比较，实验组各时相点均高于对照组，并有显著性差异(P<0.05)。
χ2＝152.5876 P<0.05
图2 3H-胸腺嘧啶核苷测定 3 H-Thymidine assay
3 讨论
丝素来源于天然的蚕丝中心，又称丝心蛋白，占蚕丝的70%～80%，其外周由丝胶包裹。蚕丝经脱胶后即可得纯净的丝素；丝素属一种高纯度的天然蛋白，无毒、无刺激、无抗原性；丝素主要由两种氨基酸即丙氨酸和乙氨酸组成。Minoura将其制成薄膜并作了理化性能测定[4]，丝素具有良好的作为组织生物学材料的性能。
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实验结果提示；加入丝素原液的实验组细胞生长计数和细胞增殖能力均明显高于对照组，说明丝素蛋白对表皮细胞的生长具有促进作用。这可能因为丝素本身所含两种氨基酸有关，丝素原液内小分子肽和氨基酸是表皮细胞生长的有效成份；黑柳能光等也采用丝素与表皮细胞或成纤维细胞培养取得成功[5]。实验证明，丝素蛋白对表皮细胞生长具有一定的促进作用。由丝素蛋白制成的丝素膜是一种良好的创面覆盖物。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(59573014)
作者简介：姚敏(1963-)，女，(土家族)，硕士研究生，主治医师
参考文献：
[1]黄伯高，朱德安，吴征宇，等.一种新的创面覆盖物——丝素膜[J].中华整形烧伤外科杂志，1998，7(14)：270-274.
, http://www.100md.com
[2]Marcelo CL,Kim YG,Kaine JL,et al.Stratification,specialization and proliferation of primary keratinocyte cultures.Evidence of a functioning in vitro epidermal cell system[J].J Cell Biol，1978，79：356-361.
[3]汪南平，王永潮，李世荫.环孢菌素对角质细胞体外增殖及其增殖相关基因表达的影响[J].中国皮肤性病学杂志，1994，8：203-207.
[4]Minoura N,Tsukada M,Nagara M.Physio-chemicl properties of silk fibroin membrane as a biomaterial[J].Biomaterial，1990，11：430-436.
[5]黑柳能光.细胞组型人工皮肤.热伤，1997，23(1)：9-14.
收稿日期：1999-08-08, 百拇医药
单位：姚敏 贾生贤 金曙雯 陆树良 朱德安：上海第二医科大学附属瑞金医院，上海 200025；吴徵宇：苏州大学丝绸工学院
关键词：表皮；丝素蛋白；细胞生长
西北国防医学杂志990405 摘要：目的：了解丝素的生物学性能和丝素对表皮细胞生长的影响。方法：试验组采用培养液DMEM加5%丝素蛋白原液，对照组采用培养液DMEM加5%生理盐水的方法，对表皮细胞培养结果进行比较观察；观察指标为表皮细胞形态、细胞生长曲线、3H-胸腺嘧啶核苷测定等。结果：培养后3天试验组大量细胞贴壁生长，而对照组在培养后5天才大量贴壁生长；试验组细胞数在5天明显增多，对照组在7天才迅速增加；3H-胸腺嘧啶核苷测定试验组及对照组的增殖活力均在第7天达高峰，但同一时相点试验组增殖活力明显高于对照组。结论：丝素蛋白对表皮细胞生长具有促进作用。
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中图分类号：R 622.+1 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(1999)04-0252-02
The effect of Fitroin Protein on culture of human kerationcytes
YAO Min,JIA Sheng-xian,JIN Shu-wen,et al.
(Burn Institute,Ruijin hospital,Shanghai Second Medical University,200025)
Abstract:Purpose: To investigate the effect of Fitroin Protein on the culture of human skin kreatinocytes.Methods:Human foreskin keratinocyte culture with 5% Fitroin solution and 95% DMEM.A controlled study was performed with keratinocytes culture by 5% normal saline and 95% DMEM system.The Keratinocytes growth curve were measured.The cell proliferation was determined by 3 H-thymidine incorporation assay.Results:Human keratinocytes grew well under the Fitroin and DMEM system.The cell proliferation on the test were more active than those on the control.Conclusion:Fitroin protein can promote the growth of keratinocytes.
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Key words:Human keratinocytes;Fitroin protein;Cell culture
丝素(Fitroin)是从家蚕丝组织中提取物，它由两种蛋白构成。天然的蚕丝组织相容性好，蚕丝很早就用于外科止血结扎与组织缝合。通过对丝素的提取、研制和不断改进制成了用于烧伤创面治疗的丝素膜[1]，为了解丝素的生物学性能，探讨丝素对烧伤创面愈合的作用，采用在表皮细胞培养中加入丝素蛋白的方法，观察丝素蛋白对表皮细胞生长的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂：DMEM(Gibco)、表皮细胞生长因子(EGF，Sigma)、霍乱毒素(CT，Sigma)、胰岛素(Insulin，国产)、氢化可的松(HC，国产)、青霉素和链霉素(国产)等。
, 百拇医药
1.1.2 丝素蛋白原液(由苏州大学提供)。
1.1.3 氚标胸腺嘧啶核苷(3H-TdR，北京中国原子能科学研究所)。
1.1.4 包皮环切术后健康人皮肤。
1.2 方法
1.2.1 实验分组：试验组：DMEM加5%丝素蛋白原液；对照组：DMEM加5%生理盐水。
1.2.2 包皮片经常规漂洗、去除皮下组织和部分真皮组织，剪成2 mm×4 mm的皮片，按体积比1：5加入0.25%胰蛋白酶，4℃消化16～18 h，分离表皮片，弃真皮片，将表皮片吹打离散，离心1000 r/min，弃上清液，加入培养液使其成为细胞悬液，表皮细胞计数和测定活力，等量细胞稀释(每孔1×105个细胞)，然后分别加入含不同浓度的丝素蛋白原液或者生理盐水(对照组)，置于37℃、5%CO2、饱和湿度恒温培养箱中培养，每3 d更换培养液一次。
, 百拇医药
1.3 观察指标
1.3.1 表皮细胞形态学观察：每天用倒置显微镜观察各组表皮细胞生长增殖和特点。
1.3.2 表皮细胞计数和生长曲线检测：对照组和实验组在培养后1、3、5、7、10天各取一组，吸出培养液，加等量0.5%胰蛋白酶液，用吸管吹打混匀，计算每毫升细胞数，并用台盼蓝拒染法测定细胞活性，计算出死活细胞比例，绘制曲线图。
1.3.3 3H-胸腺嘧啶核苷测定：利用同位素标记的3H-胸腺嘧啶核苷的测定，可作为DNA合成物检测表皮细胞增殖活力[2]。按汪南平等的方法[3]进行检测，各检测时相与生长曲线相同。配制含3H-胸腺嘧啶核苷的DMEM培养液加入培养孔内，振荡5 min后，置于37℃、5%CO2的温箱内6 h，加入0.5%胰蛋白酶，置于37℃消化30 min，用微量多头样品收集仪洗涤，转移至玻璃纤维纸上，在56℃恒温箱中烘烤12 h，将样品装入管中，加入闪烁液浸泡12 h，在闪烁测量仪内检测读数。
, 百拇医药
1.4 统计学处理方法：采用配对t检验方法进行处理。
2 结果
2.1 表皮细胞生长特点：以相同的细胞浓度接种培养1 d，实验组与对照组间无明显差异，培养3 d实验组明显可见大量细胞贴壁生长，而对照组贴壁细胞数明显较少。在培养后7 d实验组的细胞已长满培养孔底部，而对照组的细胞在培养后10 d才长满孔底部。
2.2 表皮细胞生长曲线(图1)：实验组在细胞接种后5 d迅速增殖，至第10天开始减慢。而对照组在接种后第7天才开始迅速增殖，在第10天实验组各时相点显著高于对照组(P<0.05)。
χ2＝102.3636 P<0.05
, 百拇医药 图1 表皮细胞生长曲线 Epidermal cells growth curve
2.3 3H-胸腺嘧啶核苷测定(图2)：实验组与对照组在接种后细胞增殖的活力不断增强，在第7天达到高峰，以后开始减弱，组间比较，实验组各时相点均高于对照组，并有显著性差异(P<0.05)。
χ2＝152.5876 P<0.05
图2 3H-胸腺嘧啶核苷测定 3 H-Thymidine assay
3 讨论
丝素来源于天然的蚕丝中心，又称丝心蛋白，占蚕丝的70%～80%，其外周由丝胶包裹。蚕丝经脱胶后即可得纯净的丝素；丝素属一种高纯度的天然蛋白，无毒、无刺激、无抗原性；丝素主要由两种氨基酸即丙氨酸和乙氨酸组成。Minoura将其制成薄膜并作了理化性能测定[4]，丝素具有良好的作为组织生物学材料的性能。
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实验结果提示；加入丝素原液的实验组细胞生长计数和细胞增殖能力均明显高于对照组，说明丝素蛋白对表皮细胞的生长具有促进作用。这可能因为丝素本身所含两种氨基酸有关，丝素原液内小分子肽和氨基酸是表皮细胞生长的有效成份；黑柳能光等也采用丝素与表皮细胞或成纤维细胞培养取得成功[5]。实验证明，丝素蛋白对表皮细胞生长具有一定的促进作用。由丝素蛋白制成的丝素膜是一种良好的创面覆盖物。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(59573014)
作者简介：姚敏(1963-)，女，(土家族)，硕士研究生，主治医师
参考文献：
[1]黄伯高，朱德安，吴征宇，等.一种新的创面覆盖物——丝素膜[J].中华整形烧伤外科杂志，1998，7(14)：270-274.
, http://www.100md.com
[2]Marcelo CL,Kim YG,Kaine JL,et al.Stratification,specialization and proliferation of primary keratinocyte cultures.Evidence of a functioning in vitro epidermal cell system[J].J Cell Biol，1978，79：356-361.
[3]汪南平，王永潮，李世荫.环孢菌素对角质细胞体外增殖及其增殖相关基因表达的影响[J].中国皮肤性病学杂志，1994，8：203-207.
[4]Minoura N,Tsukada M,Nagara M.Physio-chemicl properties of silk fibroin membrane as a biomaterial[J].Biomaterial，1990，11：430-436.
[5]黑柳能光.细胞组型人工皮肤.热伤，1997，23(1)：9-14.
收稿日期：1999-08-08, 百拇医药