人真皮微血管内皮细胞的体外分离和原代培养
作者：胡大海 陈璧 汤朝武 韩军涛 姜笃银 苏映军 朱雄翔 贾赤宇 徐明达
单位：第四军医大学西京医院烧伤外科，西安 710032
关键词：人真皮；微血管；内皮细胞；原代培养
西北国防医学杂志990403 摘要：目的：建立体外分离及培养人真皮微血管内皮细胞的方法，为进一步开展创面愈合及相关领域的细胞和分子生物学研究提供物质基础和实验模型。方法：健康成人中厚皮组织经中性蛋白酶消化后去除表皮；然后，采取薄片真皮组织胰蛋白酶低湿慢速灌注法消化微血管内皮细胞；将获取的微血管内皮细胞于不同条件的培养基内连续培养5～15 d，观察其基本生物学生长特征，并采用免疫细胞化学方法行Ⅷ因子相关抗原染色鉴定。结果：①采用中性蛋白酶及胰蛋白酶分步消化法，所分离获得的细胞体外具有很强的增殖能力；该细胞呈现Ⅷ因子相关抗原阳性，说明为真皮微血管内皮细胞；②细胞单层培养时显示活跃的形成类管腔状结构的生物学特征；③真皮微血管内皮细胞在不同培养基内生长状态不同，含8%胎牛血清、2%人分娩前母体血清及适量cAMP等添加物的IMDM为其较理想的培养基。结论：经体外分离及培养获得了生长性良好的人真皮微血管内皮细胞。
, 百拇医药
中图分类号：R 644 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(1999)04-0244-05
Isolation and primary culture of endothelial cells from microvessels of adult human dermis
HU Da-hai,CHEN Bi,TANG Chao-wu,et al.
(Department of Burns,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,PR China,710032)
Abstract:Purpose:To establish a modified isolation and culture method of human dermal microvascular endothelial cells(HDMEC).Methods:The split thickness skins were cut into small fragments,and incubated for 16 hours at 4℃in 0.25% Dispase in PBS.After removal of the epidermis,the dermal fragments were put into 0.125% Trypsin/0.01% EDTA at 4 ℃for other 24 hours,this treatment was named by us as prolonged thin section tissue perfusion at low temperature.The HDMEC were mechanically released by gently scraping the trypsinized dermis,harvested by centrifugation,and cultivated in different media.The cell growth characteristics was observed and measured,and staining for the Factor Ⅷ-related antigen performed by immunocytochemistry to identify the cells.Results: ①The cultivated cells proliferated very well with presence of Factor Ⅷ-related antigen. ②When cultivated in monolayer,the cells grew actively to form a tubelike structure. ③Iscove's Modified Dubelco's Medium(IMDM) containing 8% fetal calf serum(FCS) and 2% prepartum maternal serum(PMS) and essentially supplemented with cyclic adenosine monophosphate(cAMP) was a comparatively ideal medium in the culture of HDMEC. Conclusion:By the modified isolation method used in this study,HDMEC could be obtained and grown in vitro with favorable biological characteristics.
, 百拇医药
Key words:Human dermis;Microvessel;Endothelial cell;Primary culture
微血管内皮细胞(microvascular endothelial cells,MEC)在炎症反应、肿瘤生长、创面愈合过程中起着非常重要的作用[1]。在创面愈合研究领域，由于表皮细胞、真皮成纤维细胞体外培养技术的成熟，人们对这两种细胞早已进行了大量深入的研究。与之相比，对参与创面愈合过程的另一种主要细胞-真皮微血管内皮细胞(dermal microvascular endothelial cells,DMEC)，则因其体外分离培养技术的困难而使相关的研究受限[2]。本研究利用正常人真皮组织，采用两种不同的消化酶——中性蛋白酶(Dispase)和胰蛋白酶(Trypsin)分步消化，成功地分离获取了大量高浓度的DMEC；体外连续培养2 wk(15 d)，对其生物学生长特性进行了初步的观察，并应用免疫组化行Ⅷ因子相关抗原染色证实为DMEC。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料：IMDM(Iscove's Modified Dubelco's Medium)、DMEM、RIPM1640、M199培养基，均购自GIBCO公司；中性蛋白酶，购自日本和光纯药株式社；胰蛋白酶，购自DIFCO公司；特级胎牛血清(fetal calf serum,FCS)，购自杭州四季青生物工程材料研究所；兔抗Ⅷ因子相关抗原抗体，购自IYMEO Laboratories公司；SABC kit，购自BOSTER公司；四甲基偶氮唑盐[3-(4，5dimethylthiazo1-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]，购自SIGMA公司；胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine)，购自FLUKA公司；次黄嘌呤(hypoxanthine)，购自FARW Chemical Supplies公司；二丁酰环磷酸腺苷(dibutymyl cyclic adenosine monophosphate)，购自中国科学院生物化学研究所；异丁甲基黄嘌呤(isobutyl methyl xanthine)，购自SIGMA公司；健康分娩前母体血清(prepartum maternal serum,PMS)，西京医院妇产科刘淑娟医生提供。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 HDMEC的分离过程及培养：将整形手术中剩余的健康成人全厚皮组织用滚轴刀切取中厚皮(0.3～0.4 mm)，置于2.5 ml/L洗必泰液内浸泡8 min清毒，用无菌0.01 MPBS(pH7.4)浸洗3次，剪成0.2 cm×1.0 cm大小皮片，置于0.25%Dispase内4℃消化16 h；无菌0.01 MPBS(pH7.4)浸洗3次，置于0.125%Trypsin/0.01%EDTA内4℃间歇振动消化24 h；取出消化后的真皮放于含有8%FCS的IMDM培养基内，用20号手术刀背挤压真皮，同时轻轻振动真皮，使消化游离的HDMEC经此器械挤压及液体冲洗力的作用下释放到IMDM培养基内；收集IMDM培养基，经800 rpm×10 min离心分离HDMEC；用含8%FCS+2%PMS及添加物的完全IMDM培养基(表1)，重悬离心获得的HCMEC，洗涤一次，再经800 rpm×10 min离心HDMEC；重悬洗涤后的HDMEC，并用血小板计数板计数，0.5%胎盼蓝染色，细胞活力达到>95%时用于培养。调整细胞浓度，以2×103细胞/cm2的密度接种于3.5 cm×6.5 cm的培养瓶(Nunc)内，采用含8%FCS+2%PMS及添加物的完全IMDM培养基于37℃、5%CO2、100%湿度下持续培养15 d，每3 d换液一次。
, 百拇医药
表1 含8%FCS、2%PMS及添加物的完全IMDM培养基
(参照Karasek[1]提供的浓度数据配制) 添加物
浓度
胎牛血清
8%
健康分娩前母体血清
2%
胸腺嘧啶脱氧核苷
1.5×10-5 mol/L
次黄嘌呤
1.0×10-4 mol/L
, http://www.100md.com
二丁酰环磷酸腺苷
5.0×10-4 mol/L
异丁甲基黄嘌呤
3.3×10-5 mol/L
1.2.2 培养的HCMEC一般形态学观察及免疫细胞化学染色：对培养瓶内培养的HDMEC每天于倒置显微镜下观察其形态变化及生长状态，拍照记录。取部分前述分离到HDMEC悬液以相同浓度接种于预置培养皿内的18 mm×18 mm的无菌盖玻片上；接种后2 h，向培养皿内补加适量含8%FCS+2%PMS及添加物的完全IMDM培养基，与培养瓶内HDMEC相同条件培养15 d。取出盖玻片，用0.01MPBS(pH7.4)漂洗3次，加入预冷的纯丙酮固定10 min；设已知阳性对照、空白对照、正常兔血清替代对照组，SABC法行兔抗Ⅷ因子相关抗原免疫反应，抗体工作浓度1∶100，DAB呈色，苏木精染色，常规脱水、透明、封片，光镜下观察并拍照。
, http://www.100md.com
1.2.3 不同培养条件对HCMEC增殖速度的影响
1.2.3.1 不同接种密度对HDMEC增殖的影响：用含8%FCS+2%PMS及添加物的IMDM完全培养基将HDMEC悬液进行一定的稀释，调整细胞终浓度分别为：5×103、1×104、3×104、5×104、1×105细胞/ml，用连续自动加样器(Eppendorf Multipete Plus型，Eppendorf公司)向96孔板内接种，每一块板接种每一浓度细胞8孔，每孔100μl，共接种6块96孔板，接种细胞的培养板于37℃、5% CO2、100%湿度条件下培养，每3 d换液一次，并于不同时间点各取一块板用MTT比色法测定细胞增殖情况。
1.2.3.2 不同培养基对HDMEC增殖的影响：将HDMEC用不同条件培养基(s)，制备细胞悬液，均以3×104细胞/ml接种于96孔板内，每一块板每一培养基接种8孔，每孔100μl，于37℃、5% CO2、100%湿度条件下培养，第3天换液一次，培养5 d后用MTT比色法测定细胞增殖情况。表2 用于HDMEC培养的培养基及其血清加入量 培养基
, http://www.100md.com
血清
FCS
PMS
DMEM
10%
20%
RIPM1640
10%
20%
M199
10%
20%
IMDM
, 百拇医药
10%
20%
8%
2%
1.2.4 MTT比色法：向待测的96孔板的细胞培养基内每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，继续于37℃、5%CO2、100%湿度条件下培养4 h，吸去培养基，每孔加入二甲基亚砜(DMSO，国产分析纯)100μl，振荡10 min，CO2孵箱内放置12 h，振荡5 min，用DG3022型酶联免疫检测仪(华东电子管厂制造)在490 nm波长下读取A值。
1.2.5 统计学处理：全部数据均采用第四军医大学统计学教研室开发的SPLM医用统计软件包进行t检验。
2 结果
, http://www.100md.com
2.1 原代培养的HDMEC生长形态特征：接种后的HDMEC，于2 h即可贴壁，随时间延长细胞逐渐伸展，36 h时可形成含10～20个细胞的小克隆，细胞呈多角形或拖尾短梭状(图1)；7 d前这种小克隆生长迅速，生长过程呈现一种独特的细胞间紧密排列的漩窝状或同心圆状外观(图2)。以3×103细胞/cm2密度接种的HDMEC，培养至7 d时完全融合，细胞间紧密接触为单层，细胞呈现典型的多角状，细胞核质密、胞浆饱满透光好、胞膜折光性强(图3)。融合后的单层内皮细胞继续培养至15 d时，未见其形态结构上有何明显变化。
图1 HDMEC接种后36 h形成的克隆，细胞呈多角形或拖尾短梭状(×100)
图2 HDMEC接种后72 h克隆生长扩展，细胞呈同心圆紧密排列(↑)(×100)
, http://www.100md.com
图3 HDMEC培养7 d已完全融合，细胞呈现典型的多角状外观(×100)
2.2 Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学结果：接种后连续培养15 d的单层细胞均显示Ⅷ因子相关抗原阳性(图4)，说明本实验分离到的细胞为HDMEC。在此单层细胞内可见一种类似管样结构，其周边细胞呈现很规范的以管腔为中心的内皮样，免疫细胞化学显示此细胞呈Ⅷ因子相关抗原阳性，证明亦为HDMEC；同时可见整个结构非常类似于真皮组织切片中的微血管，管腔侧为扁长、胞核向管腔突出的内皮细胞排列构成(图5，图6)。
图4 HDMEC爬片培养15 d完全融合，抗Ⅷ相关抗原SABC
免疫反应DAB呈色，细胞均阳性(×100)
, http://www.100md.com
图5 HDMEC爬片培养15 d完全融合，抗Ⅷ相关抗原
SABC免疫反应DAB呈色，高倍镜下可见内皮细胞形
成的较小的管状结构(↑)(×200)
图6 HDMEC爬片培养15 d完全融合，抗Ⅷ相关抗原SABC免疫反应
DAB呈色，高倍镜下可见内皮细胞形成的较大的管状结构，其整体结构
类似于真皮组织的微血管；管壁细胞变长，胞核突向管腔侧(↑)(×200)
2.3 不同细胞接种密度对HDMEC生长增殖的影响：细胞接种密度不同时，HDMEC生长增殖的速率差异很大。96孔板接种后可见细胞浓度过低为5×102个细胞/孔时，连续培养15 d，细胞难以增殖生长；1×103细胞/孔时细胞生长缓慢，培养至15 d时，细胞仍在生长增殖，但尚未达到平台期；当细胞浓度界于3×103～5×103个细胞/孔时，细胞增殖迅速，5 d内增长速度最快，7～9 d后处于生长平台状态，细胞浓度过高达1×104个细胞/孔时，培养仅3 d后即处于生长平台状态(图7)。
, 百拇医药
图7 细胞接种密度对HDMEC生长增殖的影响
2.4 不同培养基对HDMEC生长增殖的影响：由图8可见，接种后12 h的HDMEC在几种常用培养基内其数目及活力状态无明显差异，说明本研究系统的稳定性，同时也表明这些培养基均可满足HDMEC附壁及基本生物学活性功能恢复的要求。细胞连续培养5 d，不同培养基中HDMEC的增殖程度出现明显的差别；细胞在加入单一血清FCS的DMEM、RIPM1640、M199及IMDM中均表现出比较高的FCS浓度依赖性，在10%FCS中生长均缓慢，增殖率为38.9%～46.4%；而在20%FCS中则生长明显增快，增殖率为65.8%～107.3%(P<0.01)；在降低FCS的浓度至8%另外加入2%PMS的IMDM中，HDMEC生长最快，增殖率为174.9%，显著高于高FCS组的任何一种培养基(P<0.01)。
图8 不同培养基对HDMEC生长增殖的影响
, http://www.100md.com
3 讨论
由组织定位决定了真皮微血管内皮细胞在皮肤各种生理及生化反应中发挥着关键作用[1]。皮肤创伤后所出现的一系列病理反应，例如：缺血、出凝血、炎症及各种体液与细胞免疫反应、局部蛋白质等各种物质的生长与降解及其反应活性调节、修复细胞的生长增殖、以及组织修复后期的疤痕形成与组织塑形等，均有真皮微血管内皮细胞的介导及直接参与。因此，研究皮肤损伤修复机制离不开对真皮微血管内皮细胞的研究。
真皮微血管内皮细胞的体外培养需要解决两个难题：其一，是分离困难，其中如何避免成纤维细胞的污染同时获取足够量的内皮细胞以满足其体外生长需要为技术的关键点；其二，是体外生长困难，如何令其在培养过程中保持与体内相似的形态及生物学功能特征，系真皮微血管内皮细胞体外培养的难点。
国外于1978年由Davison和Karasek[3]报告了分离兔真皮微血管内皮细胞的实验研究，这是人类首次有关真皮微血管内皮细胞体外分离及培养的实验报道。其后，Folkman等[4]比较详细地报告了分离人真皮微血管内皮细胞的方法：主要过程为将包皮去皮下组织后，剪成1 mm大小的真皮片，采用0.5%的胶原酶室温消化1 h后，用吸管吹打分离DMEC；分离到的细胞接种于经明胶包被的塑料培养皿内；利用DMEC附壁较快的特性，接种后3 h内换液去除大部分污染的成纤维细胞；培养2～3 d至DMEC形成小克隆时，镜下观察并用吸管尖刮去污染的非DMEC细胞(crush any monendothelial cells)进一步纯化DMEC；其所用培养基为α最小必须培养基(α minimal essential medium)，含有50%的经培养肉瘤180细胞24-48 hr的DMEM、10%人血清、FGF、人凝血酶、牛垂体前叶提取物等。此方法为早期分离培养HDMEC的典型代表，特点为培养的HDMEC生长能力依赖于经肿瘤细胞作用的培养基，且强调采用明胶包被培养器皿表面及添加生长因子等物质刺激并维持内皮细胞体外生长能力的重要性。仔细分析其实验结果，当时采用的纯化过程复杂且难以确保纯化的可靠性，另外细胞生长尚显缓慢。由于认识到微血管内皮细胞功能的重要性，80年代以来，人们对包括真皮微血管在内的各种组织器官的微血管内皮细胞的分离及培养技术进行了许多富有成效的探索。针对HDMEC分离技术方面主要的改进为以应用胰酶为主消化真皮。Davsion等[5]报道采用“薄片组织灌注(thin section tissue perfusion)”法，应用0.3%胰酶/1%EDTA室温消化真皮薄片45 min可最大限度地减轻对HDMEC的损伤及最有效地减少成纤维细胞污染。Marks等[6]则应用相同浓度的胰酶37℃消化10 min，然后应用35%的Percoll梯度分离液纯化分离HDMEC，可获得大量高纯度的HDMEC。Percoll梯度分离液比较昂贵为这一技术的不足点。我们利用中性蛋白酶专一消化分离表皮基底膜的特性，首先去除表皮达到增加富含微血管的真皮乳头层的表皮面暴露程度，然后用低浓度的胰酶(0.125%胰酶/0.01%EDTA)，于4℃低温下经24 h缓慢消化真皮内的HDMEC，其原理为：①避免了高浓度及热消化时胰酶活性过强，造成对首先接触酶的位于组织浅表的HDMEC的消化性损伤；②可避免胰酶活性过高对真皮组织细胞外间质消化过多，而造成的成纤维细胞污染；③避免浅表组织强消化产生过量变性蛋白阻碍酶对深部组织的HDMEC进一步消化致使最终HDMEC获得减少；④其消化时间较长有利于酶充分灌注到深层的微血管内发挥消化作用。实验结果显示，经改进采用两种消化酶、低浓度、低温、延时灌注消化真皮，可分离获得大量较纯的HDMEC，其于体外培养时呈现强生长增殖能力及活跃的形成类血管腔结构的生物学特征。
, http://www.100md.com
对于HDMEC的体外培养条件，人们主要关注的问题是如何维持其生长特征同时减少血清浓度及添加的生长刺激因子等，这将有助于利用培养的HDMEC进行各种体外功能实验的客观分析。本实验就几种近年来常用于HDMEC的培养基，加入不同浓度FCS后对细胞的增殖影响进行了比较。实验结果以IMDM/8%FCS+2%PMS加入cAMP等的完全培养基最佳，结果同Karasek的实验相类似[1]。有实验表明cAMP对维持MEC的形态特征起关键作用[7，8]，由于本研究系原代培养，培养时间相对较短，各种培养基的HDMEC细胞形态未见明显差异；因此，难以肯定cAMP的这一作用，尚待延长培养时间或传代观察。我们认为采用IMDM/8%FCS+2%PMS培养HDMEC，虽然其中加入了一定量的cAMP等化学物质成分，但不需再添加入更多的生长因子等即可使HDMEC获得良好的生长状态，这将非常有利于开展包括生长因子在内的相关因子对HDMEC作用机理的研究。
目前，国内对人类创面愈合涉及血管内皮细胞功能的体外实验同国外的大部分实验一样，均采用人的脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)替代进行。大量实验证明不同器官及大小血管的EC细胞表型相差甚远，因而生物学特性不同[9～12]。所以，建立HDMEC的有效分离及培养方法，并应用于创面修复机理的研究意义非常大。据文献检索所知，国内尚无HDMEC体外培养的研究报道。我们正在进行有关HDMEC体外生长的其它生物学特征的进一步研究及传代培养，并开始应用其开展相关的研究。
, 百拇医药
致谢：衷心感谢兰州军区兰州总医院烧伤科刘毅博士对本文发表给予的热情关心及多方面的大力支持。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600153)
作者简介：胡大海(1963-)，男，博士，主治医师
参考文献：
[1]Karasek MA.Microvascular endothelial cell culture[J].J Invest Dermatol，1989，93(2)：33S-38S.
[2]Petzelbauer P,Bender JB,Wilson J.Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture[J].Imunol，1993，151(9)：5062-5072.
, http://www.100md.com
[3]Davison PM,Karasek MA.Factors affecting the growth and morphology of rabbit skin endothelial cells in vitro(Abstr)[J].Clin Res，1978，25(2)：208-209.
[4]Folkman J,Haudenschild CC,Zetter BR.Long-term culture of capillary endothelial cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，1979，76(10)：5217-5221.
[5]Davison PM,Bensch K,Karasek MA.Isolation and growth of endothelial cells from the microvessels of the newborn human foreskin in cell culture[J].J Invest Dermatol，1980，75(3)：316-321.
, 百拇医药
[6]Marks RM,Czerniecki M,Penny R.Human dermal microvascular endothelial cells:an improved method for tissue culture and a description of some singular properties in culture[J].In Vitro Cell Dev Biol，1985，21(5)：627-635.
[7]Davison PM,Karasek MA.Human dermal microvascular endothelial cells in vitro:effect of cyclic AMP of cellular morphology and proliferation rate[J].J Cell Physiol，1981，106(3)：253-258.
[8]Karasek,MA,Tudor R,Bensch K.Control of human skin microvascular endothelial cell shape and function(Abstr)[J].J Invest Dermatol，1988，90(6)：573-574.
, 百拇医药
[9]Zetter BR.The endothelium cells of large and small blood vessels[J].Diabetes，1981，30(1)：24-28.
[10]Jaffe EA.Cell biology of endothelial cells[J].Human Pathol，1987，18(3)：234-239.
[11]Detmar M,Tenorio S,Hettmannsperger U,et al.Cytokine regulation of proliferation and ICAM-1 expression of human dermal microvascular endothelial cells in vitro[J].J Invest Dermatol，1992，98(2)：147-153.
[12]Detmar M,Imcke E,Ruszczak,Z,et al,Effects of recombinant tumor necrosis factor-alpha on cultured microvascular endothelial cells derived from human dermis[J].J Invest Dermatol，1990，95(6)：219S-222S.
收稿日期：1999-08-08, 百拇医药
单位：第四军医大学西京医院烧伤外科，西安 710032
关键词：人真皮；微血管；内皮细胞；原代培养
西北国防医学杂志990403 摘要：目的：建立体外分离及培养人真皮微血管内皮细胞的方法，为进一步开展创面愈合及相关领域的细胞和分子生物学研究提供物质基础和实验模型。方法：健康成人中厚皮组织经中性蛋白酶消化后去除表皮；然后，采取薄片真皮组织胰蛋白酶低湿慢速灌注法消化微血管内皮细胞；将获取的微血管内皮细胞于不同条件的培养基内连续培养5～15 d，观察其基本生物学生长特征，并采用免疫细胞化学方法行Ⅷ因子相关抗原染色鉴定。结果：①采用中性蛋白酶及胰蛋白酶分步消化法，所分离获得的细胞体外具有很强的增殖能力；该细胞呈现Ⅷ因子相关抗原阳性，说明为真皮微血管内皮细胞；②细胞单层培养时显示活跃的形成类管腔状结构的生物学特征；③真皮微血管内皮细胞在不同培养基内生长状态不同，含8%胎牛血清、2%人分娩前母体血清及适量cAMP等添加物的IMDM为其较理想的培养基。结论：经体外分离及培养获得了生长性良好的人真皮微血管内皮细胞。
, 百拇医药
中图分类号：R 644 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(1999)04-0244-05
Isolation and primary culture of endothelial cells from microvessels of adult human dermis
HU Da-hai,CHEN Bi,TANG Chao-wu,et al.
(Department of Burns,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,PR China,710032)
Abstract:Purpose:To establish a modified isolation and culture method of human dermal microvascular endothelial cells(HDMEC).Methods:The split thickness skins were cut into small fragments,and incubated for 16 hours at 4℃in 0.25% Dispase in PBS.After removal of the epidermis,the dermal fragments were put into 0.125% Trypsin/0.01% EDTA at 4 ℃for other 24 hours,this treatment was named by us as prolonged thin section tissue perfusion at low temperature.The HDMEC were mechanically released by gently scraping the trypsinized dermis,harvested by centrifugation,and cultivated in different media.The cell growth characteristics was observed and measured,and staining for the Factor Ⅷ-related antigen performed by immunocytochemistry to identify the cells.Results: ①The cultivated cells proliferated very well with presence of Factor Ⅷ-related antigen. ②When cultivated in monolayer,the cells grew actively to form a tubelike structure. ③Iscove's Modified Dubelco's Medium(IMDM) containing 8% fetal calf serum(FCS) and 2% prepartum maternal serum(PMS) and essentially supplemented with cyclic adenosine monophosphate(cAMP) was a comparatively ideal medium in the culture of HDMEC. Conclusion:By the modified isolation method used in this study,HDMEC could be obtained and grown in vitro with favorable biological characteristics.
, 百拇医药
Key words:Human dermis;Microvessel;Endothelial cell;Primary culture
微血管内皮细胞(microvascular endothelial cells,MEC)在炎症反应、肿瘤生长、创面愈合过程中起着非常重要的作用[1]。在创面愈合研究领域，由于表皮细胞、真皮成纤维细胞体外培养技术的成熟，人们对这两种细胞早已进行了大量深入的研究。与之相比，对参与创面愈合过程的另一种主要细胞-真皮微血管内皮细胞(dermal microvascular endothelial cells,DMEC)，则因其体外分离培养技术的困难而使相关的研究受限[2]。本研究利用正常人真皮组织，采用两种不同的消化酶——中性蛋白酶(Dispase)和胰蛋白酶(Trypsin)分步消化，成功地分离获取了大量高浓度的DMEC；体外连续培养2 wk(15 d)，对其生物学生长特性进行了初步的观察，并应用免疫组化行Ⅷ因子相关抗原染色证实为DMEC。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料：IMDM(Iscove's Modified Dubelco's Medium)、DMEM、RIPM1640、M199培养基，均购自GIBCO公司；中性蛋白酶，购自日本和光纯药株式社；胰蛋白酶，购自DIFCO公司；特级胎牛血清(fetal calf serum,FCS)，购自杭州四季青生物工程材料研究所；兔抗Ⅷ因子相关抗原抗体，购自IYMEO Laboratories公司；SABC kit，购自BOSTER公司；四甲基偶氮唑盐[3-(4，5dimethylthiazo1-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]，购自SIGMA公司；胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine)，购自FLUKA公司；次黄嘌呤(hypoxanthine)，购自FARW Chemical Supplies公司；二丁酰环磷酸腺苷(dibutymyl cyclic adenosine monophosphate)，购自中国科学院生物化学研究所；异丁甲基黄嘌呤(isobutyl methyl xanthine)，购自SIGMA公司；健康分娩前母体血清(prepartum maternal serum,PMS)，西京医院妇产科刘淑娟医生提供。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 HDMEC的分离过程及培养：将整形手术中剩余的健康成人全厚皮组织用滚轴刀切取中厚皮(0.3～0.4 mm)，置于2.5 ml/L洗必泰液内浸泡8 min清毒，用无菌0.01 MPBS(pH7.4)浸洗3次，剪成0.2 cm×1.0 cm大小皮片，置于0.25%Dispase内4℃消化16 h；无菌0.01 MPBS(pH7.4)浸洗3次，置于0.125%Trypsin/0.01%EDTA内4℃间歇振动消化24 h；取出消化后的真皮放于含有8%FCS的IMDM培养基内，用20号手术刀背挤压真皮，同时轻轻振动真皮，使消化游离的HDMEC经此器械挤压及液体冲洗力的作用下释放到IMDM培养基内；收集IMDM培养基，经800 rpm×10 min离心分离HDMEC；用含8%FCS+2%PMS及添加物的完全IMDM培养基(表1)，重悬离心获得的HCMEC，洗涤一次，再经800 rpm×10 min离心HDMEC；重悬洗涤后的HDMEC，并用血小板计数板计数，0.5%胎盼蓝染色，细胞活力达到>95%时用于培养。调整细胞浓度，以2×103细胞/cm2的密度接种于3.5 cm×6.5 cm的培养瓶(Nunc)内，采用含8%FCS+2%PMS及添加物的完全IMDM培养基于37℃、5%CO2、100%湿度下持续培养15 d，每3 d换液一次。
, 百拇医药
表1 含8%FCS、2%PMS及添加物的完全IMDM培养基
(参照Karasek[1]提供的浓度数据配制) 添加物
浓度
胎牛血清
8%
健康分娩前母体血清
2%
胸腺嘧啶脱氧核苷
1.5×10-5 mol/L
次黄嘌呤
1.0×10-4 mol/L
, http://www.100md.com
二丁酰环磷酸腺苷
5.0×10-4 mol/L
异丁甲基黄嘌呤
3.3×10-5 mol/L
1.2.2 培养的HCMEC一般形态学观察及免疫细胞化学染色：对培养瓶内培养的HDMEC每天于倒置显微镜下观察其形态变化及生长状态，拍照记录。取部分前述分离到HDMEC悬液以相同浓度接种于预置培养皿内的18 mm×18 mm的无菌盖玻片上；接种后2 h，向培养皿内补加适量含8%FCS+2%PMS及添加物的完全IMDM培养基，与培养瓶内HDMEC相同条件培养15 d。取出盖玻片，用0.01MPBS(pH7.4)漂洗3次，加入预冷的纯丙酮固定10 min；设已知阳性对照、空白对照、正常兔血清替代对照组，SABC法行兔抗Ⅷ因子相关抗原免疫反应，抗体工作浓度1∶100，DAB呈色，苏木精染色，常规脱水、透明、封片，光镜下观察并拍照。
, http://www.100md.com
1.2.3 不同培养条件对HCMEC增殖速度的影响
1.2.3.1 不同接种密度对HDMEC增殖的影响：用含8%FCS+2%PMS及添加物的IMDM完全培养基将HDMEC悬液进行一定的稀释，调整细胞终浓度分别为：5×103、1×104、3×104、5×104、1×105细胞/ml，用连续自动加样器(Eppendorf Multipete Plus型，Eppendorf公司)向96孔板内接种，每一块板接种每一浓度细胞8孔，每孔100μl，共接种6块96孔板，接种细胞的培养板于37℃、5% CO2、100%湿度条件下培养，每3 d换液一次，并于不同时间点各取一块板用MTT比色法测定细胞增殖情况。
1.2.3.2 不同培养基对HDMEC增殖的影响：将HDMEC用不同条件培养基(s)，制备细胞悬液，均以3×104细胞/ml接种于96孔板内，每一块板每一培养基接种8孔，每孔100μl，于37℃、5% CO2、100%湿度条件下培养，第3天换液一次，培养5 d后用MTT比色法测定细胞增殖情况。表2 用于HDMEC培养的培养基及其血清加入量 培养基
, http://www.100md.com
血清
FCS
PMS
DMEM
10%
20%
RIPM1640
10%
20%
M199
10%
20%
IMDM
, 百拇医药
10%
20%
8%
2%
1.2.4 MTT比色法：向待测的96孔板的细胞培养基内每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，继续于37℃、5%CO2、100%湿度条件下培养4 h，吸去培养基，每孔加入二甲基亚砜(DMSO，国产分析纯)100μl，振荡10 min，CO2孵箱内放置12 h，振荡5 min，用DG3022型酶联免疫检测仪(华东电子管厂制造)在490 nm波长下读取A值。
1.2.5 统计学处理：全部数据均采用第四军医大学统计学教研室开发的SPLM医用统计软件包进行t检验。
2 结果
, http://www.100md.com
2.1 原代培养的HDMEC生长形态特征：接种后的HDMEC，于2 h即可贴壁，随时间延长细胞逐渐伸展，36 h时可形成含10～20个细胞的小克隆，细胞呈多角形或拖尾短梭状(图1)；7 d前这种小克隆生长迅速，生长过程呈现一种独特的细胞间紧密排列的漩窝状或同心圆状外观(图2)。以3×103细胞/cm2密度接种的HDMEC，培养至7 d时完全融合，细胞间紧密接触为单层，细胞呈现典型的多角状，细胞核质密、胞浆饱满透光好、胞膜折光性强(图3)。融合后的单层内皮细胞继续培养至15 d时，未见其形态结构上有何明显变化。
图1 HDMEC接种后36 h形成的克隆，细胞呈多角形或拖尾短梭状(×100)
图2 HDMEC接种后72 h克隆生长扩展，细胞呈同心圆紧密排列(↑)(×100)
, http://www.100md.com
图3 HDMEC培养7 d已完全融合，细胞呈现典型的多角状外观(×100)
2.2 Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学结果：接种后连续培养15 d的单层细胞均显示Ⅷ因子相关抗原阳性(图4)，说明本实验分离到的细胞为HDMEC。在此单层细胞内可见一种类似管样结构，其周边细胞呈现很规范的以管腔为中心的内皮样，免疫细胞化学显示此细胞呈Ⅷ因子相关抗原阳性，证明亦为HDMEC；同时可见整个结构非常类似于真皮组织切片中的微血管，管腔侧为扁长、胞核向管腔突出的内皮细胞排列构成(图5，图6)。
图4 HDMEC爬片培养15 d完全融合，抗Ⅷ相关抗原SABC
免疫反应DAB呈色，细胞均阳性(×100)
, http://www.100md.com
图5 HDMEC爬片培养15 d完全融合，抗Ⅷ相关抗原
SABC免疫反应DAB呈色，高倍镜下可见内皮细胞形
成的较小的管状结构(↑)(×200)
图6 HDMEC爬片培养15 d完全融合，抗Ⅷ相关抗原SABC免疫反应
DAB呈色，高倍镜下可见内皮细胞形成的较大的管状结构，其整体结构
类似于真皮组织的微血管；管壁细胞变长，胞核突向管腔侧(↑)(×200)
2.3 不同细胞接种密度对HDMEC生长增殖的影响：细胞接种密度不同时，HDMEC生长增殖的速率差异很大。96孔板接种后可见细胞浓度过低为5×102个细胞/孔时，连续培养15 d，细胞难以增殖生长；1×103细胞/孔时细胞生长缓慢，培养至15 d时，细胞仍在生长增殖，但尚未达到平台期；当细胞浓度界于3×103～5×103个细胞/孔时，细胞增殖迅速，5 d内增长速度最快，7～9 d后处于生长平台状态，细胞浓度过高达1×104个细胞/孔时，培养仅3 d后即处于生长平台状态(图7)。
, 百拇医药
图7 细胞接种密度对HDMEC生长增殖的影响
2.4 不同培养基对HDMEC生长增殖的影响：由图8可见，接种后12 h的HDMEC在几种常用培养基内其数目及活力状态无明显差异，说明本研究系统的稳定性，同时也表明这些培养基均可满足HDMEC附壁及基本生物学活性功能恢复的要求。细胞连续培养5 d，不同培养基中HDMEC的增殖程度出现明显的差别；细胞在加入单一血清FCS的DMEM、RIPM1640、M199及IMDM中均表现出比较高的FCS浓度依赖性，在10%FCS中生长均缓慢，增殖率为38.9%～46.4%；而在20%FCS中则生长明显增快，增殖率为65.8%～107.3%(P<0.01)；在降低FCS的浓度至8%另外加入2%PMS的IMDM中，HDMEC生长最快，增殖率为174.9%，显著高于高FCS组的任何一种培养基(P<0.01)。
图8 不同培养基对HDMEC生长增殖的影响
, http://www.100md.com
3 讨论
由组织定位决定了真皮微血管内皮细胞在皮肤各种生理及生化反应中发挥着关键作用[1]。皮肤创伤后所出现的一系列病理反应，例如：缺血、出凝血、炎症及各种体液与细胞免疫反应、局部蛋白质等各种物质的生长与降解及其反应活性调节、修复细胞的生长增殖、以及组织修复后期的疤痕形成与组织塑形等，均有真皮微血管内皮细胞的介导及直接参与。因此，研究皮肤损伤修复机制离不开对真皮微血管内皮细胞的研究。
真皮微血管内皮细胞的体外培养需要解决两个难题：其一，是分离困难，其中如何避免成纤维细胞的污染同时获取足够量的内皮细胞以满足其体外生长需要为技术的关键点；其二，是体外生长困难，如何令其在培养过程中保持与体内相似的形态及生物学功能特征，系真皮微血管内皮细胞体外培养的难点。
国外于1978年由Davison和Karasek[3]报告了分离兔真皮微血管内皮细胞的实验研究，这是人类首次有关真皮微血管内皮细胞体外分离及培养的实验报道。其后，Folkman等[4]比较详细地报告了分离人真皮微血管内皮细胞的方法：主要过程为将包皮去皮下组织后，剪成1 mm大小的真皮片，采用0.5%的胶原酶室温消化1 h后，用吸管吹打分离DMEC；分离到的细胞接种于经明胶包被的塑料培养皿内；利用DMEC附壁较快的特性，接种后3 h内换液去除大部分污染的成纤维细胞；培养2～3 d至DMEC形成小克隆时，镜下观察并用吸管尖刮去污染的非DMEC细胞(crush any monendothelial cells)进一步纯化DMEC；其所用培养基为α最小必须培养基(α minimal essential medium)，含有50%的经培养肉瘤180细胞24-48 hr的DMEM、10%人血清、FGF、人凝血酶、牛垂体前叶提取物等。此方法为早期分离培养HDMEC的典型代表，特点为培养的HDMEC生长能力依赖于经肿瘤细胞作用的培养基，且强调采用明胶包被培养器皿表面及添加生长因子等物质刺激并维持内皮细胞体外生长能力的重要性。仔细分析其实验结果，当时采用的纯化过程复杂且难以确保纯化的可靠性，另外细胞生长尚显缓慢。由于认识到微血管内皮细胞功能的重要性，80年代以来，人们对包括真皮微血管在内的各种组织器官的微血管内皮细胞的分离及培养技术进行了许多富有成效的探索。针对HDMEC分离技术方面主要的改进为以应用胰酶为主消化真皮。Davsion等[5]报道采用“薄片组织灌注(thin section tissue perfusion)”法，应用0.3%胰酶/1%EDTA室温消化真皮薄片45 min可最大限度地减轻对HDMEC的损伤及最有效地减少成纤维细胞污染。Marks等[6]则应用相同浓度的胰酶37℃消化10 min，然后应用35%的Percoll梯度分离液纯化分离HDMEC，可获得大量高纯度的HDMEC。Percoll梯度分离液比较昂贵为这一技术的不足点。我们利用中性蛋白酶专一消化分离表皮基底膜的特性，首先去除表皮达到增加富含微血管的真皮乳头层的表皮面暴露程度，然后用低浓度的胰酶(0.125%胰酶/0.01%EDTA)，于4℃低温下经24 h缓慢消化真皮内的HDMEC，其原理为：①避免了高浓度及热消化时胰酶活性过强，造成对首先接触酶的位于组织浅表的HDMEC的消化性损伤；②可避免胰酶活性过高对真皮组织细胞外间质消化过多，而造成的成纤维细胞污染；③避免浅表组织强消化产生过量变性蛋白阻碍酶对深部组织的HDMEC进一步消化致使最终HDMEC获得减少；④其消化时间较长有利于酶充分灌注到深层的微血管内发挥消化作用。实验结果显示，经改进采用两种消化酶、低浓度、低温、延时灌注消化真皮，可分离获得大量较纯的HDMEC，其于体外培养时呈现强生长增殖能力及活跃的形成类血管腔结构的生物学特征。
, http://www.100md.com
对于HDMEC的体外培养条件，人们主要关注的问题是如何维持其生长特征同时减少血清浓度及添加的生长刺激因子等，这将有助于利用培养的HDMEC进行各种体外功能实验的客观分析。本实验就几种近年来常用于HDMEC的培养基，加入不同浓度FCS后对细胞的增殖影响进行了比较。实验结果以IMDM/8%FCS+2%PMS加入cAMP等的完全培养基最佳，结果同Karasek的实验相类似[1]。有实验表明cAMP对维持MEC的形态特征起关键作用[7，8]，由于本研究系原代培养，培养时间相对较短，各种培养基的HDMEC细胞形态未见明显差异；因此，难以肯定cAMP的这一作用，尚待延长培养时间或传代观察。我们认为采用IMDM/8%FCS+2%PMS培养HDMEC，虽然其中加入了一定量的cAMP等化学物质成分，但不需再添加入更多的生长因子等即可使HDMEC获得良好的生长状态，这将非常有利于开展包括生长因子在内的相关因子对HDMEC作用机理的研究。
目前，国内对人类创面愈合涉及血管内皮细胞功能的体外实验同国外的大部分实验一样，均采用人的脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)替代进行。大量实验证明不同器官及大小血管的EC细胞表型相差甚远，因而生物学特性不同[9～12]。所以，建立HDMEC的有效分离及培养方法，并应用于创面修复机理的研究意义非常大。据文献检索所知，国内尚无HDMEC体外培养的研究报道。我们正在进行有关HDMEC体外生长的其它生物学特征的进一步研究及传代培养，并开始应用其开展相关的研究。
, 百拇医药
致谢：衷心感谢兰州军区兰州总医院烧伤科刘毅博士对本文发表给予的热情关心及多方面的大力支持。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600153)
作者简介：胡大海(1963-)，男，博士，主治医师
参考文献：
[1]Karasek MA.Microvascular endothelial cell culture[J].J Invest Dermatol，1989，93(2)：33S-38S.
[2]Petzelbauer P,Bender JB,Wilson J.Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture[J].Imunol，1993，151(9)：5062-5072.
, http://www.100md.com
[3]Davison PM,Karasek MA.Factors affecting the growth and morphology of rabbit skin endothelial cells in vitro(Abstr)[J].Clin Res，1978，25(2)：208-209.
[4]Folkman J,Haudenschild CC,Zetter BR.Long-term culture of capillary endothelial cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，1979，76(10)：5217-5221.
[5]Davison PM,Bensch K,Karasek MA.Isolation and growth of endothelial cells from the microvessels of the newborn human foreskin in cell culture[J].J Invest Dermatol，1980，75(3)：316-321.
, 百拇医药
[6]Marks RM,Czerniecki M,Penny R.Human dermal microvascular endothelial cells:an improved method for tissue culture and a description of some singular properties in culture[J].In Vitro Cell Dev Biol，1985，21(5)：627-635.
[7]Davison PM,Karasek MA.Human dermal microvascular endothelial cells in vitro:effect of cyclic AMP of cellular morphology and proliferation rate[J].J Cell Physiol，1981，106(3)：253-258.
[8]Karasek,MA,Tudor R,Bensch K.Control of human skin microvascular endothelial cell shape and function(Abstr)[J].J Invest Dermatol，1988，90(6)：573-574.
, 百拇医药
[9]Zetter BR.The endothelium cells of large and small blood vessels[J].Diabetes，1981，30(1)：24-28.
[10]Jaffe EA.Cell biology of endothelial cells[J].Human Pathol，1987，18(3)：234-239.
[11]Detmar M,Tenorio S,Hettmannsperger U,et al.Cytokine regulation of proliferation and ICAM-1 expression of human dermal microvascular endothelial cells in vitro[J].J Invest Dermatol，1992，98(2)：147-153.
[12]Detmar M,Imcke E,Ruszczak,Z,et al,Effects of recombinant tumor necrosis factor-alpha on cultured microvascular endothelial cells derived from human dermis[J].J Invest Dermatol，1990，95(6)：219S-222S.
收稿日期：1999-08-08, 百拇医药