PCR－反相杂交法检测沙门氏菌invA、invE基因
作者：冯同喜 王燕宁 张建芳 李绣萍 卢媛 李建平 苏明权
单位：冯同喜(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)；王燕宁(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)；张建芳(第四军医大学西京医院)；李绣萍(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)
关键词：伤寒沙门氏菌；合酶联反应；反相杂交
西北国防医学杂志000423
摘要：目的：探讨从血液中早期检出伤寒沙门氏菌病原体 的方法。方法：选择沙门氏菌属中的invA invE，采用PCR 扩增-反相杂交法及电泳法同时对 血培养物中的伤寒沙门氏菌进行对比检测。结果：电泳法 6 h检出8份，检出率80%。8 h、1 0 h可将10份全部检出，检出率为100%。反相杂交法4 h有3份阳性，阳性率为30%，6 h有9 份出现阳性反应，阳性率为90%，8 h、10 h可将10份全部检出，阳性率为100%。临床标本 中电泳法12/16阳性，阳性率75%，PCR-反相杂交法阳性14/16，阳性率87.5%。结论：反相杂交法具有敏感性高、特异性好等优点，对伤寒 的早期快速诊断及治疗有重要意义。
, 百拇医药
中图分类号：R 378.23 文献标 识码：A 文章编号：1007-8622(2000)04-0303-03
Detection of invA and invE gene of bacterium typhosum by PCR-rev ersed hybridization
FENG Tong-xi,WANG Yan-ning,ZHANG Jian-fang,et al.
(Lanzhou G eneral Hospital,Lanzhou Command,PLA,730050)
Abstract:Objective:To explore the methods to detect bacterium typhosum of blood in early stage.Methods:InvA and invE gene of salmone lleae in blood culture mater ial were examined by PCR-reversed hybridization and electrophoresis method.Resu lts:Of 8(80%)and 10(100%) samples could be detected positively b y agarose elect rophoresis method respectively after 6 h and after 8 h and 10 h. However,3(30%) samples were detected positively by reversed hybridization after 4 h and 9(90%) and 10(100%)samples were positive after 6 h and 8 h.The positive findings of c linical specimen were 12/16(75%)and 14/16(87.5%)respectively by agarose elec trophoresis and by PCR-reversed hybridization method.Conclusion: The results show tha t PCR-reversed hybridization method is obviously superior to agarose electropho resis for the detecting of invA and invE gene.The method has high sensibility.sp ecificity and reliability and has certain significance for the early diagnosis a nd treatment of typhoid.
, 百拇医药
Key words:Bacterium typhosum; PCR; Reversed hybrid ization
伤寒是由伤寒杆菌经消化道侵害小肠粘膜入血引起的急性传染病，其快速诊断十分重要 。以往血清学抗体检测的敏感性和特异性均不理想。血液培养虽然是确诊伤寒的金指标，但 其阳性率1～2 d才达80%～90%[1]，且受体标本抽取时间、临床用药等因素的影 响，达不到早期快速诊治的目的。本文用伤寒沙门氏菌属中invA、invE基因设计一对特异性 引物及相应探针，采用PCR-反相杂交方法检测和鉴定血培养物中的沙门氏菌，为伤寒的早 期快速诊断提供了依据。
1 材料与方法
1.1 引物设计与合成：根据go ldkey数据库中伤寒杆菌基因序列，选择伤寒沙门氏菌属invA、invE基因设计一对特异性引物及探针，扩增片段 为485 bp，由西京医院分子生物研究室提供。引物序列为：TF1：5′biotin-ACTGCT AAAACCACTACT-3′；TF2：5′-TTCGCAGTAAA GAGAG-3′，探针5′biotin-CTGGTTGATTTCCTGATGGC-3′，TF1引物5′端标记地高辛，探 针5′端标记生物素。
, 百拇医药
1.2 杂交液：聚蔗糖0.25 g， 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)0.25 g，牛DNA0.0625 g，BSA0.25 g。20×SSC31.25 ml，1 mol*L-1HCl 375 ml，加超纯水至1 000 ml。
1.3 辣根过氧化物酶标亲合素(临用前用pH7 .4 PBS 1：150稀释成酶应用液)，由华美生物技术公司提供。
1.4 显色液：pH5.0磷酸-柠 檬酸缓冲液9.9 ml，10 g*L-1TMB0.1 ml，30%H2O210 μl。
1.5 包被液：Strepavdin 10 mg溶于pH 10.0碳酸盐缓冲液1 000 ml。
1.6 冼涤液：用pH 7.4PBS洗 涤。
, 百拇医药
1.7 终止液：2 mol*L- 1H2SO4终止。
1.8 变性液：0.25 mol*L -1 NaOH。
1.9 血培养物的制备：将伤寒 菌接种在葡萄糖肉汤基中(含3 %无菌血液)，分别于37℃培养1、2、4、6、8、10 h观察其阳性检出率。
1.10 PCR方法
1.10.1 伤寒杆菌DNA提取：伤寒杆菌经1 8～24 h培养，与TNE缓冲液处理15 min，9 700 g，离心10 min，去上清，加50 μl蛋白酶K裂解液，55℃60 min，95℃10 min，酚：氯 仿：异戊醇(25：24：1)抽提二次，乙醇沉淀，TE溶解备用。
1.10.2 血培养物中伤寒杆菌DNA的提取 ：取不同时间的伤寒杆菌培养物100 μl，9 700 g，离心15 min，去上清，加50 μl蛋白酶K裂解液，55℃60 min，95℃10 min，酚：氯 仿：异戊醇(25：24：1)抽提两次，乙醇沉淀，TE溶解备用。
, 百拇医药
1.10.3 扩增：反应总体积为25 μl，10 ×PCR缓冲液2.5 μl，4×dNTP1.5 μl，引 物1、2各0.25 μl，无菌去离子水9.5 μl，模板10 μl，TaoDNA聚合酶1 U*μl-1 ，以无菌石 蜡30 μl覆盖，进行PCR循环，循环参数为：95℃5 min，94℃1 min，72℃1 min,58 ℃1 mi n，32个循环，最后72℃延伸5 min。
1.10.4 扩增产物检测：取扩增产物15 μl，于2%琼脂糖(含EB液)上100 V电泳30 m in，于紫外光下观察结果，出现458 bp扩增带为阳性，未见458 bp扩增带为阴性。
1.10.5 反相杂交检测法[2]。
1.10.5.1 包备：取包备液100 μl，4 ℃过夜，用洗涤液洗涤三次，滤纸吸干。
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1.10.5.2 变性反应：取0.6 mol*L -1NaOH与等量扩增产物混合，置室温10 min。
1.10.5.3 杂交：取25 μl变性液与杂 交液(内含50 mmol*L-1CN探针)100 μl于包备板内37℃60 min洗涤三次，拍干。
1.10.5.4 显色反应：在微空反应板内 加酶应用液100 μl，37℃15 min，洗涤三 次，拍干，加显色液100 μl37℃10 min，加终止液100 μl，于酶标仪450 nm比色。
1.10.5.5 结果判断：先用空白校零点 ，然后读取各空吸光度值。样品A值/阴性 对照平均A值≥2.1时判断为阳性，阴性对照孔值应在0.05～0.20之间。
2 结果
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2.1 琼脂糖凝胶电泳法：将10 份伤寒沙门氏菌感染的血培养物，按不同时间分别制备模 板，进行PCR检测。结果6 h检出8份，检出率80%；8 h、10 h时可将10份全部检出，阳性检 出率达100%。
2.2 反相杂交检测法：将10份 伤寒沙门氏菌感染的血培养物，按不同时间分别制备模板 进行反相杂交法检测。结果4 h有3份出现阳性，阳性率为30%；6 h有9份出现阳性反应，阳 性检出率为90%；8 h、10 h可将10份全部检出，阳性检出率达100%。
2.3 临床标本检测：应用反相 杂交法与电泳法对16份临床标本同步检测，结果琼脂糖电 泳阳性12/16，阳性检出率为75%；PCR微孔板反相杂交法阳性14/16，阳性检出率为87.5 %。
3 讨论
随着分子生物学研究进展和分子生物学技术的广泛应用，伤寒杆菌的基因结构已基本清楚， 在沙门氏菌的鞭毛抗原Hl-d中，由1 530 个碱基核苷酸序列编码[3，4]虽然d抗原 也存在于其他非伤寒沙门氏菌中，并非沙门氏菌独有，经研究证实[5，6]伤寒杆菌 有独立的高变基因区域为1072-1089高变区。据此从伤寒杆菌独立的高变区域设计一对具有 高特异性的引物序列及探针序列，用于伤寒的早期快速诊断。PCR微孔板杂交分析技术用于 检测伤寒沙门氏菌DNA，微孔板包备有与SPA相连的寡核苷酸，预杂交使捕获探针与微孔板相 连，然后加入变性后的PCR扩增产物与捕获探针杂交，洗涤后用酶标亲和素与扩增产物5′端 标记的生物素反应，最后加入底物显色，测定其孔间的吸光度值，从而达到量化反应。本方 法所选用的引物及探针均可特异地针对所有伤寒沙门氏菌，而且杂交法的敏感性比琼脂糖电 泳法高一个数量级[7]。应用微孔板反相杂交法与电泳法对16份临床标本同时检测 ，结果琼脂糖电泳阳性12/16，阳性率为75%，PCR-微孔板反相杂交法阳性14/16，阳性 检出率为87.5%。PCR-微孔板反相杂交法检测结果的敏感性和特异性以及可靠性明显优于 琼 脂糖电泳法检测结果。PCR-微孔板反相杂交法与电泳法一样需要注意防污染。微孔杂交法 可确定扩增产物的特异性和敏感性，但未能解决样品间的污染所致的假阳性问题。采用微孔 杂交法检测伤寒杆菌时，除遵守常规PCR注意事项外，操作区分开，所用器材一次性使用 ，还应注意微孔板、洗涤液、杂交液等，应用后收集并酸化处理。
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作者简介：冯同喜(1952-)，男，副主任技师
卢媛(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)
李建平(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)
苏明权(第四军医大学西京医院)
参考文献：
[1]王季午，编.传染病学[M].上海：上海科学技术出版社，1988.123-1 25.
[2]黄培堂，译.PCR技术实验指南[M].北京：科学出版社，1998.124-12 7.
[3]Frankd G,Neaton SMC,Schoolnik GK,et al.Umique sequence in reg ion VI of the flagellin gene of salminella typhi[J].Microbiol,1989,3:1379-1385.
, http://www.100md.com
[4]Wei L,Joys TM.Covalent structure of three phase flagellarfilament porteins of salmonella[J].J Mol Biol,1985,186:791-800.
[5]Song JH,Cho H,Park MY,et al.Detection of salmonella typhi in blood of p atients with typhiod fever by polymetase chain reaction[J].J Clin Microbiol,19 93,31:1439.
[6]Ewing WH.Identification of enterobacteriaceae[M].New York：Else vier,1986.247-318.
[7]Frederick S.Preclinieal evaination of amplieon hepatitis C virus test for detection of hertatintis C vims RNA[J].J Clin Microbiol,1995,33:1775 -1776.
收稿日期：1999-11-20 修回：2000-04-26, 百拇医药
单位：冯同喜(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)；王燕宁(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)；张建芳(第四军医大学西京医院)；李绣萍(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)
关键词：伤寒沙门氏菌；合酶联反应；反相杂交
西北国防医学杂志000423
摘要：目的：探讨从血液中早期检出伤寒沙门氏菌病原体 的方法。方法：选择沙门氏菌属中的invA invE，采用PCR 扩增-反相杂交法及电泳法同时对 血培养物中的伤寒沙门氏菌进行对比检测。结果：电泳法 6 h检出8份，检出率80%。8 h、1 0 h可将10份全部检出，检出率为100%。反相杂交法4 h有3份阳性，阳性率为30%，6 h有9 份出现阳性反应，阳性率为90%，8 h、10 h可将10份全部检出，阳性率为100%。临床标本 中电泳法12/16阳性，阳性率75%，PCR-反相杂交法阳性14/16，阳性率87.5%。结论：反相杂交法具有敏感性高、特异性好等优点，对伤寒 的早期快速诊断及治疗有重要意义。
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中图分类号：R 378.23 文献标 识码：A 文章编号：1007-8622(2000)04-0303-03
Detection of invA and invE gene of bacterium typhosum by PCR-rev ersed hybridization
FENG Tong-xi,WANG Yan-ning,ZHANG Jian-fang,et al.
(Lanzhou G eneral Hospital,Lanzhou Command,PLA,730050)
Abstract:Objective:To explore the methods to detect bacterium typhosum of blood in early stage.Methods:InvA and invE gene of salmone lleae in blood culture mater ial were examined by PCR-reversed hybridization and electrophoresis method.Resu lts:Of 8(80%)and 10(100%) samples could be detected positively b y agarose elect rophoresis method respectively after 6 h and after 8 h and 10 h. However,3(30%) samples were detected positively by reversed hybridization after 4 h and 9(90%) and 10(100%)samples were positive after 6 h and 8 h.The positive findings of c linical specimen were 12/16(75%)and 14/16(87.5%)respectively by agarose elec trophoresis and by PCR-reversed hybridization method.Conclusion: The results show tha t PCR-reversed hybridization method is obviously superior to agarose electropho resis for the detecting of invA and invE gene.The method has high sensibility.sp ecificity and reliability and has certain significance for the early diagnosis a nd treatment of typhoid.
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Key words:Bacterium typhosum; PCR; Reversed hybrid ization
伤寒是由伤寒杆菌经消化道侵害小肠粘膜入血引起的急性传染病，其快速诊断十分重要 。以往血清学抗体检测的敏感性和特异性均不理想。血液培养虽然是确诊伤寒的金指标，但 其阳性率1～2 d才达80%～90%[1]，且受体标本抽取时间、临床用药等因素的影 响，达不到早期快速诊治的目的。本文用伤寒沙门氏菌属中invA、invE基因设计一对特异性 引物及相应探针，采用PCR-反相杂交方法检测和鉴定血培养物中的沙门氏菌，为伤寒的早 期快速诊断提供了依据。
1 材料与方法
1.1 引物设计与合成：根据go ldkey数据库中伤寒杆菌基因序列，选择伤寒沙门氏菌属invA、invE基因设计一对特异性引物及探针，扩增片段 为485 bp，由西京医院分子生物研究室提供。引物序列为：TF1：5′biotin-ACTGCT AAAACCACTACT-3′；TF2：5′-TTCGCAGTAAA GAGAG-3′，探针5′biotin-CTGGTTGATTTCCTGATGGC-3′，TF1引物5′端标记地高辛，探 针5′端标记生物素。
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1.2 杂交液：聚蔗糖0.25 g， 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)0.25 g，牛DNA0.0625 g，BSA0.25 g。20×SSC31.25 ml，1 mol*L-1HCl 375 ml，加超纯水至1 000 ml。
1.3 辣根过氧化物酶标亲合素(临用前用pH7 .4 PBS 1：150稀释成酶应用液)，由华美生物技术公司提供。
1.4 显色液：pH5.0磷酸-柠 檬酸缓冲液9.9 ml，10 g*L-1TMB0.1 ml，30%H2O210 μl。
1.5 包被液：Strepavdin 10 mg溶于pH 10.0碳酸盐缓冲液1 000 ml。
1.6 冼涤液：用pH 7.4PBS洗 涤。
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1.7 终止液：2 mol*L- 1H2SO4终止。
1.8 变性液：0.25 mol*L -1 NaOH。
1.9 血培养物的制备：将伤寒 菌接种在葡萄糖肉汤基中(含3 %无菌血液)，分别于37℃培养1、2、4、6、8、10 h观察其阳性检出率。
1.10 PCR方法
1.10.1 伤寒杆菌DNA提取：伤寒杆菌经1 8～24 h培养，与TNE缓冲液处理15 min，9 700 g，离心10 min，去上清，加50 μl蛋白酶K裂解液，55℃60 min，95℃10 min，酚：氯 仿：异戊醇(25：24：1)抽提二次，乙醇沉淀，TE溶解备用。
1.10.2 血培养物中伤寒杆菌DNA的提取 ：取不同时间的伤寒杆菌培养物100 μl，9 700 g，离心15 min，去上清，加50 μl蛋白酶K裂解液，55℃60 min，95℃10 min，酚：氯 仿：异戊醇(25：24：1)抽提两次，乙醇沉淀，TE溶解备用。
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1.10.3 扩增：反应总体积为25 μl，10 ×PCR缓冲液2.5 μl，4×dNTP1.5 μl，引 物1、2各0.25 μl，无菌去离子水9.5 μl，模板10 μl，TaoDNA聚合酶1 U*μl-1 ，以无菌石 蜡30 μl覆盖，进行PCR循环，循环参数为：95℃5 min，94℃1 min，72℃1 min,58 ℃1 mi n，32个循环，最后72℃延伸5 min。
1.10.4 扩增产物检测：取扩增产物15 μl，于2%琼脂糖(含EB液)上100 V电泳30 m in，于紫外光下观察结果，出现458 bp扩增带为阳性，未见458 bp扩增带为阴性。
1.10.5 反相杂交检测法[2]。
1.10.5.1 包备：取包备液100 μl，4 ℃过夜，用洗涤液洗涤三次，滤纸吸干。
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1.10.5.2 变性反应：取0.6 mol*L -1NaOH与等量扩增产物混合，置室温10 min。
1.10.5.3 杂交：取25 μl变性液与杂 交液(内含50 mmol*L-1CN探针)100 μl于包备板内37℃60 min洗涤三次，拍干。
1.10.5.4 显色反应：在微空反应板内 加酶应用液100 μl，37℃15 min，洗涤三 次，拍干，加显色液100 μl37℃10 min，加终止液100 μl，于酶标仪450 nm比色。
1.10.5.5 结果判断：先用空白校零点 ，然后读取各空吸光度值。样品A值/阴性 对照平均A值≥2.1时判断为阳性，阴性对照孔值应在0.05～0.20之间。
2 结果
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2.1 琼脂糖凝胶电泳法：将10 份伤寒沙门氏菌感染的血培养物，按不同时间分别制备模 板，进行PCR检测。结果6 h检出8份，检出率80%；8 h、10 h时可将10份全部检出，阳性检 出率达100%。
2.2 反相杂交检测法：将10份 伤寒沙门氏菌感染的血培养物，按不同时间分别制备模板 进行反相杂交法检测。结果4 h有3份出现阳性，阳性率为30%；6 h有9份出现阳性反应，阳 性检出率为90%；8 h、10 h可将10份全部检出，阳性检出率达100%。
2.3 临床标本检测：应用反相 杂交法与电泳法对16份临床标本同步检测，结果琼脂糖电 泳阳性12/16，阳性检出率为75%；PCR微孔板反相杂交法阳性14/16，阳性检出率为87.5 %。
3 讨论
随着分子生物学研究进展和分子生物学技术的广泛应用，伤寒杆菌的基因结构已基本清楚， 在沙门氏菌的鞭毛抗原Hl-d中，由1 530 个碱基核苷酸序列编码[3，4]虽然d抗原 也存在于其他非伤寒沙门氏菌中，并非沙门氏菌独有，经研究证实[5，6]伤寒杆菌 有独立的高变基因区域为1072-1089高变区。据此从伤寒杆菌独立的高变区域设计一对具有 高特异性的引物序列及探针序列，用于伤寒的早期快速诊断。PCR微孔板杂交分析技术用于 检测伤寒沙门氏菌DNA，微孔板包备有与SPA相连的寡核苷酸，预杂交使捕获探针与微孔板相 连，然后加入变性后的PCR扩增产物与捕获探针杂交，洗涤后用酶标亲和素与扩增产物5′端 标记的生物素反应，最后加入底物显色，测定其孔间的吸光度值，从而达到量化反应。本方 法所选用的引物及探针均可特异地针对所有伤寒沙门氏菌，而且杂交法的敏感性比琼脂糖电 泳法高一个数量级[7]。应用微孔板反相杂交法与电泳法对16份临床标本同时检测 ，结果琼脂糖电泳阳性12/16，阳性率为75%，PCR-微孔板反相杂交法阳性14/16，阳性 检出率为87.5%。PCR-微孔板反相杂交法检测结果的敏感性和特异性以及可靠性明显优于 琼 脂糖电泳法检测结果。PCR-微孔板反相杂交法与电泳法一样需要注意防污染。微孔杂交法 可确定扩增产物的特异性和敏感性，但未能解决样品间的污染所致的假阳性问题。采用微孔 杂交法检测伤寒杆菌时，除遵守常规PCR注意事项外，操作区分开，所用器材一次性使用 ，还应注意微孔板、洗涤液、杂交液等，应用后收集并酸化处理。
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作者简介：冯同喜(1952-)，男，副主任技师
卢媛(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)
李建平(兰州军区兰州总医院，甘肃 兰州 730050)
苏明权(第四军医大学西京医院)
参考文献：
[1]王季午，编.传染病学[M].上海：上海科学技术出版社，1988.123-1 25.
[2]黄培堂，译.PCR技术实验指南[M].北京：科学出版社，1998.124-12 7.
[3]Frankd G,Neaton SMC,Schoolnik GK,et al.Umique sequence in reg ion VI of the flagellin gene of salminella typhi[J].Microbiol,1989,3:1379-1385.
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[5]Song JH,Cho H,Park MY,et al.Detection of salmonella typhi in blood of p atients with typhiod fever by polymetase chain reaction[J].J Clin Microbiol,19 93,31:1439.
[6]Ewing WH.Identification of enterobacteriaceae[M].New York：Else vier,1986.247-318.
[7]Frederick S.Preclinieal evaination of amplieon hepatitis C virus test for detection of hertatintis C vims RNA[J].J Clin Microbiol,1995,33:1775 -1776.
收稿日期：1999-11-20 修回：2000-04-26, 百拇医药