神经毒剂急性中毒时大鼠脑内GABA受体结合活性的变化
作者：彭俊华 曹波 张峰 齐心亮 高宁
单位：彭俊华(兰州军区兰州总医院检验科，甘肃 兰州 730050)；曹波(第三军医大学环 境卫生教研室，重庆 400038)；张峰(兰州军区兰州总医院检验科，甘肃 兰州 730050)；齐心亮(兰州军区兰州总医院检验科，甘肃 兰州 730050)；高宁(第三军医大学环 境卫生教研室，重庆 400038)
关键词：神经毒剂；GABA受体；中毒
西北国防医学杂志000422 摘要：目的：通过探讨γ-氨基丁酸(GABA)受体在神经毒 剂急性中毒时的活性状态，为临床治疗此类中毒引起的中枢惊厥症状提供新的思路。方法： 提取含大鼠脑神经末梢微囊GABA受体的匀浆液，通过大鼠体外实验、体内染毒实验(动物抽 搐发作和未发作)来观察GABA受体变化。结果：在体外实 验中，10 mmol.L-1的梭曼 和丙氟磷均能显著降低大鼠GABA配体与受体的结合率(P<0.01)，1 mmol.L-1 的梭曼仍能显著降低GABA受体的结合率(P<0.05)。大鼠皮下注射梭曼99 μg.kg -1发现3H-GABA的结合值在抽搐发作时显著降低；大鼠腹腔注射丙氟磷6 mg.kg-1，3H-GABA的结合值亦显著降低。结论：神经毒 剂在一定浓度下能 显著降低大鼠脑GABA受体的结合率，提示GABA受体参与了某些神经毒剂的急性中毒过程。
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中图分类号：R 827.172 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(2000)04-0300-03
Changes in binding activity of GABA receptor induced by nerve agen t poisoning in rats
PENG Jun-hua,CAO Bo,ZHANG Feng,et al.
(Department of Examinati on Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA,730050,China)
Abstract:Objective:To provide a new approach for cli nical treatment of acute con vulsion induced by acute nerve agent poisoning by measuring binding activity of GABA receptors.Methods:Activity of 3H-GABA binding to GABA receptor in rat's microsac was measured in acute poisoning model induced by nerve gas in vitro and in vivo.Results:The 3 H-GABA tota l binding in rat's microsac was significantl y decreased in poisoning model of 1～10 mmol.L-1 soman and diisopropylfl uorophosphate (DFP)in vitro(P<0.01).After soman (99μg.kg-1 b ody weight)was injected into subcutis of rats,the 3 H-GABA total bindi ng was also significantly decreased(P<0.05) when rat′s symptoms appear ed.After DFP(6mg.kg-1body weight) was injected intraperitoneally,the 3 H-GABA total binding was also significantly decreased(P<0.01 ).Conclusion:The results suggest that the nerve ag ent poisoning may influence on activity of GABA receptors in rats.
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Key words:Nerve agent; GABA receptor; Poisoning
神经毒剂(nerve agent)是一类主要引起胆碱能神经紊乱的有机磷酸酯类化合物(OP，or ganophosphates)，Szinicz报道中枢GABA受体可能是OP的一个作用部位[1，2]。本 实验采用大鼠脑末梢微囊作为研究GABA受体的靶器官，观察神经毒剂梭曼和丙氟磷急性中毒 时GABA受体的变化，探讨神经毒剂梭曼和丙氟磷急性中毒的非胆碱能机制，为神经毒剂急 性中毒的预防和治疗提供重要的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验器材：神经毒剂由军 事医学科学院毒物和药物所提供。3H-GABA，中国科学院上海原子能研究所。HEPES缓冲 液(pH＝7.4)。膜片闪烁液。49＃玻璃纤维滤纸：上海红光造纸厂产品。液体闪 烁液数仪LKB 1217-RACKBETA：瑞典LKB公司。
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1.2 实验动物：健康雄性Wist ar大鼠，体重200～250 g，由第三军医大学动物实验中心 提供，实验前所有动物在本实验室饲养1周以上，自由进水进食。
动物体内实验分组：分对照组、梭曼组和丙氟磷组，各染毒组分为未发作亚组和发作亚组， 每组或每个亚组随机分配大鼠5只。对照组：不加任何处理。梭曼组：1.095 g.kg-1 灌胃染毒；丙氟磷组：6 mg.kg-1腹腔注射染毒。染毒后1 h取大鼠脑作为未发亚 组，同时进行各组或各亚组大鼠脑神经末梢微囊的提取。
1.3 大鼠脑神经末梢微囊制备，Lowry法测定蛋白含量：参见文献[3]。
1.4 神经毒剂对GABA受体活性的影响： 参见文献[3]。
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1.5 统计处理：采用微软公司 的Excel程序包进行t检验分析处理。
2 实验结果
2.1 神经毒剂实验对GABA受体结合的影响： 体外实验结果表明，10 mmol.L-1 神经毒剂梭曼和丙氟磷均能显著地降低大鼠脑中GABA受体与配体的结合(见表1)。
2.2 神经毒剂对离体大鼠脑GABA受体结合曲线的影响：3H-GABA浓度在40、60、80、100 nmol.L-1时，1.0 mm ol.L-1的梭曼作用于离体大鼠脑GABA受体，结果实验组的3H-CPM值比总结 合值显著降低(P<0.05或P<0.01，图1)，1.0 mmol.L-1的丙氟磷却不 能显著地引起GABA受体的结合降低。
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表1 神经毒剂对GABA受体结合的影响(CPM,
±s,n ＝12) 处理因素
对照组
处理剂量(mmol.L-1)
10
1
梭曼
967±17
143±6 **
566±42**
丙氟磷
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843±101
343±54**
740±56
**P<0.01，与对照组比较
反应条件：1.0 g.L-1脑蛋白与30 nmol.L-1 3H-GABA在37℃
反应3 0 min
2.3 神经毒剂染毒对GABA受体结合的影响： 用6 mg.kg-1的丙氟磷或99 μg.k g-1的梭曼染毒大鼠，结果表明染毒组大鼠脑中GABA受体结合的3H-CPM值均较对 照组显著降低(P<0.01，见表2)。
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2.4 神经毒剂染毒对GABA受体结合曲线的影响：用99 μg.kg-1的梭曼皮下染 毒大鼠，大鼠抽搐发作时，发现实验组大鼠脑GABA受体的3H-CPM值在3H-GABA浓 度为40、80、100 nmol.L-1时比总结合值显 著降低(P<0.05)。用丙氟磷腹腔染毒大鼠，GABA受体的结合值显著降低(P<0.05 或P<0.01，见图2～4)。
表2 神经毒剂染毒对GABA受体的影响(CPM，±s ，n＝12) 惊厥
对照组
处理因素
梭曼
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丙氟磷
未出现
882±45
540±44 **
495±30**
出现
909±67
458±18**
382±16**
**P<0.01，与对照组比较。
反应条件：1.0 g.L-1脑蛋白与30 nmol.L-1 3H-GABA在37℃反应30 mi n。梭曼(99 μg.kg-1体重)皮下注射染毒，DFP(6 mg.kg-1体重)灌胃染毒 。
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图1 梭曼对体外GABA受体结合的影响
图2 梭曼染毒发作大鼠的GABA受体结合曲线
图3 DFP染毒未发作大鼠的GABA受体结合曲线
图4 DFP染毒发作大鼠的GABA受体结合曲线
3 讨论
神经毒剂可经多种途径吸收进入体内，引起中毒反应。以往的研究认为神经毒剂中毒引起胆 碱能系统变化。用胆碱能受体的作用机制能够解释神经毒剂急性中毒的大部分症状，但对中 毒时出现的脑神经系统变化，抽搐、惊厥、癫痫样发作则不能很好解释。GABAA受体是一 种氯离子通道受体，该受体有GABA、巴比妥、苯二氮卓艹类药物、印防已毒素、农药、酒 精以及TBPS的结合位点[3]。近来有研究认为GABA能系统也可能参与了某些OP的中 毒过程。
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动物实验发现惊厥、癫痫发作均与GABA受体的活性有关，抗癫痫药物通常采用GABA受体激动 剂。治疗中发现用少量的苯二氮卓艹 类药物，可以提高机体中GABA含量，从而消除有机磷引起的抽搐、癫痫样发作[5] 。
在大鼠体外实验中，10 mmol.L-1梭曼和丙氟磷均能显著地降低脑神经末梢微囊中G ABA受体与3H-GABA配体的结合(P<0.01)，1.0 mmol.L-1的梭曼仍能降低受 体与配 体的结合反应。在99 μk.kg-1的梭曼皮下染毒大鼠，或6 mg.kg-1的丙氟 磷腹腔染毒大鼠观察大鼠抽搐发作与未发作，取脑神经未梢微囊研究GABA受体的活性变化， 结果发现丙氟磷能显著引起GABA受体的结合降低(P<0.05或P<0.01)，梭曼在 大鼠 发作时GABA受体的结合显著降低(P<0.05)。GABA受体结合的降低，引起GABA受体的功 能发生改变，机体出现抽搐发作。有研究报道用DFP染毒猫，研究表明GABA受体参与了DFP的 中毒过程。用梭曼皮下染毒大鼠，发现GABA受体参与了梭曼的急性中毒反应，用安定和肟剂 及阿托品治疗梭曼中毒时具有明显的保护作用[7]。GABA受体数目减少，抑制GABA 功能，引起痉挛、抽搐、癫痫发作，这正是梭曼中毒时产生的症状。大脑海马区癫痫样发作 的阈值最低，GABA受体减少也最多[8]。
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总之，神经毒剂梭曼和丙氟磷中毒时所引起的GABA受体结合降低，是由神经毒剂直接作用于 受体而引起的，抑或是由于神经毒剂进入体内引起了其他变化，导致了GABA受体Cl-通道 的变化，还有待进一步研究。
作者简介：彭俊华(1966-)，男，硕士，主治医师
参考文献：
[1]Szinicz L.Nerve agent poisoning[J].Human and experimental toxic ology,1996,15(1):74.
[2]Gant DB,Eldefrswi ME,Eldefrdwi AT.Action of organophosphate on GA BAA rece ptors and voltage-dependent cholride channels[J].Fundanmental and applied tox icology,1987,9:698-704.
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[3]彭俊华，张 峰，齐心亮，等.介绍一种大脑中GABA受体的检测方法[J] .西北国防医学杂志，1999，20(4)：270-274.
[4]Sighart W.Structure and pharmacology of γ-aminobutyric acidA subtypes[J].Pharmacol Rew,1995,47:182-234.
[5]徐叔云，卞如濂.临床药理学[M].上海：上海科学技术出版社，1986. 48-49，75-79，92-98.
[6]Townsend AT,Adams DK,Lopez JB,et al.Effect of diisoopropylflu otophospha te on muscarinic and gamma-aminobutyric acid receptors in visual cortex of cat [J].Life sci,1991,49:1053-1060.
, 百拇医药
[7]Valdes JJ,Shih TM,Whalley C.Soman intoxication alters regional br ain muscar inic and GABA receptors[J].Pesticide Biochem and Physi.1985,24:355-361.
[8]Lallement G,Carpentier P,irmine PM,et al.Transient impairment of the GA BAergic function during initiation of soman-induced seizures[J].Brain researc h,1993,629:239-244.
收稿日期：1999-09-10 修回：1999-10-20, http://www.100md.com
单位：彭俊华(兰州军区兰州总医院检验科，甘肃 兰州 730050)；曹波(第三军医大学环 境卫生教研室，重庆 400038)；张峰(兰州军区兰州总医院检验科，甘肃 兰州 730050)；齐心亮(兰州军区兰州总医院检验科，甘肃 兰州 730050)；高宁(第三军医大学环 境卫生教研室，重庆 400038)
关键词：神经毒剂；GABA受体；中毒
西北国防医学杂志000422 摘要：目的：通过探讨γ-氨基丁酸(GABA)受体在神经毒 剂急性中毒时的活性状态，为临床治疗此类中毒引起的中枢惊厥症状提供新的思路。方法： 提取含大鼠脑神经末梢微囊GABA受体的匀浆液，通过大鼠体外实验、体内染毒实验(动物抽 搐发作和未发作)来观察GABA受体变化。结果：在体外实 验中，10 mmol.L-1的梭曼 和丙氟磷均能显著降低大鼠GABA配体与受体的结合率(P<0.01)，1 mmol.L-1 的梭曼仍能显著降低GABA受体的结合率(P<0.05)。大鼠皮下注射梭曼99 μg.kg -1发现3H-GABA的结合值在抽搐发作时显著降低；大鼠腹腔注射丙氟磷6 mg.kg-1，3H-GABA的结合值亦显著降低。结论：神经毒 剂在一定浓度下能 显著降低大鼠脑GABA受体的结合率，提示GABA受体参与了某些神经毒剂的急性中毒过程。
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中图分类号：R 827.172 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(2000)04-0300-03
Changes in binding activity of GABA receptor induced by nerve agen t poisoning in rats
PENG Jun-hua,CAO Bo,ZHANG Feng,et al.
(Department of Examinati on Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA,730050,China)
Abstract:Objective:To provide a new approach for cli nical treatment of acute con vulsion induced by acute nerve agent poisoning by measuring binding activity of GABA receptors.Methods:Activity of 3H-GABA binding to GABA receptor in rat's microsac was measured in acute poisoning model induced by nerve gas in vitro and in vivo.Results:The 3 H-GABA tota l binding in rat's microsac was significantl y decreased in poisoning model of 1～10 mmol.L-1 soman and diisopropylfl uorophosphate (DFP)in vitro(P<0.01).After soman (99μg.kg-1 b ody weight)was injected into subcutis of rats,the 3 H-GABA total bindi ng was also significantly decreased(P<0.05) when rat′s symptoms appear ed.After DFP(6mg.kg-1body weight) was injected intraperitoneally,the 3 H-GABA total binding was also significantly decreased(P<0.01 ).Conclusion:The results suggest that the nerve ag ent poisoning may influence on activity of GABA receptors in rats.
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Key words:Nerve agent; GABA receptor; Poisoning
神经毒剂(nerve agent)是一类主要引起胆碱能神经紊乱的有机磷酸酯类化合物(OP，or ganophosphates)，Szinicz报道中枢GABA受体可能是OP的一个作用部位[1，2]。本 实验采用大鼠脑末梢微囊作为研究GABA受体的靶器官，观察神经毒剂梭曼和丙氟磷急性中毒 时GABA受体的变化，探讨神经毒剂梭曼和丙氟磷急性中毒的非胆碱能机制，为神经毒剂急 性中毒的预防和治疗提供重要的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验器材：神经毒剂由军 事医学科学院毒物和药物所提供。3H-GABA，中国科学院上海原子能研究所。HEPES缓冲 液(pH＝7.4)。膜片闪烁液。49＃玻璃纤维滤纸：上海红光造纸厂产品。液体闪 烁液数仪LKB 1217-RACKBETA：瑞典LKB公司。
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1.2 实验动物：健康雄性Wist ar大鼠，体重200～250 g，由第三军医大学动物实验中心 提供，实验前所有动物在本实验室饲养1周以上，自由进水进食。
动物体内实验分组：分对照组、梭曼组和丙氟磷组，各染毒组分为未发作亚组和发作亚组， 每组或每个亚组随机分配大鼠5只。对照组：不加任何处理。梭曼组：1.095 g.kg-1 灌胃染毒；丙氟磷组：6 mg.kg-1腹腔注射染毒。染毒后1 h取大鼠脑作为未发亚 组，同时进行各组或各亚组大鼠脑神经末梢微囊的提取。
1.3 大鼠脑神经末梢微囊制备，Lowry法测定蛋白含量：参见文献[3]。
1.4 神经毒剂对GABA受体活性的影响： 参见文献[3]。
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2 实验结果
2.1 神经毒剂实验对GABA受体结合的影响： 体外实验结果表明，10 mmol.L-1 神经毒剂梭曼和丙氟磷均能显著地降低大鼠脑中GABA受体与配体的结合(见表1)。
2.2 神经毒剂对离体大鼠脑GABA受体结合曲线的影响：3H-GABA浓度在40、60、80、100 nmol.L-1时，1.0 mm ol.L-1的梭曼作用于离体大鼠脑GABA受体，结果实验组的3H-CPM值比总结 合值显著降低(P<0.05或P<0.01，图1)，1.0 mmol.L-1的丙氟磷却不 能显著地引起GABA受体的结合降低。
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表1 神经毒剂对GABA受体结合的影响(CPM,
±s,n ＝12) 处理因素对照组
处理剂量(mmol.L-1)
10
1
梭曼
967±17
143±6 **
566±42**
丙氟磷
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843±101
343±54**
740±56
**P<0.01，与对照组比较
反应条件：1.0 g.L-1脑蛋白与30 nmol.L-1 3H-GABA在37℃
反应3 0 min
2.3 神经毒剂染毒对GABA受体结合的影响： 用6 mg.kg-1的丙氟磷或99 μg.k g-1的梭曼染毒大鼠，结果表明染毒组大鼠脑中GABA受体结合的3H-CPM值均较对 照组显著降低(P<0.01，见表2)。
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2.4 神经毒剂染毒对GABA受体结合曲线的影响：用99 μg.kg-1的梭曼皮下染 毒大鼠，大鼠抽搐发作时，发现实验组大鼠脑GABA受体的3H-CPM值在3H-GABA浓 度为40、80、100 nmol.L-1时比总结合值显 著降低(P<0.05)。用丙氟磷腹腔染毒大鼠，GABA受体的结合值显著降低(P<0.05 或P<0.01，见图2～4)。
表2 神经毒剂染毒对GABA受体的影响(CPM，
±s ，n＝12) 惊厥对照组
处理因素
梭曼
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丙氟磷
未出现
882±45
540±44 **
495±30**
出现
909±67
458±18**
382±16**
**P<0.01，与对照组比较。
反应条件：1.0 g.L-1脑蛋白与30 nmol.L-1 3H-GABA在37℃反应30 mi n。梭曼(99 μg.kg-1体重)皮下注射染毒，DFP(6 mg.kg-1体重)灌胃染毒 。
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图1 梭曼对体外GABA受体结合的影响
图2 梭曼染毒发作大鼠的GABA受体结合曲线
图3 DFP染毒未发作大鼠的GABA受体结合曲线
图4 DFP染毒发作大鼠的GABA受体结合曲线
3 讨论
神经毒剂可经多种途径吸收进入体内，引起中毒反应。以往的研究认为神经毒剂中毒引起胆 碱能系统变化。用胆碱能受体的作用机制能够解释神经毒剂急性中毒的大部分症状，但对中 毒时出现的脑神经系统变化，抽搐、惊厥、癫痫样发作则不能很好解释。GABAA受体是一 种氯离子通道受体，该受体有GABA、巴比妥、苯二氮卓艹类药物、印防已毒素、农药、酒 精以及TBPS的结合位点[3]。近来有研究认为GABA能系统也可能参与了某些OP的中 毒过程。
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动物实验发现惊厥、癫痫发作均与GABA受体的活性有关，抗癫痫药物通常采用GABA受体激动 剂。治疗中发现用少量的苯二氮卓艹 类药物，可以提高机体中GABA含量，从而消除有机磷引起的抽搐、癫痫样发作[5] 。
在大鼠体外实验中，10 mmol.L-1梭曼和丙氟磷均能显著地降低脑神经末梢微囊中G ABA受体与3H-GABA配体的结合(P<0.01)，1.0 mmol.L-1的梭曼仍能降低受 体与配 体的结合反应。在99 μk.kg-1的梭曼皮下染毒大鼠，或6 mg.kg-1的丙氟 磷腹腔染毒大鼠观察大鼠抽搐发作与未发作，取脑神经未梢微囊研究GABA受体的活性变化， 结果发现丙氟磷能显著引起GABA受体的结合降低(P<0.05或P<0.01)，梭曼在 大鼠 发作时GABA受体的结合显著降低(P<0.05)。GABA受体结合的降低，引起GABA受体的功 能发生改变，机体出现抽搐发作。有研究报道用DFP染毒猫，研究表明GABA受体参与了DFP的 中毒过程。用梭曼皮下染毒大鼠，发现GABA受体参与了梭曼的急性中毒反应，用安定和肟剂 及阿托品治疗梭曼中毒时具有明显的保护作用[7]。GABA受体数目减少，抑制GABA 功能，引起痉挛、抽搐、癫痫发作，这正是梭曼中毒时产生的症状。大脑海马区癫痫样发作 的阈值最低，GABA受体减少也最多[8]。
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总之，神经毒剂梭曼和丙氟磷中毒时所引起的GABA受体结合降低，是由神经毒剂直接作用于 受体而引起的，抑或是由于神经毒剂进入体内引起了其他变化，导致了GABA受体Cl-通道 的变化，还有待进一步研究。
作者简介：彭俊华(1966-)，男，硕士，主治医师
参考文献：
[1]Szinicz L.Nerve agent poisoning[J].Human and experimental toxic ology,1996,15(1):74.
[2]Gant DB,Eldefrswi ME,Eldefrdwi AT.Action of organophosphate on GA BAA rece ptors and voltage-dependent cholride channels[J].Fundanmental and applied tox icology,1987,9:698-704.
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[3]彭俊华，张 峰，齐心亮，等.介绍一种大脑中GABA受体的检测方法[J] .西北国防医学杂志，1999，20(4)：270-274.
[4]Sighart W.Structure and pharmacology of γ-aminobutyric acidA subtypes[J].Pharmacol Rew,1995,47:182-234.
[5]徐叔云，卞如濂.临床药理学[M].上海：上海科学技术出版社，1986. 48-49，75-79，92-98.
[6]Townsend AT,Adams DK,Lopez JB,et al.Effect of diisoopropylflu otophospha te on muscarinic and gamma-aminobutyric acid receptors in visual cortex of cat [J].Life sci,1991,49:1053-1060.
, 百拇医药
[7]Valdes JJ,Shih TM,Whalley C.Soman intoxication alters regional br ain muscar inic and GABA receptors[J].Pesticide Biochem and Physi.1985,24:355-361.
[8]Lallement G,Carpentier P,irmine PM,et al.Transient impairment of the GA BAergic function during initiation of soman-induced seizures[J].Brain researc h,1993,629:239-244.
收稿日期：1999-09-10 修回：1999-10-20, http://www.100md.com