胎骨结合碱性成纤维细胞生长因子修复兔骨缺损
作者：沈红雷 吴军正 张东印 李峰 周君玲 刘小明
单位：沈红雷(解放军23医院外科，新疆 乌鲁木齐 830006)；张东印(解放军23医院外科，新疆 乌鲁木齐 830006)；周君玲(解放军23医院外科，新疆 乌鲁木齐 830006)；刘小明(解放军23医院外科，新疆 乌鲁木齐 830006)；吴军正(第四军医大学秦都口腔医学院口腔 生物学教研室)；李峰(第四军医大学秦都口腔医学院口腔 生物学教研室)
关键词：胎儿；骨；碱性成纤维细胞生长因子；骨不连；骨移植
第四军医大学学报000410 摘 要: 目的 研究胎儿骨结合碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)后诱导成骨的能力 . 方法 以胎儿骨(FB)作 为基因重组牛碱性成纤维细胞生长因子可吸收性载体,制备成复合碱性成纤维细胞生长因子 胎儿骨(bFGF/FB),将其植入兔桡骨中段15 mm人工缺损处,以单纯的FB,bFGF植入和空白作为 对照,在不同时间点进行X线摄片、组织切片、血管墨汁灌注和钙离子测定等方法观察,研 究各组骨缺损修复速度和愈合程度. 结果 bFGF/FB植入侧2 wk时骨缺损处有大 量间充质细胞聚集,4 wk时有少量新骨形成,6 wk时有部分骨小梁形成,胎儿骨大部被吸收,8 wk时胎儿骨完全被吸收,出现部分板层骨,骨髓腔部分再通,已部分塑形,钙含量明显高于其他 3组(P<0.01). 在不同时间点骨缺损修复程度bFGF/FB组明显优于FB组和bFGF组,而空白 组骨 缺损处被纤维组织及肌组织等填充. 在2 wk和4 wk bFGF/FB组与bFGF组的血管化程度优于FB 组与空白组. 结论 bFGF/FB可促进新骨形成,可用于骨缺损修复.
, 百拇医药
中图号:R687.34 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)04-0421-04
Bone repair of radial defects with bFGF/FB composition in rabbits
SHEN Hong-Lei ZHANG Dong-Yin ZHOU Jun-Ling LIU Xiao-Ming
(Department of Surgery,The 23rd Hospital of Chinese PLA,Urumqi 830006)
WU Jun-Zheng LI Feng
(Department of Oral Biology,Stomatological College,Fourth Military Medical University)
, 百拇医药
Abstract： AIM To study the feasibility of recombinant bovine ba sic fibroblast growth factor (bFGF) mixed with fetal bone(FB) as a carrier in the repair of segmental defects in rabbit′s radii. METHODS bF GF/FB composite was prepared and had been implanted in the 15 mm continuous defe cts i n radii of adult rabbits,while FB,bFGF or no graft were used as the controls. Th e animals were sacrificed 2,4,6 and 8 weeks after operation,the bone repair pr ocess was investigated using roentgenogram, histological observation,chinese i nk filling and Ca2+ level detection.RESULTS In bFGF/FB imp lanted group,mesenchymal cells were observed in the radial defects 2 weeks after surgery; new bone formation and bone trabeculation were found in 4 and 6 weeks; remodel ing of the new bone into lamella bone was observed and the defects were comple tely repaired in 8 weeks. Ca2+ content in the newly produced bone in the previ ous defects in bFGF/FB group was significantly higher than that in the ot her groups 8 weeks after operation(P<0.01). The radial defects in which b FGF/FB composite was implanted were repaired more rapidly than those with FB o r bFGF, and the radial defects in the control group was filled with fibrous and muscular tissues. The vascularization in bFGF/FB transplanted or bFGF a pplied areas was better than that in FB or the control group 2 and 4 weeks after operation. CONCLUSION bFGF/FB composite may be feasible for d iaphyseal defect restoration,and the combination of bFGF and FB is synergic in i nducing bone formation.
, 百拇医药
Keywords:fetus；bone；basic fibroblast growth factor；nonun ion of bone； bone transplantation
0 引言
骨折后骨缺损、骨不连的治疗是骨科临床研究的重要课题. 现在已证实骨折断端局 部 多种骨生长因子缺乏或活性不足以及局部血循环不良是形成骨不连的重要原因. 因此局部 应用某些外源性骨生长因子或血管生成因子可能对促进骨愈合有重要作用. 而采用胎儿骨(F B)作为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的可吸收性载体,即制备bFGF/FB复合物植入骨缺损处 ,可能对骨缺损修复和骨不连治疗有积极作用. 我们用bFGF/FB移植修复家兔桡骨连续性缺损 , 用X线摄片、组织学检查及骨痂钙含量测定方法, 观察其成骨效应、组织学反应以及修复 缺损的效果.
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 剖腹产方式获得胎兔10只, 取四肢骨,去除两端骨骺,质量3.6 g,剪 成2 mm长左右骨粒,经脱脂后冻干,质量1.2 g,分成24份,分别置入24个1 mL离心管内. 取6 支bFGF冻干品(4000 U/支,珠海东大生物制药有限公司)溶于6 mL无菌蒸馏水中并摇匀,每次 吸0.25 mL溶液(含bFGF 1000 U)加入一份装有胎兔骨的离心管中,将24支离心管放入真空 塔内抽负压, 溶液完全浸入胎兔骨,取出离心管,再冻干得到复合的bFGF/FB,把每份分别装入双层聚乙烯薄 膜内,环氧乙烷熏蒸消毒,置4℃冰箱保存.同样条件下10只胎兔去骨骺得四肢骨, 剪成2 mm左右骨粒,质量3.6 g,分 成24份,经脱脂后用无菌蒸馏水冲洗后,置入750 mL.L-1乙醇瓶中,加盖,4℃冰箱保存 . 术前取6支bFGF液(4000 U/支)溶于6 mL无菌蒸馏水中,并摇匀,分成24 份(含bFGF 1000 U/份). 新西兰纯种兔,购自本校实验动物中心,实验开始时兔龄 为6～8 mo,体质量为1.8～2.4 kg.
, 百拇医药
1.2 方法 选纯种新西兰白兔48只,随机分成12组,每组4只,进行植骨试验,每 组每种植骨材料或空白对照均做6个肢体,左右交替植入,尽量消除兔与兔之间、左右肢之间 的差异. 用30 g.L-1戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉动物,无菌条件下用金钢砂片将桡骨中 段 连同骨膜锯下,造成桡骨中段15 mm整齐人工缺损,分别植入bFGF/FB,FB和bFGF,缺损处不植入 任何材料者作为空白对照,左右肢交替植入,缝合深筋膜、皮肤,放回笼内饲养.实验动物分别于术后2,4,6,8 wk从上述12组动物中各取1只处死,按不同处 理组,每个时间点每种处理6个肢体.
1.2.1 X线拍片 双前肢去皮,腕肘关节离断,编号,取侧位,每组集中8个标本一 次拍片,观察新骨形成及骨缺损修复程度.
1.2.2 组织切片观察 每组4只兔在预定时间点处死取缺损处部分组织,40 g . L-1中性甲醛液固定,0.6 mol.L-1盐酸脱钙,常规脱水浸蜡,石蜡切片HE染色, 光镜下观察新骨形成情况,并照相.
, 百拇医药
1.2.3 墨汁灌注观察 每组4只兔在预定时间点用墨汁灌入兔血管内处死,取 骨缺损处组织,甲醛液固定, 0.6 mol.L-1 盐酸脱钙,常规脱水浸蜡包埋切片,光镜观 察骨缺损处血管化情况,并照相.
1.2.4 骨痂钙测定 术后4 wk和8 wk各12只兔处死后取部分骨缺损处骨痂组 织,分别称湿质量(mg),匀浆并离心,沉淀物用0.6 mol.L-1盐酸消化,用原子吸收分光 光度计测定钙含量(mg.g-1).
2 结果
2.1 X线摄片观察 2 wk时X线片显示,bFGF/FB组和FB组均表现为少 量骨性阴影,而bFGF组 和空白对照组表现为透亮阴影. 4 wk和6 wk X线片显示bFGF/FB组骨缺损处密度增高,新骨 形成 明显,FB组和bFGF组骨缺损处密度轻度增高,有少量新骨形成,而空白对照组仅在两断端处有 少量成骨阴影. 8 wk X线片显示bFGF/FB组在骨缺损处已桥接融合,并有髓腔形成和再通,FB 组从 两断端形成新骨向中间靠拢,没有形成桥接和髓腔再通,bFGF组骨缺损处已部分桥接,但密度 低于bFGF/FB组,而空白组除两断端有成骨阴影外,骨缺损中央仍是软组织阴影(Fig 1).
, 百拇医药
图 1 术后8 wk X线片显示骨缺损修复程度
Fig 1 X-ray film 8 wk after operation
2.2 组织学观察 2 wk时组织切片显示,bFGF/FB组骨缺损处可见 少量间充质细胞存在,无炎 性细胞浸润,无异物排斥反应. 4 wk和6 wk时可见大量间充质细胞,细胞大,核园,核分裂像 多 ,并有许多新生骨将骨床与移植物连接,移植物中有许多腔隙,沿腔壁排列着许多成骨细胞,周 围为新生的骨组织,8 wk时见腔隙变少,大部分为成熟的骨组织. 而FB组植入2 wk时也无异物 排斥反应,4 wk和6 wk时可见植入物周围少量间充质细胞,8 wk时植入物大部分被吸收,骨缺 损中央有少量新骨形成. bFGF组2 wk时见少量间充质细胞,4 wk和6 wk时见中量间充质细胞 和 少量新骨形成,8 wk时出现较多新骨,并与断端连接.空白对照组仅在两断端新生骨随时间延 长有所增多,其余骨缺损处均被纤维组织、脂肪组织和肌组织所填充(Fig 2).
, 百拇医药
2.3 血管墨汁灌注观察 在bFGF/FB组和bFGF组术后 2 wk和4 wk血管数量显著多 于FB组和空白对照组,4 wk bFGF/FB组血管已长入植入物中部,已有较多骨样组织形成. 6 wk 和8 wk时bFGF/FB组、FB组和bFGF组血管形成已无显著差异,而空白对照组在骨断端处有少 量新骨形成,其余均被纤维组织所填充,毛细血管稀少(Fig 3).
图 2 术后8 wk新骨形成
Fig 2 New bone formation 8 wk after operation HE ×40
New bone formation in bene-implanted defect in the experimental group ; Fibrotic tissue in the defect in the control group.
, http://www.100md.com
图 3 术后4 wk墨汁灌注显示血管化程度
Fig 3 Vascularization with Chinese ink filling of the samples,4 wk after o peration ×40
2.4 骨痂钙测定 采用原子吸收分光光度计测定与骨成熟关系较 密切而且数值较稳定的钙相对值,作统计学分析(Tab 1),4 wk钙方差分析结果F=2.19, P>0.05,各组间钙值无显著差异. 8 wk钙方差分析结果F=10.30,P<0.01,各组间 钙值存在显著差异. 作两两比较显示:bFGF/FB组和FB组、bFGF/FB组和bFGF组、bFGF/FB组和 空白对照组均存在显著差异(P<0.01),而FB组和bFGF组、FB组和空白对照组、bFGF组和 空白对照组均无显著差异(P>0.05).
表 1 原子吸收分光光度计测定钙质量分数结果
, 百拇医药
Tab 1 Mass fraction Ca2+ measured with atomic
absorptionspectrophotometer(n=6,
±s,mg.g-1) t/wk
bFGF/FB
FB
bFGF
Control
4
62±25
57±13
, 百拇医药
50±10
40±10
8
100±11
61±22
55±24
47±10
3 讨论
骨折后骨缺损、骨不连的治疗是骨科领域研究非常活跃的课题. 现在研究认为骨折断端 局部 多种骨生长因子缺乏或活性不足是形成骨不连的重要原因[1,2],故除基础治疗外, 局部应用 多种外源性生长因子可能对骨愈合有促进作用. Guacci D[3]在20世纪80年代末 期对人胫骨 骨不连组织超微结构研究中发现,软骨细胞的结构和功能似乎是正常的,但组织中血管数量少 ,栓塞形成,认为骨不连组织是有矿化能力的,但缺乏运输足量钙质的血供,是骨不连的真正原 因,因而设法改善骨断端的血供状态至关重要. bFGF最初是从牛脑垂体分离出来的一种蛋白 质,后来发现它在人体组织包括骨基质中也广泛存在. 在体外实验中bFGF可以直接刺激培养 中的成 软骨细胞增殖和分化,使其转化成软骨细胞或使成软骨细胞自身数量增加[4,5],也 可使体外 培养中的成骨细胞内DNA合成增加,从而增加了合成胶原蛋白的成骨细胞数量[6],且 可刺激成骨细胞骨钙素增加,加快骨的矿化[10]. 本研究表明,胎儿骨是一种理想的载体,它具有低抗原性、易吸收性和支架 能力,另外还具有成骨诱导能力.
, 百拇医药
表 2 术后8 wk各组间钙值两两比较
Tab 2 Comparison of Ca2+ value among the groups 8 wk after operation Comparison
q
Q0.05 (a,γ)
Q0.01(a,γ)
bFGF/FB vs FB
5.33
2.95
4.02a
, 百拇医药
bFGF/FB vs bFGF
6.11
3.85
4.64a
bFGF/FB vs control
7.23
3.96
5.02a
FB vs bFGF
0.78
2.95
4.02
, 百拇医药
FB vs control
1.90
3.58
4.64
bFGF vs control
1.12
2.95
4.02
aP<0.01.
我们采用胎儿骨作为bFGF可吸收性载体,即制备成复合的bFGF/FB,将其植入兔桡骨 中段 15 mm人工骨缺损处,术后8 wk X线片显示骨缺损处已桥接融合,并有髓腔形成(Fig 1), 明 显优于FB组、bFGF组和空白对照组;各时间点组织学切片显示bFGF/FB组的新骨形成量和骨 修复程度均优于FB组、bFGF组和空白对照组(Fig 2);术后8 wk钙测定结果显示bFGF/FB组钙 含量均高于FB,bFGF组和空白对照组(P<0.01)(Tab 1),以上实验结果显示,胎兔骨作为b FGF的可吸收性载体,已被证实其具有低抗原性,植入2 wk后作组织切片示无炎性细胞浸润,无 排斥反应,同时胎儿骨被吸收速度也符合新骨形成要求,在8 wk时基本被吸收,在吸收过程中 其具有非板层骨结构的特点,有利于宿主血管及间质细胞穿入,吸收后骨形成完全,其间无纤 维组织间杂,说明胎儿骨具有良好的支架能力,另外胎儿骨具有的诱导成骨能力是它作载体的 独特之处.由于胎儿骨本身是一种特殊形式的异体骨,能释放成骨诱导物质而具有诱导成骨能 力[11]. 同时在实验中已证实bFGF/FB复合物具有很强的诱导成骨作用,在各个时间 点新骨形 成量均优于FB组、bFGF组和空白对照组,这与bFGF具有的诱导成骨作用同胎兔骨的成骨诱导 能力产生的协同作用是分不开的. 另外血管墨汁灌注组织切片还显示了术后2 wk和4 wk时bF GF/FB组和bFGF组血管形成数量均多于FB组和空白对照组,但在术后6 wk和8 wk时bFGF/FB组 、FB组和bFGF组的血管数量无明显差异,空白对照组在骨缺损中央处组织中的毛细血管稀少( Fig 3),可能是bFGF对骨修复早期发挥作用的结果,但随着时间延长,bFGF随胎儿骨逐渐被吸 收而分解,从而失去其生物功能. bFGF/FB复合移植物具有较强的修复骨缺损能力,在诱导成 骨方面二者之间具有协同作用,有利于新骨形成,促进血管再生,可能在血运不佳的骨缺损和 骨不连的治疗中有应用前景.
, 百拇医药
基金项目：新疆军区科研基金资助课题(XH98011)
作者简介：沈红雷(1967-),男(汉族),江苏省锡山市人. 主治医师，硕士,发表论文3篇, Tel.(0991)4995801 Ext.245
参考文献:
[1] Frost HM. The biology of fracture healing. An overview for c linicians. Part I[J]. Clin Orthop,1989;248(11): 283-293.
[2] Aspenberg P, Lohmander LS, Thorngren KG. Failure of bone inductio n by bone matrix in adult monkeys[J]. J Bone Joint Surg(Br),1988;70(4): 625-627.
, 百拇医药
[3] Quacci D, Dell'Orbo C,Salvi M et al. Ultrastructural aspect of human nonuion[J]. Histol Histopathol, 1991;6(1):87-93.
[4] Bolander ME. Regulation of fracture repair by growth factors[ J]. Proc Soc Exp Biol Med,1992;200(2):165-171.
[5] Niswander L, Martin GR. FGF-4 and BMP-2 have opposite effects on limb growth[J]. Nature,1993;361(6407):68-71.
[6] Canalis E,Centrella M,McCarthy T. Effects of basic fibroblast gr owth factor on bone formation in vitro[J]. J Clin Invest,1988;81(5):15 72-1577.
, 百拇医药
[7] Globus RK,Plouet J,Gospodarowicz D. Cultured bovine bone ce lls synthesize fibroblast growth factor and store it in their extracellular matrix[J]. Endocrinology,1989;124(3):1539-1547.
[8] Gospodarowicz D.Fibroblast growth factor cjemical structure and bi ologic function[J]. Clin Orthop,1990;257(8): 231-248.
[9] Eppley BL, Doucet M, Connolly DT et al. Enhancement of angiog enesis by bFGF in mandibular bone graft healing in the rabbit[J]. J Ora l Maxillofac Surg, 1988;46(5):391-398.
[10] 陈新谦,傅 源,胡蕴玉 et al. 复合骨形态发生蛋白胎儿骨修复长骨缺损的实 验研究[J]. 中华骨科杂志,1997;17(2):120-123.
[11] 侯希敏,陈德喜,唐胜建 et al. 同种异体胎儿骨临床应用的研究[J]. 中华骨 科杂志,1990;10(6):411-414.
收稿日期:1999-05-05; 修回日期:1999-09-28, 百拇医药
单位：沈红雷(解放军23医院外科，新疆 乌鲁木齐 830006)；张东印(解放军23医院外科，新疆 乌鲁木齐 830006)；周君玲(解放军23医院外科，新疆 乌鲁木齐 830006)；刘小明(解放军23医院外科，新疆 乌鲁木齐 830006)；吴军正(第四军医大学秦都口腔医学院口腔 生物学教研室)；李峰(第四军医大学秦都口腔医学院口腔 生物学教研室)
关键词：胎儿；骨；碱性成纤维细胞生长因子；骨不连；骨移植
第四军医大学学报000410 摘 要: 目的 研究胎儿骨结合碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)后诱导成骨的能力 . 方法 以胎儿骨(FB)作 为基因重组牛碱性成纤维细胞生长因子可吸收性载体,制备成复合碱性成纤维细胞生长因子 胎儿骨(bFGF/FB),将其植入兔桡骨中段15 mm人工缺损处,以单纯的FB,bFGF植入和空白作为 对照,在不同时间点进行X线摄片、组织切片、血管墨汁灌注和钙离子测定等方法观察,研 究各组骨缺损修复速度和愈合程度. 结果 bFGF/FB植入侧2 wk时骨缺损处有大 量间充质细胞聚集,4 wk时有少量新骨形成,6 wk时有部分骨小梁形成,胎儿骨大部被吸收,8 wk时胎儿骨完全被吸收,出现部分板层骨,骨髓腔部分再通,已部分塑形,钙含量明显高于其他 3组(P<0.01). 在不同时间点骨缺损修复程度bFGF/FB组明显优于FB组和bFGF组,而空白 组骨 缺损处被纤维组织及肌组织等填充. 在2 wk和4 wk bFGF/FB组与bFGF组的血管化程度优于FB 组与空白组. 结论 bFGF/FB可促进新骨形成,可用于骨缺损修复.
, 百拇医药
中图号:R687.34 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)04-0421-04
Bone repair of radial defects with bFGF/FB composition in rabbits
SHEN Hong-Lei ZHANG Dong-Yin ZHOU Jun-Ling LIU Xiao-Ming
(Department of Surgery,The 23rd Hospital of Chinese PLA,Urumqi 830006)
WU Jun-Zheng LI Feng
(Department of Oral Biology,Stomatological College,Fourth Military Medical University)
, 百拇医药
Abstract： AIM To study the feasibility of recombinant bovine ba sic fibroblast growth factor (bFGF) mixed with fetal bone(FB) as a carrier in the repair of segmental defects in rabbit′s radii. METHODS bF GF/FB composite was prepared and had been implanted in the 15 mm continuous defe cts i n radii of adult rabbits,while FB,bFGF or no graft were used as the controls. Th e animals were sacrificed 2,4,6 and 8 weeks after operation,the bone repair pr ocess was investigated using roentgenogram, histological observation,chinese i nk filling and Ca2+ level detection.RESULTS In bFGF/FB imp lanted group,mesenchymal cells were observed in the radial defects 2 weeks after surgery; new bone formation and bone trabeculation were found in 4 and 6 weeks; remodel ing of the new bone into lamella bone was observed and the defects were comple tely repaired in 8 weeks. Ca2+ content in the newly produced bone in the previ ous defects in bFGF/FB group was significantly higher than that in the ot her groups 8 weeks after operation(P<0.01). The radial defects in which b FGF/FB composite was implanted were repaired more rapidly than those with FB o r bFGF, and the radial defects in the control group was filled with fibrous and muscular tissues. The vascularization in bFGF/FB transplanted or bFGF a pplied areas was better than that in FB or the control group 2 and 4 weeks after operation. CONCLUSION bFGF/FB composite may be feasible for d iaphyseal defect restoration,and the combination of bFGF and FB is synergic in i nducing bone formation.
, 百拇医药
Keywords:fetus；bone；basic fibroblast growth factor；nonun ion of bone； bone transplantation
0 引言
骨折后骨缺损、骨不连的治疗是骨科临床研究的重要课题. 现在已证实骨折断端局 部 多种骨生长因子缺乏或活性不足以及局部血循环不良是形成骨不连的重要原因. 因此局部 应用某些外源性骨生长因子或血管生成因子可能对促进骨愈合有重要作用. 而采用胎儿骨(F B)作为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的可吸收性载体,即制备bFGF/FB复合物植入骨缺损处 ,可能对骨缺损修复和骨不连治疗有积极作用. 我们用bFGF/FB移植修复家兔桡骨连续性缺损 , 用X线摄片、组织学检查及骨痂钙含量测定方法, 观察其成骨效应、组织学反应以及修复 缺损的效果.
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 剖腹产方式获得胎兔10只, 取四肢骨,去除两端骨骺,质量3.6 g,剪 成2 mm长左右骨粒,经脱脂后冻干,质量1.2 g,分成24份,分别置入24个1 mL离心管内. 取6 支bFGF冻干品(4000 U/支,珠海东大生物制药有限公司)溶于6 mL无菌蒸馏水中并摇匀,每次 吸0.25 mL溶液(含bFGF 1000 U)加入一份装有胎兔骨的离心管中,将24支离心管放入真空 塔内抽负压, 溶液完全浸入胎兔骨,取出离心管,再冻干得到复合的bFGF/FB,把每份分别装入双层聚乙烯薄 膜内,环氧乙烷熏蒸消毒,置4℃冰箱保存.同样条件下10只胎兔去骨骺得四肢骨, 剪成2 mm左右骨粒,质量3.6 g,分 成24份,经脱脂后用无菌蒸馏水冲洗后,置入750 mL.L-1乙醇瓶中,加盖,4℃冰箱保存 . 术前取6支bFGF液(4000 U/支)溶于6 mL无菌蒸馏水中,并摇匀,分成24 份(含bFGF 1000 U/份). 新西兰纯种兔,购自本校实验动物中心,实验开始时兔龄 为6～8 mo,体质量为1.8～2.4 kg.
, 百拇医药
1.2 方法 选纯种新西兰白兔48只,随机分成12组,每组4只,进行植骨试验,每 组每种植骨材料或空白对照均做6个肢体,左右交替植入,尽量消除兔与兔之间、左右肢之间 的差异. 用30 g.L-1戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉动物,无菌条件下用金钢砂片将桡骨中 段 连同骨膜锯下,造成桡骨中段15 mm整齐人工缺损,分别植入bFGF/FB,FB和bFGF,缺损处不植入 任何材料者作为空白对照,左右肢交替植入,缝合深筋膜、皮肤,放回笼内饲养.实验动物分别于术后2,4,6,8 wk从上述12组动物中各取1只处死,按不同处 理组,每个时间点每种处理6个肢体.
1.2.1 X线拍片 双前肢去皮,腕肘关节离断,编号,取侧位,每组集中8个标本一 次拍片,观察新骨形成及骨缺损修复程度.
1.2.2 组织切片观察 每组4只兔在预定时间点处死取缺损处部分组织,40 g . L-1中性甲醛液固定,0.6 mol.L-1盐酸脱钙,常规脱水浸蜡,石蜡切片HE染色, 光镜下观察新骨形成情况,并照相.
, 百拇医药
1.2.3 墨汁灌注观察 每组4只兔在预定时间点用墨汁灌入兔血管内处死,取 骨缺损处组织,甲醛液固定, 0.6 mol.L-1 盐酸脱钙,常规脱水浸蜡包埋切片,光镜观 察骨缺损处血管化情况,并照相.
1.2.4 骨痂钙测定 术后4 wk和8 wk各12只兔处死后取部分骨缺损处骨痂组 织,分别称湿质量(mg),匀浆并离心,沉淀物用0.6 mol.L-1盐酸消化,用原子吸收分光 光度计测定钙含量(mg.g-1).
2 结果
2.1 X线摄片观察 2 wk时X线片显示,bFGF/FB组和FB组均表现为少 量骨性阴影,而bFGF组 和空白对照组表现为透亮阴影. 4 wk和6 wk X线片显示bFGF/FB组骨缺损处密度增高,新骨 形成 明显,FB组和bFGF组骨缺损处密度轻度增高,有少量新骨形成,而空白对照组仅在两断端处有 少量成骨阴影. 8 wk X线片显示bFGF/FB组在骨缺损处已桥接融合,并有髓腔形成和再通,FB 组从 两断端形成新骨向中间靠拢,没有形成桥接和髓腔再通,bFGF组骨缺损处已部分桥接,但密度 低于bFGF/FB组,而空白组除两断端有成骨阴影外,骨缺损中央仍是软组织阴影(Fig 1).
, 百拇医药
图 1 术后8 wk X线片显示骨缺损修复程度
Fig 1 X-ray film 8 wk after operation
2.2 组织学观察 2 wk时组织切片显示,bFGF/FB组骨缺损处可见 少量间充质细胞存在,无炎 性细胞浸润,无异物排斥反应. 4 wk和6 wk时可见大量间充质细胞,细胞大,核园,核分裂像 多 ,并有许多新生骨将骨床与移植物连接,移植物中有许多腔隙,沿腔壁排列着许多成骨细胞,周 围为新生的骨组织,8 wk时见腔隙变少,大部分为成熟的骨组织. 而FB组植入2 wk时也无异物 排斥反应,4 wk和6 wk时可见植入物周围少量间充质细胞,8 wk时植入物大部分被吸收,骨缺 损中央有少量新骨形成. bFGF组2 wk时见少量间充质细胞,4 wk和6 wk时见中量间充质细胞 和 少量新骨形成,8 wk时出现较多新骨,并与断端连接.空白对照组仅在两断端新生骨随时间延 长有所增多,其余骨缺损处均被纤维组织、脂肪组织和肌组织所填充(Fig 2).
, 百拇医药
2.3 血管墨汁灌注观察 在bFGF/FB组和bFGF组术后 2 wk和4 wk血管数量显著多 于FB组和空白对照组,4 wk bFGF/FB组血管已长入植入物中部,已有较多骨样组织形成. 6 wk 和8 wk时bFGF/FB组、FB组和bFGF组血管形成已无显著差异,而空白对照组在骨断端处有少 量新骨形成,其余均被纤维组织所填充,毛细血管稀少(Fig 3).
图 2 术后8 wk新骨形成
Fig 2 New bone formation 8 wk after operation HE ×40
New bone formation in bene-implanted defect in the experimental group ; Fibrotic tissue in the defect in the control group.
, http://www.100md.com
图 3 术后4 wk墨汁灌注显示血管化程度
Fig 3 Vascularization with Chinese ink filling of the samples,4 wk after o peration ×40
2.4 骨痂钙测定 采用原子吸收分光光度计测定与骨成熟关系较 密切而且数值较稳定的钙相对值,作统计学分析(Tab 1),4 wk钙方差分析结果F=2.19, P>0.05,各组间钙值无显著差异. 8 wk钙方差分析结果F=10.30,P<0.01,各组间 钙值存在显著差异. 作两两比较显示:bFGF/FB组和FB组、bFGF/FB组和bFGF组、bFGF/FB组和 空白对照组均存在显著差异(P<0.01),而FB组和bFGF组、FB组和空白对照组、bFGF组和 空白对照组均无显著差异(P>0.05).
表 1 原子吸收分光光度计测定钙质量分数结果
, 百拇医药
Tab 1 Mass fraction Ca2+ measured with atomic
absorptionspectrophotometer(n=6,
±s,mg.g-1) t/wkbFGF/FB
FB
bFGF
Control
4
62±25
57±13
, 百拇医药
50±10
40±10
8
100±11
61±22
55±24
47±10
3 讨论
骨折后骨缺损、骨不连的治疗是骨科领域研究非常活跃的课题. 现在研究认为骨折断端 局部 多种骨生长因子缺乏或活性不足是形成骨不连的重要原因[1,2],故除基础治疗外, 局部应用 多种外源性生长因子可能对骨愈合有促进作用. Guacci D[3]在20世纪80年代末 期对人胫骨 骨不连组织超微结构研究中发现,软骨细胞的结构和功能似乎是正常的,但组织中血管数量少 ,栓塞形成,认为骨不连组织是有矿化能力的,但缺乏运输足量钙质的血供,是骨不连的真正原 因,因而设法改善骨断端的血供状态至关重要. bFGF最初是从牛脑垂体分离出来的一种蛋白 质,后来发现它在人体组织包括骨基质中也广泛存在. 在体外实验中bFGF可以直接刺激培养 中的成 软骨细胞增殖和分化,使其转化成软骨细胞或使成软骨细胞自身数量增加[4,5],也 可使体外 培养中的成骨细胞内DNA合成增加,从而增加了合成胶原蛋白的成骨细胞数量[6],且 可刺激成骨细胞骨钙素增加,加快骨的矿化[10]. 本研究表明,胎儿骨是一种理想的载体,它具有低抗原性、易吸收性和支架 能力,另外还具有成骨诱导能力.
, 百拇医药
表 2 术后8 wk各组间钙值两两比较
Tab 2 Comparison of Ca2+ value among the groups 8 wk after operation Comparison
q
Q0.05 (a,γ)
Q0.01(a,γ)
bFGF/FB vs FB
5.33
2.95
4.02a
, 百拇医药
bFGF/FB vs bFGF
6.11
3.85
4.64a
bFGF/FB vs control
7.23
3.96
5.02a
FB vs bFGF
0.78
2.95
4.02
, 百拇医药
FB vs control
1.90
3.58
4.64
bFGF vs control
1.12
2.95
4.02
aP<0.01.
我们采用胎儿骨作为bFGF可吸收性载体,即制备成复合的bFGF/FB,将其植入兔桡骨 中段 15 mm人工骨缺损处,术后8 wk X线片显示骨缺损处已桥接融合,并有髓腔形成(Fig 1), 明 显优于FB组、bFGF组和空白对照组;各时间点组织学切片显示bFGF/FB组的新骨形成量和骨 修复程度均优于FB组、bFGF组和空白对照组(Fig 2);术后8 wk钙测定结果显示bFGF/FB组钙 含量均高于FB,bFGF组和空白对照组(P<0.01)(Tab 1),以上实验结果显示,胎兔骨作为b FGF的可吸收性载体,已被证实其具有低抗原性,植入2 wk后作组织切片示无炎性细胞浸润,无 排斥反应,同时胎儿骨被吸收速度也符合新骨形成要求,在8 wk时基本被吸收,在吸收过程中 其具有非板层骨结构的特点,有利于宿主血管及间质细胞穿入,吸收后骨形成完全,其间无纤 维组织间杂,说明胎儿骨具有良好的支架能力,另外胎儿骨具有的诱导成骨能力是它作载体的 独特之处.由于胎儿骨本身是一种特殊形式的异体骨,能释放成骨诱导物质而具有诱导成骨能 力[11]. 同时在实验中已证实bFGF/FB复合物具有很强的诱导成骨作用,在各个时间 点新骨形 成量均优于FB组、bFGF组和空白对照组,这与bFGF具有的诱导成骨作用同胎兔骨的成骨诱导 能力产生的协同作用是分不开的. 另外血管墨汁灌注组织切片还显示了术后2 wk和4 wk时bF GF/FB组和bFGF组血管形成数量均多于FB组和空白对照组,但在术后6 wk和8 wk时bFGF/FB组 、FB组和bFGF组的血管数量无明显差异,空白对照组在骨缺损中央处组织中的毛细血管稀少( Fig 3),可能是bFGF对骨修复早期发挥作用的结果,但随着时间延长,bFGF随胎儿骨逐渐被吸 收而分解,从而失去其生物功能. bFGF/FB复合移植物具有较强的修复骨缺损能力,在诱导成 骨方面二者之间具有协同作用,有利于新骨形成,促进血管再生,可能在血运不佳的骨缺损和 骨不连的治疗中有应用前景.
, 百拇医药
基金项目：新疆军区科研基金资助课题(XH98011)
作者简介：沈红雷(1967-),男(汉族),江苏省锡山市人. 主治医师，硕士,发表论文3篇, Tel.(0991)4995801 Ext.245
参考文献:
[1] Frost HM. The biology of fracture healing. An overview for c linicians. Part I[J]. Clin Orthop,1989;248(11): 283-293.
[2] Aspenberg P, Lohmander LS, Thorngren KG. Failure of bone inductio n by bone matrix in adult monkeys[J]. J Bone Joint Surg(Br),1988;70(4): 625-627.
, 百拇医药
[3] Quacci D, Dell'Orbo C,Salvi M et al. Ultrastructural aspect of human nonuion[J]. Histol Histopathol, 1991;6(1):87-93.
[4] Bolander ME. Regulation of fracture repair by growth factors[ J]. Proc Soc Exp Biol Med,1992;200(2):165-171.
[5] Niswander L, Martin GR. FGF-4 and BMP-2 have opposite effects on limb growth[J]. Nature,1993;361(6407):68-71.
[6] Canalis E,Centrella M,McCarthy T. Effects of basic fibroblast gr owth factor on bone formation in vitro[J]. J Clin Invest,1988;81(5):15 72-1577.
, 百拇医药
[7] Globus RK,Plouet J,Gospodarowicz D. Cultured bovine bone ce lls synthesize fibroblast growth factor and store it in their extracellular matrix[J]. Endocrinology,1989;124(3):1539-1547.
[8] Gospodarowicz D.Fibroblast growth factor cjemical structure and bi ologic function[J]. Clin Orthop,1990;257(8): 231-248.
[9] Eppley BL, Doucet M, Connolly DT et al. Enhancement of angiog enesis by bFGF in mandibular bone graft healing in the rabbit[J]. J Ora l Maxillofac Surg, 1988;46(5):391-398.
[10] 陈新谦,傅 源,胡蕴玉 et al. 复合骨形态发生蛋白胎儿骨修复长骨缺损的实 验研究[J]. 中华骨科杂志,1997;17(2):120-123.
[11] 侯希敏,陈德喜,唐胜建 et al. 同种异体胎儿骨临床应用的研究[J]. 中华骨 科杂志,1990;10(6):411-414.
收稿日期:1999-05-05; 修回日期:1999-09-28, 百拇医药