降钙素基因相关肽对心肌细胞缺血缺氧 状态下胞内钙的影响
作者：商立军 臧益民 王春梅 臧伟进 董明清 陈贤明 王四旺
单位：商立军(第四军医大学基础部：安 710033)；董明清(第四军医大学基础部：生理学教研室，陕西 西安 710033)；王春梅(第四军医大学基础部：中心实验室，陕西 西安 710033)；臧伟进(西安医科大学心血管生理药理研究室，第四军医大学)；陈贤明(西安医科大学西京医院耳鼻咽喉科，第四军医大学)；王四旺(西安医科大学心药物研究所，第四军医大学)
关键词：降钙素基因相关肽；缺血；缺氧；心肌细胞；胞内钙；Fluo-3
第四军医大学学报000406 摘 要:目的 观察降钙素基因相关肽(CGRP)对急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状 态 下胞内钙的影响. 方法 急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状态下，以Fluo-3 作为钙指示剂，用共聚焦显微镜测定胞内钙的变化. 结果 急性缺血缺氧时， 心 肌细胞胞内钙浓度降低，加入CGRP后，钙浓度恢复；先加入CGRP,再在缺血缺氧的条件下， 胞内钙浓度基本保持不变. 结论 CGRP可恢复因急性缺血缺氧而导致的细胞内 钙浓度降低.
, http://www.100md.com
中图号：R311.36 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)04-0408-03
Effect of CGRP on intracellular calcium concentration in cardiomyocytes under is chemia and hypoxia conditions
SHANG Li-Jun1, ZANG Yi-Min1, WANG Chun-Mei2, ZANG Wei-Jin3, DONG Min g-Qing1, CHEN Xian-Ming4, WANG Si-Wang5
1Department of Physiology, 2Department of Central Laboratory,Faculty of Preclinical Medicine, 4Department of Otorhinolaryngology, Xijing Hospi tal, 5Institute of Materia Medica, Fourth Military Medical U niversity, Xi'an 710033, China,3Laboratory of Cardiovascular Physiology and Pharmacology, Xi'an Medical University
, http://www.100md.com
Abstract: AIM To observe the effect of CGRP on intracellu lar calcium concentration in acute isolated cardiomyocytesunder ischemia and hypoxia conditions. METHODS The acute isolated cardiomyocytes were rendered ische mia and hypoxi a, and intracellular calcium concentration was measured with the fluorescent Ca 2+ indicator Fluo-3 and laser scanning confocal microscopy. RESULTS Acute h ypoxia and ischemia induced the decrease of intracellular calcium concentration in acute isolated cardiomyocytes, while CGRP could reverse these changes. But th e intracellular calcium concentration almost remained steady when the acute isol ated cardiomyocytes were put under acute hypoxia and ischemia conditions followi ng the adding of CGRP. CONCLUSION CGRP can reverse the decrease of intracellular calcium concentration caused by acute hypoxia and ischemia.
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Keywords:CGRP; ischemia; hypoxia; cardiomyocytes; intrac ellular calcium; Fluo-3
0 引言
降钙素基因相关肽(CGRP)是一种内源性生物活性多肽，对心血管系统的活动具有十分重 要的调节作用，有明 显的抗心律失常作用，可引起正常及缺血状态下心肌细胞离子通道的变化，但其作用机制尚 有待进一步研究. 在模拟缺血缺氧状态下,我们用共聚焦显微镜结合Fluo-3染色技术,观察C GRP对急性分离心肌细胞胞内钙的影响.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 液体配置台氏液(单位为mmol.L-1) NaCl 143, KCl 5.40, Mg Cl2 0.50, CaCl2 1.80, HEPES 5.00, NaH2PO4 0.33, Glucose 5.50, pH值用NaOH调至7.35 . 无 钙台氏液：台氏液中去除 CaCl2即可. 含酶液：无钙台氏液中加入0.1 g.L-1胶原 酶和0.7 g.L-1的BSA. KB液(单位为 mmol.L-1)： L-glutamic acid 70, KCl 25, taurine 20, KH2PO4 10, MgCl2 3, HEPES 10, Glu cose 10, EGTA 0.50, pH值用KOH调至7.35. 模拟缺血缺氧液：台氏液中去除 Glucose,将 pH值降到6.8，且实验前用纯氮气饱和至少1 h. CGRP在实验前加入到台氏液中，最终浓度为 1 nmol.L-1.
, 百拇医药
1.1.2 豚鼠心肌细胞分离 豚鼠由本校实验动物中心提供，雌雄 不拘，体质量200～250 g，10 g.L-1戊巴比妥钠(ip 40 mg.kg-1)麻醉. 气管 插管后在正压人工呼吸状态下开胸，充分暴露心 脏和升主动脉，然后在原位进行主动脉插管，摘出心脏后置于Langendorff装置进行主动脉 逆向灌流(灌流与插管同步进行). 先用台氏液灌流3 min左右，复跳以充分冲洗冠脉内残 血，再用无钙台氏液灌流直至心脏完全停跳. 再用含有0.1 g.L-1胶原酶(Yakult,日 本)和0.7 g.L-1 BSA(华美公司)的无钙台氏液灌注约5 min，最后用KB液冲洗残酶 约5 min. 将心脏从Langendorff装置上取下，置于37℃ KB液中剪碎，温育，吹打5～10 m in. 经过滤后置于室温下静置1 h后进行实验. 整个灌流系统温度保持在37℃，所有液体均 用纯氧饱和.
, 百拇医药
1.2 方法 急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状态下胞内钙离子的测定原理: F luo-3是一种敏感性钙指示剂，能特异性地与Ca2+结合，并在一定波长激发光激发后 产生荧光，且与Ca2+结合后其荧光光谱发生变化，其荧光强度与Ca2+浓度 成正比，因而可用于观察Ca2+的动态变化，但Fluo-3 为极性大的酸性化合物，难以 进入细胞，而当其结合上亲脂的乙酰氢甲基酯成为脂溶性的Fluo-3/AM,再与细胞温育时， 很容易透过细胞膜，胞质内的非特异性酯酶将其酯解脱去脂基生成游离的Fluo-3.
1.2.1 Fluo-3/AM的负载 用台氏液洗涤标本2次后，于室温避光条件 下 用Fluo-3/AM(10 mg.L-1)负载细胞约30 min. Fluo-3/AM预先按1 g.L-1溶 于DMSO配制，混匀后存于-20℃. 然后将 细胞滴加到特制的培养皿中，静置贴壁后再用台氏液冲洗细胞2～3次，即可在激光共聚焦显 微镜下进行观察、测量.
, 百拇医药
1.2.2 细胞内钙的测定 将负载后的细胞放在特制的培养皿下，常温 下测定所选定的 细胞内的钙值，然后依实验条件分别加入含CGRP的台氏液、缺血缺氧液或正常台氏液，时间 间隔5～10 min,分别测定各时间点的钙值，动态扫描细胞内荧光强度变化. 我们使用的是 Bio Rad 公司的MRC-1024 LSCM，其单幅采样频率可达4 Hz，如需观察Ca2+的快速变 化，可线扫方式，则其采样频率为488 Hz. 与Ca2+结合的Fluo-3可以被488 nm的氩 离子激光激发，可在525 nm处探测到荧光发射，其荧光强度的变化可指示胞内游离钙浓度的 相对变化. 未经校对时虽不能得到[Ca2+]i的绝对值，但通过记录荧光强度 的变化，可观察到胞内[Ca2+]i的空间分布及药物等条件改变时胞内[ Ca2+]i的变化幅度.
2 结果
, 百拇医药
2.1 CGRP对缺血缺氧后胞内钙的影响 心肌急性缺血缺氧即刻，胞内 钙降低且基本稳定,1 min后加入CGRP可见胞内钙浓度迅速升高 ，5 min后继续升高，可上升到未缺血缺氧前的水平. 然后用台氏液洗脱上述作用，胞内钙 又回复到缺血缺氧后的状态(Fig 1).
2.2 预先加入CGRP再缺血缺氧时胞内钙的变化 先加入CGRP可略微 升高胞内钙的值，但不显著且随时间的延长，5 min及10 min升高的幅 度不大. 此时加入缺血缺氧液，胞内钙几乎没有变化；开始时整体都略有抬高，但3 min后 即恢复，10 min后用台氏液洗脱，胞内钙值能回复到静息状态的水平(Fig 2).
图 1 缺血缺氧后加入CGRP细胞内荧光光密度曲线
Fig 1 Intracellular fluorescence intensity curves under ischemia/hypoxia, and then with CGRP
, 百拇医药
图 2 预先加入CGRP再缺血缺氧时细胞内荧光光密度曲线
Fig 2 Intracellular fluorescence intensity curves under ischemia/hypoxi a with added CGRP in advance
3 讨论
细胞内游离Ca2+在细胞信息传递过程中起着重要的作用. [Ca2+] i能反映细胞的状态、药物和环境等对细胞的影响. 测量细胞内游离Ca2+的方法有 ：钙离子选择性微电极法 、放射示踪法和标记示踪法等[1]. 我们采用第三代Ca2+荧光指示剂Fluo-3 , 利用激 光共聚焦扫描技术来 观察胞内Ca2+的空间和时间变化. Fluo-3是唯一在可见光区有激发峰的荧光剂，可 以避免紫 外光对细胞的损害和激发自荧光倾向，它和Ca2+结合后荧光强度增强40倍,故Fluo-3 适用于观察Ca2+的空间分布和快速时间变化,是目前荧光剂中性能最优，应用最多的 一种.
, 百拇医药
CGRP对缺血缺氧时胞内钙的影响可能是各种因素共同作用的结果：首先,细胞处于 急性 缺血缺氧早期状态时，膜去极化可导致Ca2+内流减少，从而使胞内钙浓度降低. 同时 ，缺血 时细胞内ATP水平降低，可激活IK，ATP电流，使心肌细胞复极明显加速，从而使进入 细胞内 Ca2+减少. 再者,CGRP 可激活Ca2+通道，促进L型Ca2+内流增加，使胞 内钙浓度升高. 这可 能是因为CGRP通过作用于其特异受体，激活细胞内腺苷酸环化酶-环磷酸腺苷系统，引起cA M P增加,再激活某种蛋白激酶，使钙通道蛋白磷酸化，增加钙通道的开放概率和时间的缘故. 另外还有,Ca2+引起Ca2+释放(calcium-induced calcium release, CICR)的 机制等[2-4]. 我们的研究结果表明，在急性缺血缺氧时,急性分离心肌细胞胞内钙 浓度降低，CGRP可引起 胞内 钙浓度稍微升高，且可改变缺血缺氧引起的胞内钙浓度的降低. 这种钙的变化无疑改变了细 胞内环境的稳定，同时也说明胞内钙是受多种复杂因素调控的，其详细机制还需进一步实 验来阐明.
, 百拇医药
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970273)
作者简介：商立军(1969-), 男(汉族)，河南省济源市人. 讲师，博士生 (导师臧益民). 已发表论文30篇. Tel.(029)3374521
参考文献:
[1] Brandes R, Figueredo VM, Camacho SA et al. Quantitation of cytosolic [Ca2+]i in whole perfused rat hearts using indo-1 fluorome try[J], Biophys J, 1993;65:1973-1979.
[2] Cornfield DN, Stevens T, Mcmurtry IF et al. Hypoxia-induced i ncrease in fetal pulmonary artery smooth muscle cell [Ca2+]i is mediat ed by entry of Ca2+ through voltage-operated Ca2+ channels (A bstract)[J]. Pediatr Res, 1993;33:320-321.
, 百拇医药
[3] Berridge MJ. Elementary and global aspects of calcium signalling [J]. J Physiol, 1997;499(2):291-306.
[4] Lopez-lopez JR, Shacklock PS, Balke CW et al. Local calcium tra nsients triggered by single L-type calcium channel currents in cardiac cells[J ]. Science,1995;268(5213):1042-1045.
收稿日期:1999-08-23; 修回日期:1999-10-25, 百拇医药
单位：商立军(第四军医大学基础部：安 710033)；董明清(第四军医大学基础部：生理学教研室，陕西 西安 710033)；王春梅(第四军医大学基础部：中心实验室，陕西 西安 710033)；臧伟进(西安医科大学心血管生理药理研究室，第四军医大学)；陈贤明(西安医科大学西京医院耳鼻咽喉科，第四军医大学)；王四旺(西安医科大学心药物研究所，第四军医大学)
关键词：降钙素基因相关肽；缺血；缺氧；心肌细胞；胞内钙；Fluo-3
第四军医大学学报000406 摘 要:目的 观察降钙素基因相关肽(CGRP)对急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状 态 下胞内钙的影响. 方法 急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状态下，以Fluo-3 作为钙指示剂，用共聚焦显微镜测定胞内钙的变化. 结果 急性缺血缺氧时， 心 肌细胞胞内钙浓度降低，加入CGRP后，钙浓度恢复；先加入CGRP,再在缺血缺氧的条件下， 胞内钙浓度基本保持不变. 结论 CGRP可恢复因急性缺血缺氧而导致的细胞内 钙浓度降低.
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中图号：R311.36 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)04-0408-03
Effect of CGRP on intracellular calcium concentration in cardiomyocytes under is chemia and hypoxia conditions
SHANG Li-Jun1, ZANG Yi-Min1, WANG Chun-Mei2, ZANG Wei-Jin3, DONG Min g-Qing1, CHEN Xian-Ming4, WANG Si-Wang5
1Department of Physiology, 2Department of Central Laboratory,Faculty of Preclinical Medicine, 4Department of Otorhinolaryngology, Xijing Hospi tal, 5Institute of Materia Medica, Fourth Military Medical U niversity, Xi'an 710033, China,3Laboratory of Cardiovascular Physiology and Pharmacology, Xi'an Medical University
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Abstract: AIM To observe the effect of CGRP on intracellu lar calcium concentration in acute isolated cardiomyocytesunder ischemia and hypoxia conditions. METHODS The acute isolated cardiomyocytes were rendered ische mia and hypoxi a, and intracellular calcium concentration was measured with the fluorescent Ca 2+ indicator Fluo-3 and laser scanning confocal microscopy. RESULTS Acute h ypoxia and ischemia induced the decrease of intracellular calcium concentration in acute isolated cardiomyocytes, while CGRP could reverse these changes. But th e intracellular calcium concentration almost remained steady when the acute isol ated cardiomyocytes were put under acute hypoxia and ischemia conditions followi ng the adding of CGRP. CONCLUSION CGRP can reverse the decrease of intracellular calcium concentration caused by acute hypoxia and ischemia.
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Keywords:CGRP; ischemia; hypoxia; cardiomyocytes; intrac ellular calcium; Fluo-3
0 引言
降钙素基因相关肽(CGRP)是一种内源性生物活性多肽，对心血管系统的活动具有十分重 要的调节作用，有明 显的抗心律失常作用，可引起正常及缺血状态下心肌细胞离子通道的变化，但其作用机制尚 有待进一步研究. 在模拟缺血缺氧状态下,我们用共聚焦显微镜结合Fluo-3染色技术,观察C GRP对急性分离心肌细胞胞内钙的影响.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 液体配置台氏液(单位为mmol.L-1) NaCl 143, KCl 5.40, Mg Cl2 0.50, CaCl2 1.80, HEPES 5.00, NaH2PO4 0.33, Glucose 5.50, pH值用NaOH调至7.35 . 无 钙台氏液：台氏液中去除 CaCl2即可. 含酶液：无钙台氏液中加入0.1 g.L-1胶原 酶和0.7 g.L-1的BSA. KB液(单位为 mmol.L-1)： L-glutamic acid 70, KCl 25, taurine 20, KH2PO4 10, MgCl2 3, HEPES 10, Glu cose 10, EGTA 0.50, pH值用KOH调至7.35. 模拟缺血缺氧液：台氏液中去除 Glucose,将 pH值降到6.8，且实验前用纯氮气饱和至少1 h. CGRP在实验前加入到台氏液中，最终浓度为 1 nmol.L-1.
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1.1.2 豚鼠心肌细胞分离 豚鼠由本校实验动物中心提供，雌雄 不拘，体质量200～250 g，10 g.L-1戊巴比妥钠(ip 40 mg.kg-1)麻醉. 气管 插管后在正压人工呼吸状态下开胸，充分暴露心 脏和升主动脉，然后在原位进行主动脉插管，摘出心脏后置于Langendorff装置进行主动脉 逆向灌流(灌流与插管同步进行). 先用台氏液灌流3 min左右，复跳以充分冲洗冠脉内残 血，再用无钙台氏液灌流直至心脏完全停跳. 再用含有0.1 g.L-1胶原酶(Yakult,日 本)和0.7 g.L-1 BSA(华美公司)的无钙台氏液灌注约5 min，最后用KB液冲洗残酶 约5 min. 将心脏从Langendorff装置上取下，置于37℃ KB液中剪碎，温育，吹打5～10 m in. 经过滤后置于室温下静置1 h后进行实验. 整个灌流系统温度保持在37℃，所有液体均 用纯氧饱和.
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1.2 方法 急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状态下胞内钙离子的测定原理: F luo-3是一种敏感性钙指示剂，能特异性地与Ca2+结合，并在一定波长激发光激发后 产生荧光，且与Ca2+结合后其荧光光谱发生变化，其荧光强度与Ca2+浓度 成正比，因而可用于观察Ca2+的动态变化，但Fluo-3 为极性大的酸性化合物，难以 进入细胞，而当其结合上亲脂的乙酰氢甲基酯成为脂溶性的Fluo-3/AM,再与细胞温育时， 很容易透过细胞膜，胞质内的非特异性酯酶将其酯解脱去脂基生成游离的Fluo-3.
1.2.1 Fluo-3/AM的负载 用台氏液洗涤标本2次后，于室温避光条件 下 用Fluo-3/AM(10 mg.L-1)负载细胞约30 min. Fluo-3/AM预先按1 g.L-1溶 于DMSO配制，混匀后存于-20℃. 然后将 细胞滴加到特制的培养皿中，静置贴壁后再用台氏液冲洗细胞2～3次，即可在激光共聚焦显 微镜下进行观察、测量.
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1.2.2 细胞内钙的测定 将负载后的细胞放在特制的培养皿下，常温 下测定所选定的 细胞内的钙值，然后依实验条件分别加入含CGRP的台氏液、缺血缺氧液或正常台氏液，时间 间隔5～10 min,分别测定各时间点的钙值，动态扫描细胞内荧光强度变化. 我们使用的是 Bio Rad 公司的MRC-1024 LSCM，其单幅采样频率可达4 Hz，如需观察Ca2+的快速变 化，可线扫方式，则其采样频率为488 Hz. 与Ca2+结合的Fluo-3可以被488 nm的氩 离子激光激发，可在525 nm处探测到荧光发射，其荧光强度的变化可指示胞内游离钙浓度的 相对变化. 未经校对时虽不能得到[Ca2+]i的绝对值，但通过记录荧光强度 的变化，可观察到胞内[Ca2+]i的空间分布及药物等条件改变时胞内[ Ca2+]i的变化幅度.
2 结果
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2.1 CGRP对缺血缺氧后胞内钙的影响 心肌急性缺血缺氧即刻，胞内 钙降低且基本稳定,1 min后加入CGRP可见胞内钙浓度迅速升高 ，5 min后继续升高，可上升到未缺血缺氧前的水平. 然后用台氏液洗脱上述作用，胞内钙 又回复到缺血缺氧后的状态(Fig 1).
2.2 预先加入CGRP再缺血缺氧时胞内钙的变化 先加入CGRP可略微 升高胞内钙的值，但不显著且随时间的延长，5 min及10 min升高的幅 度不大. 此时加入缺血缺氧液，胞内钙几乎没有变化；开始时整体都略有抬高，但3 min后 即恢复，10 min后用台氏液洗脱，胞内钙值能回复到静息状态的水平(Fig 2).
图 1 缺血缺氧后加入CGRP细胞内荧光光密度曲线
Fig 1 Intracellular fluorescence intensity curves under ischemia/hypoxia, and then with CGRP
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图 2 预先加入CGRP再缺血缺氧时细胞内荧光光密度曲线
Fig 2 Intracellular fluorescence intensity curves under ischemia/hypoxi a with added CGRP in advance
3 讨论
细胞内游离Ca2+在细胞信息传递过程中起着重要的作用. [Ca2+] i能反映细胞的状态、药物和环境等对细胞的影响. 测量细胞内游离Ca2+的方法有 ：钙离子选择性微电极法 、放射示踪法和标记示踪法等[1]. 我们采用第三代Ca2+荧光指示剂Fluo-3 , 利用激 光共聚焦扫描技术来 观察胞内Ca2+的空间和时间变化. Fluo-3是唯一在可见光区有激发峰的荧光剂，可 以避免紫 外光对细胞的损害和激发自荧光倾向，它和Ca2+结合后荧光强度增强40倍,故Fluo-3 适用于观察Ca2+的空间分布和快速时间变化,是目前荧光剂中性能最优，应用最多的 一种.
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CGRP对缺血缺氧时胞内钙的影响可能是各种因素共同作用的结果：首先,细胞处于 急性 缺血缺氧早期状态时，膜去极化可导致Ca2+内流减少，从而使胞内钙浓度降低. 同时 ，缺血 时细胞内ATP水平降低，可激活IK，ATP电流，使心肌细胞复极明显加速，从而使进入 细胞内 Ca2+减少. 再者,CGRP 可激活Ca2+通道，促进L型Ca2+内流增加，使胞 内钙浓度升高. 这可 能是因为CGRP通过作用于其特异受体，激活细胞内腺苷酸环化酶-环磷酸腺苷系统，引起cA M P增加,再激活某种蛋白激酶，使钙通道蛋白磷酸化，增加钙通道的开放概率和时间的缘故. 另外还有,Ca2+引起Ca2+释放(calcium-induced calcium release, CICR)的 机制等[2-4]. 我们的研究结果表明，在急性缺血缺氧时,急性分离心肌细胞胞内钙 浓度降低，CGRP可引起 胞内 钙浓度稍微升高，且可改变缺血缺氧引起的胞内钙浓度的降低. 这种钙的变化无疑改变了细 胞内环境的稳定，同时也说明胞内钙是受多种复杂因素调控的，其详细机制还需进一步实 验来阐明.
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基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970273)
作者简介：商立军(1969-), 男(汉族)，河南省济源市人. 讲师，博士生 (导师臧益民). 已发表论文30篇. Tel.(029)3374521
参考文献:
[1] Brandes R, Figueredo VM, Camacho SA et al. Quantitation of cytosolic [Ca2+]i in whole perfused rat hearts using indo-1 fluorome try[J], Biophys J, 1993;65:1973-1979.
[2] Cornfield DN, Stevens T, Mcmurtry IF et al. Hypoxia-induced i ncrease in fetal pulmonary artery smooth muscle cell [Ca2+]i is mediat ed by entry of Ca2+ through voltage-operated Ca2+ channels (A bstract)[J]. Pediatr Res, 1993;33:320-321.
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[3] Berridge MJ. Elementary and global aspects of calcium signalling [J]. J Physiol, 1997;499(2):291-306.
[4] Lopez-lopez JR, Shacklock PS, Balke CW et al. Local calcium tra nsients triggered by single L-type calcium channel currents in cardiac cells[J ]. Science,1995;268(5213):1042-1045.
收稿日期:1999-08-23; 修回日期:1999-10-25, 百拇医药