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编号:10276615
汉坦病毒感染体外诱导VeroE6细胞热休克蛋白的表达
http://www.100md.com 《第四军医大学学报》 2000年第4期
     作者:叶苓 廖文俊 刘彦仿 杨守京

    单位:叶苓(第四军医大学基础部病理学教研室,陕西 西安 710033);廖文俊(第四军医大学基础部病理学教研室,陕西 西安 710033);刘彦仿(第四军医大学基础部病理学教研室,陕西 西安 710033);杨守京(第四军医大学基础部病理学教研室,陕西 西安 710033)

    关键词:热休克蛋白;汉坦病毒;VeroE6细胞

    摘 要摘 要:目的 研究汉坦病毒(HTV)感染后对细胞应激基因表达的影响. 方法 用HTV感染其敏感细胞 株VeroE6细胞,用Western印迹杂交、RNA斑点杂交及原位杂交分别分析热休克蛋白(HSP)的 表达及 编码HSP的mRNA水平的变化. 结果 病毒感染后细胞内HSP70及热休克蛋白mRNA 水平均有增高 ,而HSP65及HSP27的表达则无明显改变. 结论 HTV感染可以直接诱导HSP7 0的高表达,可能在保护细胞免受病毒感染损伤方面具有一定意义.
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    中图号:R373.32 文献标识码:A

    文章编号:1000-2790(2000)04-0399-03

    The expression of heat shock proteins in the veroE6 cells induced by Hantaan vir us infection in vitro

    YE Ling, LIAO Wen-Jun, LIU Yan-Fang, YANG Shou-Jing

    (Department of Pathology, Faculty of Preclinical Medicine,Fourth Military Medical University Xi’an 710033,China)

    Abstract:AIM To investigate the effect of Hantaan virus i nfection on the expression of stress genes. METHODS Virus infec tion, Western blot, RNA dot blot and in situ hybridization were employed. RESULTS The express ion of HSP70 was enhanced. The level of HSP70 mRNA was increased,but the expres sion of HSP65 and HSP27 remained unchanged. CONCLUSION The overe xpression of HSP70 can be in duced directly by Hantaan virus, which may play a role in the protection of cell s from virus infection.
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    Keywords: heat shock proteins; Hantaan virus; veroE6 cell

    0引言

    应激反应是广泛存在于包括原核至真核生物界的一种对外界有害刺激的保护性反应 ,以表达热休克蛋白(heart shock proteins,HSP)为特征[1]. 已有一些体外实 验证实,细胞 在受到某些病毒感染后可以诱导HSP的产生,但对汉坦病毒(Hantaan virus,HTV)感染与HS P表达间 关系尚未见报道. 我们用A9株感染病毒敏感细胞株VeroE6细胞,观察并检测了病毒 感染后细胞内HSP表达和HSP70 mRNA水平的改变情况,以期了解HTV感染对细胞的影响及 细胞对HTV感染的应激反应.

    1 材料和方法

    1.1 材料 非洲绿猴肾上皮细胞(VeroE6细胞)和抗HTV NP组特异性mAb (中国预防医学科 学院病毒所,本室保存);HTV A9株乳鼠脑悬液(中国预防医学科学院病毒所馈赠). 鼠 抗 人HSP70 mAb,鼠抗人HSP65 mAb、山羊抗人HSP27多克隆抗体(美国Santa Cruz 公司),H RP-驴抗山羊IgG,HRP-羊抗鼠 IgG(武汉博士德生物制品公司). 同位素[α32P] -dATP(北京亚辉生物医学工程公司),核酸标记及检测试剂盒(德国Boehringer Mannhei m公司).
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    1.2 方法 VeroE6细胞在含50 mL.L-1胎牛血清的RPMI 1640培养基中培 养,将细胞分为2组,第1组为病毒感染组,待细胞至60%融合时,倒掉大部分培养液,接种 汉坦病毒A9株100 μL,置37℃病毒吸附1 h后换新鲜培养液,分别于感染后4,8,24,72 h 及5 d时收集被感染细胞,提取细胞内RNA和蛋白质,于同样时间收取少量细胞涂片做 原位杂 交检测. 第2组为模拟感染组,与感染组同时倒掉大部分培养液但不加入病毒,1 h后换培养 液,与感染组同样时间段收取细胞做相应检测. 用DNA合成仪合成HSP70相应的寡核苷酸探针,用[α32P]-dATP5′-末端标记法 制备探针,以进行RNA斑点杂交. ①RNA斑点杂交:用异硫氰 酸胍一步法提取细胞总RNA,将20 μg总RNA点于尼龙膜上,置于真空干燥箱中80℃烤膜2 h ,2×SSPE洗 膜,42℃预杂交2 h,加入[α32P]-HSP70寡核苷酸探针42℃杂交过夜,次日用2× SSPE洗膜数次,放射自显影. ②Western印迹杂交: 收集不同时间点的感染组及模拟感染组VeroE6细胞的细胞内总蛋白 , -20℃保存待用. 取等量的两组待测蛋白进行120 g.L-1 SDS-PAGE电泳,用Bio -Rad微型电转移系统将蛋白质转印至硝酸纤维素膜上进行Western印迹杂交分析. ③原位杂交: 质粒PHHSP70和pGs分别含HSP72基因cDNA片段及汉坦病毒S 片段,分别经适当酶切,冻溶 法 回收特异性片段,加热变性后用异羟基洋地黄毒苷配基-11-dUTP (Digoxigen-11-dUTP )随 机引物延伸法标记制备探针. 细胞铺片,40 g.L-1多聚甲醛后固定,逐级乙醇脱水 ,加探针42℃杂交12 h, SSC振洗,逐级乙醇脱水,加碱性磷酸酶标记的抗Dig抗体检测,N BT/BCIP呈色.
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    2 结果

    2.1 汉坦病毒感染后HSP70蛋白表达 未感染组在27,65,70 ku均可见到一 条着色带,但颜色较浅;病毒感染后4 h组在70 ku的染色带颜色加深,提示HSP70表达增强 ,这种高 表达持续至感染后3~4 d,以后HSP70表达恢复至正常(Fig 1). HSP65和HSP27则无明显变化 . 汉坦病毒NP蛋白的表达于感染后3 d可被检出,表现为在47 ku处出现一条着色带,第 5日 组着色带明显加深(Fig 2).t40001.gif (3281 字节)

    图 1 汉坦病毒感染后不同时间HSP70免疫印迹杂交

    Fig 1 HSP70 Western blot after different periods of Hantaan virus infectio n
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    A:4 h; B:8 h; C:24 h; D:3 d; E:5 d; F:mock infection; G: normal control.

    2.2 汉坦病毒感染诱导HSP70 mRNA表达 病毒感 染后4 h时HSP70 mRNA即增高,且持续至感染后3 d,以后HSP70 mRNA水平逐渐恢复至正常水 平(Fig 3).

    2.3 原位杂交 感染后4 h组即可见细胞内HSP70 mRNA水平增高,表现为细胞质 内紫蓝色阳性杂 交信号,8 h组结果与4 h组一致(Fig 4),以后各组阳性信号逐渐减弱至正常水平. 而模拟 感染组个别细胞内可见较弱的紫蓝色阳性杂交信号.t40002.gif (1759 字节)

    图 2 汉坦病毒感染后不同时间病毒核蛋白免疫印迹杂交
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    Fig 2 VNP Western blot after different periods of Hantaan virus infection

    [ HT6]A:Normal control; B: 4 h; C:24 h; D:3 d; E:4 d; F:5 d.t40003.gif (2935 字节)

    图 3 汉坦病毒感染后HSP70 mRNA斑点杂交

    Fig 3 HSP70 mRNA dot blot after virus infection

    N:normal control; M:mock infection.t40004.gif (9903 字节)
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    图 4 汉坦病毒感染后8 h VeroE6细胞HSP70mRNA原位杂交示细胞内紫蓝色阳性颗粒

    Fig 4 HSP70 mRNA in situ hybridization: dark-blue granules in VeroE6 cytoplasm 8 h after virus infection ×400

    3 讨论

    已有一些体外实验证实,细胞在受到某些病毒(包括DNA和RNA病毒)感染 后可以诱导HSP家族不同成员的过度表达[2,4],而且不同的病毒感染不同类型的 细胞诱导 HSP家族成员的表达也不同(包括被诱导的HSP的类型及数量),说明机体对不同类型病毒 感染的反应是特异性的[5]. 关于HTV感染能否诱导HSP表达,诱导何种HSP表达及 其表达与 病毒感染间的关系尚未见报道. 我们曾对流行性出血热尸检组织中HSP70的表达进行过检测, 发现有HSP70的表达[6,7]. 但HSP70的表达诱因可能是病毒感染,免疫反应或局部损 伤因素所 致. 我们用汉坦病毒A9株在体外感染病毒敏感细胞株VeroE6细胞,目的在于排除了体内炎 症、局部损伤和免疫反应等的影响(因为这些因素也可诱导HSP的产生),独立地观察病毒 感染本身是否也能直接诱导了HSP的合成. 用免疫印迹杂交法检测了病毒感染后不同时间点 收集的细胞内总蛋白中HSP70,HSP65,HSP27和HTV NP蛋白的表达情况,结果发现在感染后4 ~8 h即可见HSP70的表达量增加,24~72 h HSP70表达量最高,以后恢复至正常. 提示汉坦 病 毒感染可以诱导HSP70的表达,而HSP27和HSP65则未见明显改变. 在本实验中,于不同时间 点分别提取细胞内总RNA进行RNA斑点杂交及不同时间点的细胞铺片进行的原位杂交,结果观 察到病毒感染后细胞内HSP70 mRNA水平的增高,提示汉坦病毒感染诱导的HSP70表达的增高 是在转录水平的调节.
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    关于病毒感染后HSP出现的意义目前尚无定论,一般认为HSP可能干扰了病毒蛋白的 产 生和装配[8,9],从而保护细胞免受病毒感染的损伤. 也有报道认为HSP参与病毒 的复制、 整合[10]. 有关汉坦病毒诱导细胞表达HSP70的确切意义,将在进一步的实验中予 以证实.

    基金项目:国家自然科学基金资助项目(39770664)

    作者简介:叶苓(1963-),女(汉族),山西省长治市人. 博士,发表论文1 0篇. 现工作单位: 广州中山医科大学基础医学院博士后流动站. Tel.(020)87330566(O) E mail.yelingy@163.net

    参考文献:

    [1] Feige U, Polla BS. Heat shock proteins:The HSP70 -a multi-g ene,multi-structure,-function family with potential clinical applications [J]. Experientia, 1994;50(11-12):979-986.
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    [2] Jindal S, Markovsky M. Stress responses to viral infection[J]. Trends Microbiol,1994;2(3):89-91.

    [3] Santomenna LD, Colberg-Poley AM. Induction of cellular HSP70 exp ression by human cytomegalovirus[J]. J Virol,1990;64(5):2033-2040.

    [4] Sagara J,Kawai A. Identification of heat shock protein 70 in the r abies virion. Virology, 1992;190(2):845-848.

    [5] Philips B, Abravaya K, Morimoto RI. Analysis of the specificity an d mechanism of transcriptional activation of the human hsp70 gene during in fection by DNA viruses[J]. J Virol,1991;65(11):5680-5692.
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    [6] 叶 苓,杨守京,刘彦仿 et al. 流行性出血热尸检组织中热休克蛋白 70 mRNA的定位及分布. 中国病毒学,1998;19(4): 327-331.

    [7] 叶 苓,刘彦仿,杨守京. 流行性出血热患者心肌组织中热休克蛋白表达的 意义[J]. 第四军医大学学报,1998;19(5):488-490.

    [8] Angelidis CE, Lazaridis I, Pagoulatos GN et al. Specific inhib ition of Simian virus 40 protein synthesis by heat and arsennite treatment[J]. Eur J Bio chem,1988;172(1):27-34.

    [9] Carvalho MG, Fournier MV. Effect of heat shock on gene expression of aedes albopictus cells infected with Mayaro virus[J]. Res Virol,1991 ;142(1):25-31.

    [10] Jindal S,Young RA. Vaccinia virus infection induces a stress response th at leads to association of HSP70 with viral proteins[J]. J Virol,1992; 66( 9): 5357-5362.

    收稿日期:1999-08-13; 修回日期:1999-10-26, 百拇医药