肝癌细胞系表达p53，c-myc和增殖细胞核抗原的定位
作者：杨连君 司晓辉 王文亮
单位：杨连君(第四军医大学基础部病理学教研室 ，陕西 西安 710033)；王文亮(第四军医大学基础部病理学教研室 ，陕西 西安 710033)；司晓辉(上海第二医科大学第九人民医院口腔内科)
关键词：p53；c-myc；增殖细胞核抗原；肝癌；免疫组织化学
第四军医大学学报000471 中图号：R735 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)04-S0068- 02
0 引言
野生型p53是一种抑癌基因，而其突变型和c-myc都是癌基 因. 增殖细胞核抗原(PCNA)是一种细胞增殖相关蛋白. 关于它们在培养的原发性肝细胞癌 (简称肝癌)细胞中表 达的定位情况以往文献很少涉及. HCC-9204是一株较新的肝癌细胞系[1]. 我们采 用免疫组织化学技术检测p53,c-myc和PCNA在培养的HCC-9204细胞中的表达情况.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 细胞来源 人肝癌细胞系HCC-9204为本室建立. 于含盖玻片的6孔板内用 含有100 mL.L-1新生小牛血清的RPMI 1640培养液培养. 待细胞生长至单层时，取出 玻 片，PBS缓冲液洗，950 mL.L-1乙醇固定15 min，再用PBS洗后4℃备用.
1.2 主要试剂 鼠抗人p53(包括野生型和突变型)mAb和鼠抗人PCNA mAb为丹 麦Dako公司产品. 鼠抗人c-Myc mAb为美国Zymed公司产品. DAB为美国Sigma公司产品. 免 疫组化ABC试剂盒为美国Vector公司产品.
1.3 染色方法 ①细胞片入7.5 mL.L-1 H2O2内，37℃，10 min；② 加正常羊 血清，37℃，30 min；③分别加鼠抗人p53，c-Myc或PCNA mAb，以PBS作为阴性对照，4℃ 过夜；④加生物素化羊抗鼠IgG mAb，37℃，30 min；⑤加ABC复合物，37℃，30 min. 上述 各步骤间均用PBS洗；⑥DAB显色后脱水，透明，封片.
, 百拇医药
1.4 结果判断 阳性信号为棕黄色. 每个细胞片随机选取不相重叠的视野，计 数300个细胞，观察其是否为阳性及其染色部位.
2 结果
p53主要定位于HCC-9204细胞的细胞质，c-Myc和PCNA主要定位于细胞核(图 1). 阳性率及定位比例见表 1. 所有阴性对照均为阴性.
图 1 p53，c-Myc和增殖细胞核抗原(PCNA)在HCC-9204细胞表达的定位情况
A.p53染色 ×200； B.C-myc染色 ×200； C.PCNA染色 ×200
表 1 p53，c-Myc和PCNA在HCC-9204细胞表达的阳性率和定位比例
, 百拇医药
300个细胞中的阳性细胞数
阳性率
类型
细胞核
细胞质
(%)
P53
42
211
84.3
c-Myc
197
79
, 百拇医药
92.0
PCNA
291
0
97.0
PCNA:增殖细胞核抗原.3 讨论
p53基因的表达产物是转录因子，为G1期DNA损 伤的检查点[2]. c-Myc是丝氨酸和苏氨酸磷酸 化类的DNA结合蛋白，参与细胞分化调节，促进细胞由G1期进入S期. 以往的研究表明，p53 和c-myc在肝癌组织都呈异常的高表达，并且其阳性率和表达强度与肝癌组织的分化程 度呈 显著负相关(P<0.05)[3]. PCNA是一种真核细胞DNA合成所必需的DNA多聚酶 δ的36 ku辅助核蛋白，G1期其表达逐渐增加，S期最高，G2和M期减少. PCNA蛋白在正常组 织中不表达或仅有 十分微弱的表达，而在肝癌等多种肿瘤中均能稳定地表达，并且其表达的阳性率和染色强度 与多种肿瘤的病理分级、转移和复发呈正相关，与肿瘤的预后和生存率呈负相关[4] . p53蛋 白大部分定位在肝癌组织的细胞核，少部分定位于细胞质[3]. 我们的实验发现p53 蛋白主要 表达于HCC-9204细胞的细胞质，细胞核表达者只是少部分. 说明HCC-9204细胞的p53蛋白 定 位具有一定的特殊性. c-Myc和PCNA绝大部分定位于HCC-9204细胞的细胞核，与对肝癌组 织 的研究结果相一致. 这为采用HCC-9204细胞进行肝癌的癌基因和细胞增殖相关研究奠 定了一定的基础.
, http://www.100md.com
作者简介：杨连君(1968-)，男(汉族)，黑龙江省哈尔滨市人. 博士生(导 师王文亮). Tel.(029) 3374541-117
参考文献：
[1] Hu CM, Liu YF, Sui YF et al. Establishment of the hepat ocellular carcinoma cell line HCC-9204 and its characteristics [J]. J Med C oll PLA, 1995; 10(1): 1-4.
[2] 麻玲玲, 李贵容, 杨品 et al. 卵巢恶性肿瘤p53基因5-7外显子突变 及蛋白阳性的生物学意义[J]. 第四军医大学学报, 1999; 20(1): 56-58.
[3] 蔡德巍, 高长泽, 王能进. c-myc基因和p53蛋白在肝细胞癌中的表达 [J]. 中华病理杂志, 1994; 23(2): 100-103.
[4] 张传山, 王文亮, 李 青. 人原发性肝细胞肝癌增殖细胞核抗原定量研究[J]. 第四军医大学学报, 1995; 16(2): 111-113.
收稿日期:1999-10-25; 修回日期:1999-12-16, http://www.100md.com
单位：杨连君(第四军医大学基础部病理学教研室 ，陕西 西安 710033)；王文亮(第四军医大学基础部病理学教研室 ，陕西 西安 710033)；司晓辉(上海第二医科大学第九人民医院口腔内科)
关键词：p53；c-myc；增殖细胞核抗原；肝癌；免疫组织化学
第四军医大学学报000471 中图号：R735 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)04-S0068- 02
0 引言
野生型p53是一种抑癌基因，而其突变型和c-myc都是癌基 因. 增殖细胞核抗原(PCNA)是一种细胞增殖相关蛋白. 关于它们在培养的原发性肝细胞癌 (简称肝癌)细胞中表 达的定位情况以往文献很少涉及. HCC-9204是一株较新的肝癌细胞系[1]. 我们采 用免疫组织化学技术检测p53,c-myc和PCNA在培养的HCC-9204细胞中的表达情况.
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1 材料和方法
1.1 细胞来源 人肝癌细胞系HCC-9204为本室建立. 于含盖玻片的6孔板内用 含有100 mL.L-1新生小牛血清的RPMI 1640培养液培养. 待细胞生长至单层时，取出 玻 片，PBS缓冲液洗，950 mL.L-1乙醇固定15 min，再用PBS洗后4℃备用.
1.2 主要试剂 鼠抗人p53(包括野生型和突变型)mAb和鼠抗人PCNA mAb为丹 麦Dako公司产品. 鼠抗人c-Myc mAb为美国Zymed公司产品. DAB为美国Sigma公司产品. 免 疫组化ABC试剂盒为美国Vector公司产品.
1.3 染色方法 ①细胞片入7.5 mL.L-1 H2O2内，37℃，10 min；② 加正常羊 血清，37℃，30 min；③分别加鼠抗人p53，c-Myc或PCNA mAb，以PBS作为阴性对照，4℃ 过夜；④加生物素化羊抗鼠IgG mAb，37℃，30 min；⑤加ABC复合物，37℃，30 min. 上述 各步骤间均用PBS洗；⑥DAB显色后脱水，透明，封片.
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1.4 结果判断 阳性信号为棕黄色. 每个细胞片随机选取不相重叠的视野，计 数300个细胞，观察其是否为阳性及其染色部位.
2 结果
p53主要定位于HCC-9204细胞的细胞质，c-Myc和PCNA主要定位于细胞核(图 1). 阳性率及定位比例见表 1. 所有阴性对照均为阴性.
图 1 p53，c-Myc和增殖细胞核抗原(PCNA)在HCC-9204细胞表达的定位情况
A.p53染色 ×200； B.C-myc染色 ×200； C.PCNA染色 ×200
表 1 p53，c-Myc和PCNA在HCC-9204细胞表达的阳性率和定位比例
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300个细胞中的阳性细胞数
阳性率
类型
细胞核
细胞质
(%)
P53
42
211
84.3
c-Myc
197
79
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92.0
PCNA
291
0
97.0
PCNA:增殖细胞核抗原.3 讨论
p53基因的表达产物是转录因子，为G1期DNA损 伤的检查点[2]. c-Myc是丝氨酸和苏氨酸磷酸 化类的DNA结合蛋白，参与细胞分化调节，促进细胞由G1期进入S期. 以往的研究表明，p53 和c-myc在肝癌组织都呈异常的高表达，并且其阳性率和表达强度与肝癌组织的分化程 度呈 显著负相关(P<0.05)[3]. PCNA是一种真核细胞DNA合成所必需的DNA多聚酶 δ的36 ku辅助核蛋白，G1期其表达逐渐增加，S期最高，G2和M期减少. PCNA蛋白在正常组 织中不表达或仅有 十分微弱的表达，而在肝癌等多种肿瘤中均能稳定地表达，并且其表达的阳性率和染色强度 与多种肿瘤的病理分级、转移和复发呈正相关，与肿瘤的预后和生存率呈负相关[4] . p53蛋 白大部分定位在肝癌组织的细胞核，少部分定位于细胞质[3]. 我们的实验发现p53 蛋白主要 表达于HCC-9204细胞的细胞质，细胞核表达者只是少部分. 说明HCC-9204细胞的p53蛋白 定 位具有一定的特殊性. c-Myc和PCNA绝大部分定位于HCC-9204细胞的细胞核，与对肝癌组 织 的研究结果相一致. 这为采用HCC-9204细胞进行肝癌的癌基因和细胞增殖相关研究奠 定了一定的基础.
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作者简介：杨连君(1968-)，男(汉族)，黑龙江省哈尔滨市人. 博士生(导 师王文亮). Tel.(029) 3374541-117
参考文献：
[1] Hu CM, Liu YF, Sui YF et al. Establishment of the hepat ocellular carcinoma cell line HCC-9204 and its characteristics [J]. J Med C oll PLA, 1995; 10(1): 1-4.
[2] 麻玲玲, 李贵容, 杨品 et al. 卵巢恶性肿瘤p53基因5-7外显子突变 及蛋白阳性的生物学意义[J]. 第四军医大学学报, 1999; 20(1): 56-58.
[3] 蔡德巍, 高长泽, 王能进. c-myc基因和p53蛋白在肝细胞癌中的表达 [J]. 中华病理杂志, 1994; 23(2): 100-103.
[4] 张传山, 王文亮, 李 青. 人原发性肝细胞肝癌增殖细胞核抗原定量研究[J]. 第四军医大学学报, 1995; 16(2): 111-113.
收稿日期:1999-10-25; 修回日期:1999-12-16, http://www.100md.com