姜黄素对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用
作者：薛妍 夏天 赵建斌 吴少华 张仲海 王宗仁
单位：薛妍(第四军医大学西京医院中医科，陕西 西安 710033)；夏天(第四军医大学西京医院中医科，陕西 西安 710033)；赵建斌(第四军医大学西京医院中医科，陕西 西安 710033)；吴少华(第四军医大学西京医院中医科，陕西 西安 710033)；张仲海(第四军医大学西京医院中医科，陕西 西安 710033)；王宗仁(第四军医大学西京医院中医科，陕西 西安 710033)
关键词：姜黄素；肝癌；抑制作用；细胞周期
第四军医大学学报000545 摘 要： 目的 研究姜黄素对人肝癌细胞SMMC-7721生长的影响. 方法 应用MTT方法、流式细胞术及透射电镜超微结构观察来分析姜黄素对SMMC-7721细胞生长的作用及细胞周期和形态学改变. 结果 姜黄素明显抑制人肝癌细胞SMMC-7721细胞的生长，半数生长抑制剂量(IC50)为5.4 mg.L-1. 流式细胞术证实，姜黄素能将肿瘤细胞聚集在S期. 透射电镜超微结构观察发现姜黄素可使肿瘤细胞超微结构改变. 结论 姜黄素通过改变SMMC-7721细胞的周期分布和超微结构来抑制其生长.
, http://www.100md.com
中图号：R285.5 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-S0084-03
Curcumin inhibits human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721
XUE Yan, XIA Tian, ZHAO Jian-Bin， WU Shao-Hua, ZHANG Zhong-Hai, WANG Zong-Ren
(Department of Traditional Chinese Medicine, Xijing Hospital， Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To investigate the effect of curcumin on human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721. METHODS The effect of curcumin on the growth of SMMC-7721 cells was evaluated by MTT assay in vitro, cell cycle analysis and characteristic ultrastructural alterations. RESULTS Curcumin was effective in inhibiting the proliferation of SMMC-7721 cells. The IC50 value was found to be 5.4 mg.L-1. Cell cycle analysis indicated that curcumin blocked cells in S phase. The inhibitory effect of curcumin was also confirmed by characteristic ultrastructural alterations. CONCLUSION Curcumin inhibits the proliferation of hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 in vitro mainly by altering the cell cycle and ultrastructure.
, 百拇医药
Keywords: curcumin; hepatocarcinoma; inhibition action; cell cycle
0 引言
姜黄(turmeric)是姜科植物Curcuma longa linn的根茎，属活血类药，能行气滞、散风活血而止痛， 有利胆、 消炎、 抗菌等作用. 姜黄素(curcumin, diferuloylmethane)是其主要成分，也是咖哩、芥末的主要黄色色素， 生活中可作为调料、食品染色剂等. 它的药理作用广泛，主要特性为抗炎、抗氧化和抗肿瘤，是有效的抗致突变剂和抗促癌剂[1-3]. 国内外的许多研究表明姜黄素对多种体外培养的肿瘤细胞有生长抑制作用[4]， 但对肝癌细胞作用的报道较少. 为此我们采用MTT法、流式细胞术及透射电镜形态观察法， 探讨姜黄素对体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721生长的作用.
, http://www.100md.com 1 材料和方法
1.1 材料 姜黄素，中国药品生物制品检定所提供；溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)，Sigma产品；RPMI-1640培养液，Gibco产品；小牛血清，杭州生物制品厂产品. 人肝癌SMMC-7721细胞株由本校秦都口腔医学院引进，以4×107.L-1接种100 mL玻璃培养瓶中，在含100 mL.L-1小牛血清的RPMI-1640中贴壁生长，于50 mL.L-1 CO2，37℃培养箱中培养.
1.2 方法 MTT实验[5]：将对数生长的肝癌细胞SMMC-7721在50 mL.L-1，37℃培养箱内，在含100 mL.L-1小牛血清的RPMI-1640培养液中贴壁生长，用2.5 g.L-1胰蛋白酶消化传代，以200 μL (4×106.L-1)密度接种于96孔培养板上，孵育24 h后，倾去培养液，以姜黄素5个质量浓度(20，10，5，2.5和1.25 mg.L-1)分别加入孔内， 每一质量浓度加4孔，每孔加200 μL，对照组加同量培养液，孵育48 h后，倾去药液及培养液，每孔加入MTT (5 g.L-1) 20 μL，继续孵育4 h， 倾去上清液， 每孔加入二甲基亚砜150 μL，平板振荡仪振荡10 min，以酶联免疫仪490 nm波长检测各孔吸光度(A)，按如下公式计算抑制率：
, 百拇医药
抑制率(%)=(1-(实验组A均数)/(对照组A均数))×100%
采用文献[6]的方法， 收集各处理组SMMC-7721细胞(1×109.L-1)，用冷PBS洗涤2次后用700 mL.L-1冷乙醇固定，4℃冰箱保存(<7 d)待检，流式细胞仪为Coulter公司产品，Epics probile Ⅱ， 每份标本测定(2～5)×103个细胞，采用多参数细胞周期分析软件拟合处理, 对样本进行细胞周期分析.
分别收集SMMC-7721细胞(1～5)×109.L-1，经洗涤，30 mL.L-1戊二醛固定细胞团60 min，10 mL.L-1还原锇酸固定60 min，梯度乙醇脱水，700 mL.L-1乙醇脱水时加醋酸双氧铀块染色，环氧树脂618浸润包埋，超薄切片，再经柠檬酸铅染色，用日本产JEM-2000FX电镜观察细胞超微结构的变化.
, 百拇医药
2 结果
2.1 对人肝癌细胞SMMC-7721的细胞毒作用 所选姜黄素的5种浓度对人肝癌细胞SMMC-7721作用48 h后，均有不同程度的抑制作用，IC50为5.4 mg.L-1 (Tab 1).
2.2 姜黄素对SMMC-7721细胞周期的影响 由Tab 2可见， 姜黄素可以改变SMMC-7721细胞的周期分布，即G1期细胞百分率有所下降，S期细胞百分率增加，这种作用呈剂量依赖性(单次实验结果).
2.3 姜黄素对SMMC-7721细胞超微结构的影响 透射电镜观察显示，对照组细胞边缘有大量微绒毛，胞质内有丰富的细胞器；细胞核较大，核形不规则，异染色质较少，常染色质较多，核比较透亮，细胞增殖代谢活跃(Fig 1). 姜黄素2.5 mg.L-1处理组，可见细胞膜边缘微绒毛较少，内质网、线粒体轻度肿大，胞质内出现大量溶酶体(Fig 2). 姜黄素10 mg.L-1处理组，可见细胞发生明显的退变性改变，内质网、线粒体高度扩张呈空泡样，胞质内出现糖元溶解时的空白区，染色质边集、细胞核固缩(Fig 3, 4).
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表1 姜黄素对SMMC-7721细胞的抑制作用
Tab 1 Inhibitory effect of curcumin on SMMC-7721 cell line (
±s) Dose/(mg.L-1)
Absorbance value
Inhibition rate/%
Control
0.54±0.03
0
1.25
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0.41±0.03b
24.1
2.50
0.37±0.04b
31.5
5.00
0.29±0.05b
46.3
10.00
0.12±0.04b
77.8
, http://www.100md.com
20.00
0.05±0.02b
90.7
bP<0.01 vs control.表2 姜黄素对SMMC-7721细胞周期的影响
Tab 2 Effect of curcumin on cell cycle of SMMC-7721 Group
Cell cycle/%
G0/G1
S
G2/M
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Control
79.3
14.7
6.0
Curcumin(2.5 mg.L-1)
73.3
19.8
6.9
Curcumin(5.0 mg.L-1)
63.7
29.3
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7.0
图1 正常人肝癌细胞SMMC-7721
Fig 1 Human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 ×3000
图2 姜黄素2.5 mg.L-1处理48 h后的人肝癌细胞SMMC-7721
Fig 2 Human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 treated with 2.5 mg.L-1 curcumin for 48 h ×6000
, 百拇医药
图3 姜黄素10.0 mg.L-1处理48 h后的人肝癌细胞SMMC-7721
Fig 3 Human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 treated with 10.0 mg.L-1 curcumin for 48 h ×6000
图4 姜黄素10.0 mg.L-1处理48 h后的人肝癌细胞SMMC-7721
Fig 4 Human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 treated with 10.0 mg.L-1 curcumin for 48 h ×4000
, 百拇医药
3 讨论
近年，国内外对于姜黄素抗癌作用的研究较多，认为其可能的抗肿瘤机制有细胞毒作用、诱发肿瘤细胞的凋亡、抑制血管生成、阻断肿瘤细胞的生长信号通路等[4]. 本结果表明姜黄素对SMMC-7721细胞有显著的生长抑制作用，IC50为5.4 mg.L-1，并呈剂量依赖性. 电镜下观察可见姜黄素处理组使SMMC-7721细胞的超微结构发生明显变化，主要破坏细胞的线粒体和内质网，使之肿大、空泡样变、数目减少，高浓度姜黄素处理组还可见染色质边集、细胞核固缩等细胞退变性改变. 流式细胞仪检测未见凋亡峰，可见姜黄素呈剂量依赖性地将细胞聚集在S期，这可能与该细胞的再分化有关，因为DNA在S期解旋、复制， 大量细胞堆积于S期，使药物作用于DNA的位点增加，易于引起基因表型的改变，从而影响细胞的代谢与功能，导致细胞重新分化[7]. 本结果与Khafif等[8]报道姜黄素将人口腔鳞癌细胞阻断在S/G2M期相符，这与一般抗肿瘤药物多使细胞停留在G0/G1期不再分裂增殖的结果不一致，我们考虑这可能由于不同药物对细胞周期作用的分子靶点不同，其具体机制尚有待进一步研究.
, http://www.100md.com
作者简介：薛 妍(1973-)， 女(汉族)， 河北省平山县人. 硕士, 医师. Tel.(029)3374957 Email. tcmwsh@fmmu.edu.cn
参考文献：
[1] Shih CA, Lin JK. Inhibition of 8-hydroxydeoxyguanosine formation by curcumin in mouse fibroblast cells [J]. Carcinogenesis, 1993; 14(4):709-712.
[2] Huang MT, Wang ZY, Georgiadis CA et al. Inhibitory effects of curcumin on tumor initiation by benzo[a]pyrene and 7, 12-dimethylbenz [a] mthracene [J]. Carcinogenesis, 1992;13(11):2183-2186.
, 百拇医药
[3] Huang MT, Lou YR, Ma W et al. Inhibitory effects of dietary curcumin on forestomach, duodenal, and colon carcinogenesis in mice [J]. Cancer Res, 1994; 54(22): 5841-5847.
[4] 袁守军， 韩 锐. 姜黄素的癌化学预防作用[J]. 国外医学肿瘤学分册, 1997;24(5):264-268.
[5] Carmichael J, Degraff WG, Gazdar AF et al. Evaluation of a tetrozolium based semiautomated colorimetric assay: Assessment of chemosensitivity testing [J]. Cancer Res, 1987;47(4):936-942.
, 百拇医药
[6] Dosik GM, Barlogie B, Smith TL et al. Pretreatment flow cytometry of DNA content in adult acute leukemia [J]. Blood,1980;55(2):474-479.
[7] 张燕军, 夏 天, 赵建斌. 苦参碱对SMMC-7721细胞系的诱导分化作用[J]. 第四军医大学学报, 1998;19(3):340-343.
[8] Khafif A, Schantz SP, Chou TC et al. Quantitation of chemopreventive synergism between epigallocatechin-3-gallate and curcumin in normal, premaligant and maligant human oral epithelial cells [J]. Carcinogenesis, 1998;19(3):419-424.
收稿日期：1999-02-05； 修回日期：1999-06-21, 百拇医药
单位：薛妍(第四军医大学西京医院中医科，陕西 西安 710033)；夏天(第四军医大学西京医院中医科，陕西 西安 710033)；赵建斌(第四军医大学西京医院中医科，陕西 西安 710033)；吴少华(第四军医大学西京医院中医科，陕西 西安 710033)；张仲海(第四军医大学西京医院中医科，陕西 西安 710033)；王宗仁(第四军医大学西京医院中医科，陕西 西安 710033)
关键词：姜黄素；肝癌；抑制作用；细胞周期
第四军医大学学报000545 摘 要： 目的 研究姜黄素对人肝癌细胞SMMC-7721生长的影响. 方法 应用MTT方法、流式细胞术及透射电镜超微结构观察来分析姜黄素对SMMC-7721细胞生长的作用及细胞周期和形态学改变. 结果 姜黄素明显抑制人肝癌细胞SMMC-7721细胞的生长，半数生长抑制剂量(IC50)为5.4 mg.L-1. 流式细胞术证实，姜黄素能将肿瘤细胞聚集在S期. 透射电镜超微结构观察发现姜黄素可使肿瘤细胞超微结构改变. 结论 姜黄素通过改变SMMC-7721细胞的周期分布和超微结构来抑制其生长.
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中图号：R285.5 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-S0084-03
Curcumin inhibits human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721
XUE Yan, XIA Tian, ZHAO Jian-Bin， WU Shao-Hua, ZHANG Zhong-Hai, WANG Zong-Ren
(Department of Traditional Chinese Medicine, Xijing Hospital， Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To investigate the effect of curcumin on human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721. METHODS The effect of curcumin on the growth of SMMC-7721 cells was evaluated by MTT assay in vitro, cell cycle analysis and characteristic ultrastructural alterations. RESULTS Curcumin was effective in inhibiting the proliferation of SMMC-7721 cells. The IC50 value was found to be 5.4 mg.L-1. Cell cycle analysis indicated that curcumin blocked cells in S phase. The inhibitory effect of curcumin was also confirmed by characteristic ultrastructural alterations. CONCLUSION Curcumin inhibits the proliferation of hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 in vitro mainly by altering the cell cycle and ultrastructure.
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Keywords: curcumin; hepatocarcinoma; inhibition action; cell cycle
0 引言
姜黄(turmeric)是姜科植物Curcuma longa linn的根茎，属活血类药，能行气滞、散风活血而止痛， 有利胆、 消炎、 抗菌等作用. 姜黄素(curcumin, diferuloylmethane)是其主要成分，也是咖哩、芥末的主要黄色色素， 生活中可作为调料、食品染色剂等. 它的药理作用广泛，主要特性为抗炎、抗氧化和抗肿瘤，是有效的抗致突变剂和抗促癌剂[1-3]. 国内外的许多研究表明姜黄素对多种体外培养的肿瘤细胞有生长抑制作用[4]， 但对肝癌细胞作用的报道较少. 为此我们采用MTT法、流式细胞术及透射电镜形态观察法， 探讨姜黄素对体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721生长的作用.
, http://www.100md.com 1 材料和方法
1.1 材料 姜黄素，中国药品生物制品检定所提供；溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)，Sigma产品；RPMI-1640培养液，Gibco产品；小牛血清，杭州生物制品厂产品. 人肝癌SMMC-7721细胞株由本校秦都口腔医学院引进，以4×107.L-1接种100 mL玻璃培养瓶中，在含100 mL.L-1小牛血清的RPMI-1640中贴壁生长，于50 mL.L-1 CO2，37℃培养箱中培养.
1.2 方法 MTT实验[5]：将对数生长的肝癌细胞SMMC-7721在50 mL.L-1，37℃培养箱内，在含100 mL.L-1小牛血清的RPMI-1640培养液中贴壁生长，用2.5 g.L-1胰蛋白酶消化传代，以200 μL (4×106.L-1)密度接种于96孔培养板上，孵育24 h后，倾去培养液，以姜黄素5个质量浓度(20，10，5，2.5和1.25 mg.L-1)分别加入孔内， 每一质量浓度加4孔，每孔加200 μL，对照组加同量培养液，孵育48 h后，倾去药液及培养液，每孔加入MTT (5 g.L-1) 20 μL，继续孵育4 h， 倾去上清液， 每孔加入二甲基亚砜150 μL，平板振荡仪振荡10 min，以酶联免疫仪490 nm波长检测各孔吸光度(A)，按如下公式计算抑制率：
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抑制率(%)=(1-(实验组A均数)/(对照组A均数))×100%
采用文献[6]的方法， 收集各处理组SMMC-7721细胞(1×109.L-1)，用冷PBS洗涤2次后用700 mL.L-1冷乙醇固定，4℃冰箱保存(<7 d)待检，流式细胞仪为Coulter公司产品，Epics probile Ⅱ， 每份标本测定(2～5)×103个细胞，采用多参数细胞周期分析软件拟合处理, 对样本进行细胞周期分析.
分别收集SMMC-7721细胞(1～5)×109.L-1，经洗涤，30 mL.L-1戊二醛固定细胞团60 min，10 mL.L-1还原锇酸固定60 min，梯度乙醇脱水，700 mL.L-1乙醇脱水时加醋酸双氧铀块染色，环氧树脂618浸润包埋，超薄切片，再经柠檬酸铅染色，用日本产JEM-2000FX电镜观察细胞超微结构的变化.
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2 结果
2.1 对人肝癌细胞SMMC-7721的细胞毒作用 所选姜黄素的5种浓度对人肝癌细胞SMMC-7721作用48 h后，均有不同程度的抑制作用，IC50为5.4 mg.L-1 (Tab 1).
2.2 姜黄素对SMMC-7721细胞周期的影响 由Tab 2可见， 姜黄素可以改变SMMC-7721细胞的周期分布，即G1期细胞百分率有所下降，S期细胞百分率增加，这种作用呈剂量依赖性(单次实验结果).
2.3 姜黄素对SMMC-7721细胞超微结构的影响 透射电镜观察显示，对照组细胞边缘有大量微绒毛，胞质内有丰富的细胞器；细胞核较大，核形不规则，异染色质较少，常染色质较多，核比较透亮，细胞增殖代谢活跃(Fig 1). 姜黄素2.5 mg.L-1处理组，可见细胞膜边缘微绒毛较少，内质网、线粒体轻度肿大，胞质内出现大量溶酶体(Fig 2). 姜黄素10 mg.L-1处理组，可见细胞发生明显的退变性改变，内质网、线粒体高度扩张呈空泡样，胞质内出现糖元溶解时的空白区，染色质边集、细胞核固缩(Fig 3, 4).
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表1 姜黄素对SMMC-7721细胞的抑制作用
Tab 1 Inhibitory effect of curcumin on SMMC-7721 cell line (
±s) Dose/(mg.L-1)Absorbance value
Inhibition rate/%
Control
0.54±0.03
0
1.25
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0.41±0.03b
24.1
2.50
0.37±0.04b
31.5
5.00
0.29±0.05b
46.3
10.00
0.12±0.04b
77.8
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20.00
0.05±0.02b
90.7
bP<0.01 vs control.表2 姜黄素对SMMC-7721细胞周期的影响
Tab 2 Effect of curcumin on cell cycle of SMMC-7721 Group
Cell cycle/%
G0/G1
S
G2/M
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Control
79.3
14.7
6.0
Curcumin(2.5 mg.L-1)
73.3
19.8
6.9
Curcumin(5.0 mg.L-1)
63.7
29.3
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7.0
图1 正常人肝癌细胞SMMC-7721
Fig 1 Human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 ×3000
图2 姜黄素2.5 mg.L-1处理48 h后的人肝癌细胞SMMC-7721
Fig 2 Human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 treated with 2.5 mg.L-1 curcumin for 48 h ×6000
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图3 姜黄素10.0 mg.L-1处理48 h后的人肝癌细胞SMMC-7721
Fig 3 Human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 treated with 10.0 mg.L-1 curcumin for 48 h ×6000
图4 姜黄素10.0 mg.L-1处理48 h后的人肝癌细胞SMMC-7721
Fig 4 Human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 treated with 10.0 mg.L-1 curcumin for 48 h ×4000
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3 讨论
近年，国内外对于姜黄素抗癌作用的研究较多，认为其可能的抗肿瘤机制有细胞毒作用、诱发肿瘤细胞的凋亡、抑制血管生成、阻断肿瘤细胞的生长信号通路等[4]. 本结果表明姜黄素对SMMC-7721细胞有显著的生长抑制作用，IC50为5.4 mg.L-1，并呈剂量依赖性. 电镜下观察可见姜黄素处理组使SMMC-7721细胞的超微结构发生明显变化，主要破坏细胞的线粒体和内质网，使之肿大、空泡样变、数目减少，高浓度姜黄素处理组还可见染色质边集、细胞核固缩等细胞退变性改变. 流式细胞仪检测未见凋亡峰，可见姜黄素呈剂量依赖性地将细胞聚集在S期，这可能与该细胞的再分化有关，因为DNA在S期解旋、复制， 大量细胞堆积于S期，使药物作用于DNA的位点增加，易于引起基因表型的改变，从而影响细胞的代谢与功能，导致细胞重新分化[7]. 本结果与Khafif等[8]报道姜黄素将人口腔鳞癌细胞阻断在S/G2M期相符，这与一般抗肿瘤药物多使细胞停留在G0/G1期不再分裂增殖的结果不一致，我们考虑这可能由于不同药物对细胞周期作用的分子靶点不同，其具体机制尚有待进一步研究.
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作者简介：薛 妍(1973-)， 女(汉族)， 河北省平山县人. 硕士, 医师. Tel.(029)3374957 Email. tcmwsh@fmmu.edu.cn
参考文献：
[1] Shih CA, Lin JK. Inhibition of 8-hydroxydeoxyguanosine formation by curcumin in mouse fibroblast cells [J]. Carcinogenesis, 1993; 14(4):709-712.
[2] Huang MT, Wang ZY, Georgiadis CA et al. Inhibitory effects of curcumin on tumor initiation by benzo[a]pyrene and 7, 12-dimethylbenz [a] mthracene [J]. Carcinogenesis, 1992;13(11):2183-2186.
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[3] Huang MT, Lou YR, Ma W et al. Inhibitory effects of dietary curcumin on forestomach, duodenal, and colon carcinogenesis in mice [J]. Cancer Res, 1994; 54(22): 5841-5847.
[4] 袁守军， 韩 锐. 姜黄素的癌化学预防作用[J]. 国外医学肿瘤学分册, 1997;24(5):264-268.
[5] Carmichael J, Degraff WG, Gazdar AF et al. Evaluation of a tetrozolium based semiautomated colorimetric assay: Assessment of chemosensitivity testing [J]. Cancer Res, 1987;47(4):936-942.
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[6] Dosik GM, Barlogie B, Smith TL et al. Pretreatment flow cytometry of DNA content in adult acute leukemia [J]. Blood,1980;55(2):474-479.
[7] 张燕军, 夏 天, 赵建斌. 苦参碱对SMMC-7721细胞系的诱导分化作用[J]. 第四军医大学学报, 1998;19(3):340-343.
[8] Khafif A, Schantz SP, Chou TC et al. Quantitation of chemopreventive synergism between epigallocatechin-3-gallate and curcumin in normal, premaligant and maligant human oral epithelial cells [J]. Carcinogenesis, 1998;19(3):419-424.
收稿日期：1999-02-05； 修回日期：1999-06-21, 百拇医药