卡托普利对培养鼠心室肌细胞缺氧再灌注损伤时心肌酶的影响
作者：俞世强 任雨笙 汪钢 刘维永 汤朝武
单位：俞世强(第四军医大学西京医院心血管外科中心)；任雨笙(第四军医大学西京医院心血管外科中心)；汪钢(第四军医大学西京医院心血管外科中心)；刘维永(第四军医大学西京医院心血管外科中心)；汤朝武(第四军医大学西京医院烧伤科，陕西 西安 710033)
关键词：心肌细胞；缺氧再灌注；酶；卡托普利
第四军医大学学报000534 摘 要： 目的 观察卡托普利对培养的原代心肌细胞缺氧再灌注损伤时心肌酶活性的影响. 方法 用培养的SD乳鼠原代心室肌细胞建立缺氧再灌注模型，观察培养液中的肌酸磷酸激酶(CPK)，碱性磷酸酶(ALP)，谷草转氨酶(AST)及乳酸脱氢酶(LDH)，血管紧张素转换酶(ACE)活性的变化以及卡托普利对上述指标的影响. 结果 心肌细胞内CPK，ALP，AST及LDH，ACE的释放量随缺氧及再灌注时间的延长逐渐升高，缺氧早期CPK，ALP反映细胞损伤的程度较AST，ACE敏感，0.5 mg.L-1卡托普利可减少心肌细胞缺氧再灌注损伤时心肌酶的漏出. 结论 卡托普利可减轻心肌细胞缺氧再灌注损伤，对心肌细胞具有直接保护作用.
, http://www.100md.com
中图号：R331.36 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-0627-03
Effects of captopril on enzymatology of cultured anoxic-reperfused ventricular myocardial cells
YU Shi-Qiang， REN Yu-Sheng， WANG Gang， LIU Wei-Yong
(Center of Cardiovascular Surgery)
TANG Chao-Wu
(Department of Burn, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
, http://www.100md.com
Abstract: AIM To investigate the effects of captopril on the enzymatology of cultured anoxic-reperfused ventricular myocardial cells. METHODS An anoxic-reperfusion model was established by using cultured ventrical myocardial cells of neonate rats. The CPK, ALP, AST, LDH and ACE activity in medium of myocardial cells was measured for 60, 120 and 180 min after anoxia and 30 and 60 min after reperfusion and the effects of 0.5 mg.L-1 captopril on anoxic-reperfused myocardial cells were studied. RESULTS The release of CPK, ALP, AST, LDH and ACE from the myocardial cells increased gradually as anoxia and reperfussion prolonged. In the early period of anoxia, the level of CPK and ALP was a more sensitive indicator of the extent of injury to the myocardial cells than that of AST and ACE. Meanwhile, 0.5 mg.L-1 captopril might reduce the leakage of enzymes significantly during anoxia and reperfussion. CONCLUSION That captopril might reduce the leakage of enzymes of cultured myocardial cells demonstrated that captopril might have a direct protective effect on myocardial cells afflicted with anoxic-reperfusion injury.
, http://www.100md.com
Keywords: myocardial cells； anoxic-reperfusion； enzyme； captopril
0 引言
血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-coverting enzyme inhibitor, ACEI)被广泛应用于高血压，冠心病，心肌梗死的治疗，它可抑制心肌局部肾素-血管紧张素活性，减少AngⅡ的形成，从而防止心肌梗死的延展[1，2]，对缺血心肌具有保护作用. 我们用培养的原代心肌细胞建立缺氧再灌注模型，观察卡托普利(captopril)对心肌细胞在缺氧再灌注状态下心肌酶活性的影响，以了解ACEI对心肌缺氧再灌注损伤的直接保护作用.
1 材料和方法
1.1 材料 原代心肌细胞培养用出生2～3 d的SD乳鼠(本校实验动物中心)，断头处死，无菌开胸取心脏，分离心室，按Mustafa[3]法将心室肌制成1.5×1012 L-1的心肌细胞悬液，取3 mL悬液接种于25 mL培养瓶中，放入CO2孵箱培养至4 d时供实验用. 将培养的原代心肌细胞加入预先充氮饱和的D-Hanks液0.6 mL，于培养瓶中充入氮气以置换瓶中的空气，胶塞封口，微量气体分析仪检测瓶中PO2<2 kPa，将密闭的培养瓶放入CO2孵箱，于缺氧环境中孵育心肌细胞一定时间后，去胶塞，倾弃D-Hanks液，换以Hanks液0.6 mL，开放瓶口，放入CO2孵箱(50 mL.L-1 CO2，950 mL.L-1空气)内，于再给氧环境中孵育细胞，造成心肌细胞的缺氧再灌注.
, http://www.100md.com
1.2 方法 对照组，于上述条件下培养心肌细胞，造成细胞的缺氧及再灌注. Cap组，分别用D-Hanks液，Hanks液将卡托普利(武汉制药)稀释成0.5 mg.L-1，加入培养瓶中，于对照组相同条件下培养心肌细胞，分别于缺氧前，缺氧60，120，180 min及缺氧120 min后再给氧30，60 min时采集标本检测，各组实验重复8次. 取细胞培养液20 μL用MAC自动生化分析仪(美国IL公司)检测培养液中的肌酸磷酸激酶(CPK)，碱性磷酸酶(ALP)，谷草转氨酶(AST)及乳酸脱氢酶(LDH)活性，采用微量比色法测定血管紧张素转换酶(ACE)活性，按Lowry等[4]法测定细胞蛋白含量，酶的活性用nkat表示.
统计学处理: 数据以
±s表示，用SPLM软件包中方差分析做显著性检验.
, 百拇医药 2 结果
对照组，随着缺氧时间的延长，培养液中CPK，ALP，LDH的释放量逐渐增多，超过缺氧前水平(P<0.01)，再灌注时CPK，ALP，LDH的释放量急剧增高；AST，ACE的变化较为迟缓. 0.5 mg.L-1卡托普利组，缺氧前上述各指标与对照组相比无显著差别. 在缺氧及再给氧期CPK，ALP的释放量均显著低于对照组(P<0.01)；缺氧早期心肌细胞的LDH，AST，ACE释放量略有下降，但与缺氧前及对照组相比无显著差别；在缺氧120或180 min及再给氧30， 60 min时LDH，AST，ACE的释放量显著低于对照组(P<0.05，0.01)，但高于缺氧前水平(Tab 1).
表1 心肌细胞缺氧再灌注时心肌酶学的变化
Tab 1 Enzymes release from myocyte culture incubated for different periods of anoxia and reperfusion (nkat.g-1,±s) Enzyme
, 百拇医药
Group
Preanoxia
Anoxia
Reoxygenation
60 min
120 min
180 min
30 min
60 min
CPK
Control
90±8
, http://www.100md.com
184±14b
266±16b
380±23b
424±32b
507±26b
Captopril
93±7
127±10bd
173±13bd
251±20bd
, http://www.100md.com
303±29bd
358±28bd
ALP
Control
107±8
215±12b
277±19b
310±21b
349±21b
421±23b
, http://www.100md.com Captopril
106±8
145±10bd
183±21bd
209±25bd
270±18bd
326±22bd
GOT
Control
991±82
1147±83b
, http://www.100md.com
1348±105b
1671±86b
2049±133b
2425±141b
Captopril
977±87
1094±57a
1194±99bd
1302±92bd
1414±111bd
, 百拇医药
1737±132bd
LDH
Control
99±9
124±10a
203±16b
317±20b
385±27b
489±36b
Captopril
98±8
, http://www.100md.com
117±11
155±13bd
217±14bd
283±19bd
383±28bd
ACE
Control
40±6
45±5
64±5b
72±6b
, 百拇医药
91±5b
131±6b
Captopril
39±5
43±5
55±4bd
63±4bd
69±4bd
83±5bd
aP<0.05, bP<0.01 vs preanoxia; cP<0.05, dP<0.01 vs control; GOT: glutamic-oxalacetic transaminase.3 讨论
, 百拇医药
心脏在缺氧或缺氧再灌注时，其心肌细胞内的心肌酶系可因细胞的损伤而漏出，我们利用培养的原代心室肌细胞，建立缺氧再灌注模型，以心肌细胞内CPK，ALP，LDH，AST，ACE的漏出作为反映心肌细胞损伤的指标. 为了更好地模拟在体时细胞的缺氧再灌注，在缺氧时采用D-Hanks液培养细胞，除造成缺氧外，同时限制糖，钙及液体量，而再灌注时则用含糖，钙的Hanks液，并给予充分的氧，以满足再灌注的条件. 本实验结果显示，随着缺氧及缺氧后再灌注时间的延长，心肌细胞内CPK，ALP，LDH，AST，ACE诸酶的漏出增多，表明在这一过程中心肌细胞膜的通透性的增高，心肌细胞结构和功能的损伤的加重是逐渐发展的，而ALP，CPK反映其损伤的程度在早期较为敏感.
临床试验和实验室研究表明，卡托普利应用于急性心肌梗死的治疗，可保护心脏功能，减少心肌梗死面积，降低病死率[5，6]. ACEI可抑制缺氧再灌注时被激活的循环和局部的肾素-血管紧张素系统，具有保护心肌细胞缺氧再灌注损伤的作用. 本结果显示，卡托普利可明显减少心肌细胞缺氧再灌注时细胞酶的漏出，减轻心肌细胞的损伤，因而对心肌细胞缺氧再灌注具有保护作用. LDH是糖酵解酶，LDH释放量的多少可反映细胞膜损伤程度，亲心肌酶系中CPK，ALP，LDH，AST诸酶的少量漏出提示细胞膜通透性的增高，一定程度的缺氧并不引起细胞的死亡，但可引起细胞膜的损伤，细胞膜的通透性增高，使细胞酶漏出；而严重缺氧及再灌注则可引起细胞结构和功能的损伤甚至导致细胞的裂解，死亡，引起心肌酶大量的释放. 在人体组织中，心肌细胞也存在着ACE，可能参与心肌局部的RAS调节. 我们发现，卡托普利可降低ACE活性，这与其降低心肌组织水平的局部RAS有关；同时ACEI可减少缓激酶的降解及ET的分泌，增加前列环素的分泌，以减少AngⅡ，ET等活性物质的过度激活而引起的细胞损害，以保护心肌细胞结构的完整性和细胞膜的稳定性，此外，卡托普利具有清除自由基，减轻质脂过氧化的作用[7] . 本结果表明，卡托普利对心肌细胞的缺氧再灌注具有直接保护作用.
, 百拇医药
作者简介:俞世强(1962-)， 男(汉族)， 浙江省嵊州市人. 博士， 副主任医师， 副教授. Tel.(029)3373938 Email. yushiqiang@oculist.com
参考文献：
[1] Russell JC, Graham SE, Amy RM et al. Inhibition of myocardial lesions in the JCR: LA-corpulent rat by captopril [J]. J Cardiovasc Pharmacol,1998;31(6):971-977.
[2] Black SC, Driscoll EM, Lucchesi BR. Effect of ramiprilat or captopril on myocardial infarct size: Assessment in canine models of ischemia alone and ischemia with reperfusion [J]. Pharmacology, 1998; 57(1): 35-46.
, http://www.100md.com
[3] Mustafa SJ. Cell culture and application [M]. New York: Acad Press, 1977: 729-752.
[4] Lowry OH, Roseberough NJ, Farr AL et al. Protein measurement with folin phenol-reagent [J]. J Bio Chem, 1951;193(1):265-275.
[5] Chinese Cardiac Study (CCS-1) Collaborative Group. Oral captopril versus placebo among 14962 patients with suspected acute myocardial infarction: A multicenter, randomized, double-blind, placebo controlled clinical trial [J]. Chin Med J, 1997;110(11):834-838.
, 百拇医药
[6] Dogan R, Sarigul A, Isbir S et al. Beneficial effect of captopril against ischaemia-reperfusion injury in isolated guinea pig hearts [J]. Scand J Clin Lab Invest, 1998; 58(2): 119-126.
[7] de Cavanagh EM, Fraga CG, Ferder L et al. Enalapril and captopril enhance antioxidant defenses in mouse tissues [J]. Am J Physiol, 1997; 272(2 Pt 2): R514-R518.
收稿日期：2000-01-15； 修回日期：2000-03-28, 百拇医药
单位：俞世强(第四军医大学西京医院心血管外科中心)；任雨笙(第四军医大学西京医院心血管外科中心)；汪钢(第四军医大学西京医院心血管外科中心)；刘维永(第四军医大学西京医院心血管外科中心)；汤朝武(第四军医大学西京医院烧伤科，陕西 西安 710033)
关键词：心肌细胞；缺氧再灌注；酶；卡托普利
第四军医大学学报000534 摘 要： 目的 观察卡托普利对培养的原代心肌细胞缺氧再灌注损伤时心肌酶活性的影响. 方法 用培养的SD乳鼠原代心室肌细胞建立缺氧再灌注模型，观察培养液中的肌酸磷酸激酶(CPK)，碱性磷酸酶(ALP)，谷草转氨酶(AST)及乳酸脱氢酶(LDH)，血管紧张素转换酶(ACE)活性的变化以及卡托普利对上述指标的影响. 结果 心肌细胞内CPK，ALP，AST及LDH，ACE的释放量随缺氧及再灌注时间的延长逐渐升高，缺氧早期CPK，ALP反映细胞损伤的程度较AST，ACE敏感，0.5 mg.L-1卡托普利可减少心肌细胞缺氧再灌注损伤时心肌酶的漏出. 结论 卡托普利可减轻心肌细胞缺氧再灌注损伤，对心肌细胞具有直接保护作用.
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中图号：R331.36 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-0627-03
Effects of captopril on enzymatology of cultured anoxic-reperfused ventricular myocardial cells
YU Shi-Qiang， REN Yu-Sheng， WANG Gang， LIU Wei-Yong
(Center of Cardiovascular Surgery)
TANG Chao-Wu
(Department of Burn, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
, http://www.100md.com
Abstract: AIM To investigate the effects of captopril on the enzymatology of cultured anoxic-reperfused ventricular myocardial cells. METHODS An anoxic-reperfusion model was established by using cultured ventrical myocardial cells of neonate rats. The CPK, ALP, AST, LDH and ACE activity in medium of myocardial cells was measured for 60, 120 and 180 min after anoxia and 30 and 60 min after reperfusion and the effects of 0.5 mg.L-1 captopril on anoxic-reperfused myocardial cells were studied. RESULTS The release of CPK, ALP, AST, LDH and ACE from the myocardial cells increased gradually as anoxia and reperfussion prolonged. In the early period of anoxia, the level of CPK and ALP was a more sensitive indicator of the extent of injury to the myocardial cells than that of AST and ACE. Meanwhile, 0.5 mg.L-1 captopril might reduce the leakage of enzymes significantly during anoxia and reperfussion. CONCLUSION That captopril might reduce the leakage of enzymes of cultured myocardial cells demonstrated that captopril might have a direct protective effect on myocardial cells afflicted with anoxic-reperfusion injury.
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Keywords: myocardial cells； anoxic-reperfusion； enzyme； captopril
0 引言
血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-coverting enzyme inhibitor, ACEI)被广泛应用于高血压，冠心病，心肌梗死的治疗，它可抑制心肌局部肾素-血管紧张素活性，减少AngⅡ的形成，从而防止心肌梗死的延展[1，2]，对缺血心肌具有保护作用. 我们用培养的原代心肌细胞建立缺氧再灌注模型，观察卡托普利(captopril)对心肌细胞在缺氧再灌注状态下心肌酶活性的影响，以了解ACEI对心肌缺氧再灌注损伤的直接保护作用.
1 材料和方法
1.1 材料 原代心肌细胞培养用出生2～3 d的SD乳鼠(本校实验动物中心)，断头处死，无菌开胸取心脏，分离心室，按Mustafa[3]法将心室肌制成1.5×1012 L-1的心肌细胞悬液，取3 mL悬液接种于25 mL培养瓶中，放入CO2孵箱培养至4 d时供实验用. 将培养的原代心肌细胞加入预先充氮饱和的D-Hanks液0.6 mL，于培养瓶中充入氮气以置换瓶中的空气，胶塞封口，微量气体分析仪检测瓶中PO2<2 kPa，将密闭的培养瓶放入CO2孵箱，于缺氧环境中孵育心肌细胞一定时间后，去胶塞，倾弃D-Hanks液，换以Hanks液0.6 mL，开放瓶口，放入CO2孵箱(50 mL.L-1 CO2，950 mL.L-1空气)内，于再给氧环境中孵育细胞，造成心肌细胞的缺氧再灌注.
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1.2 方法 对照组，于上述条件下培养心肌细胞，造成细胞的缺氧及再灌注. Cap组，分别用D-Hanks液，Hanks液将卡托普利(武汉制药)稀释成0.5 mg.L-1，加入培养瓶中，于对照组相同条件下培养心肌细胞，分别于缺氧前，缺氧60，120，180 min及缺氧120 min后再给氧30，60 min时采集标本检测，各组实验重复8次. 取细胞培养液20 μL用MAC自动生化分析仪(美国IL公司)检测培养液中的肌酸磷酸激酶(CPK)，碱性磷酸酶(ALP)，谷草转氨酶(AST)及乳酸脱氢酶(LDH)活性，采用微量比色法测定血管紧张素转换酶(ACE)活性，按Lowry等[4]法测定细胞蛋白含量，酶的活性用nkat表示.
统计学处理: 数据以
±s表示，用SPLM软件包中方差分析做显著性检验., 百拇医药 2 结果
对照组，随着缺氧时间的延长，培养液中CPK，ALP，LDH的释放量逐渐增多，超过缺氧前水平(P<0.01)，再灌注时CPK，ALP，LDH的释放量急剧增高；AST，ACE的变化较为迟缓. 0.5 mg.L-1卡托普利组，缺氧前上述各指标与对照组相比无显著差别. 在缺氧及再给氧期CPK，ALP的释放量均显著低于对照组(P<0.01)；缺氧早期心肌细胞的LDH，AST，ACE释放量略有下降，但与缺氧前及对照组相比无显著差别；在缺氧120或180 min及再给氧30， 60 min时LDH，AST，ACE的释放量显著低于对照组(P<0.05，0.01)，但高于缺氧前水平(Tab 1).
表1 心肌细胞缺氧再灌注时心肌酶学的变化
Tab 1 Enzymes release from myocyte culture incubated for different periods of anoxia and reperfusion (nkat.g-1,
±s) Enzyme, 百拇医药
Group
Preanoxia
Anoxia
Reoxygenation
60 min
120 min
180 min
30 min
60 min
CPK
Control
90±8
, http://www.100md.com
184±14b
266±16b
380±23b
424±32b
507±26b
Captopril
93±7
127±10bd
173±13bd
251±20bd
, http://www.100md.com
303±29bd
358±28bd
ALP
Control
107±8
215±12b
277±19b
310±21b
349±21b
421±23b
, http://www.100md.com Captopril
106±8
145±10bd
183±21bd
209±25bd
270±18bd
326±22bd
GOT
Control
991±82
1147±83b
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1348±105b
1671±86b
2049±133b
2425±141b
Captopril
977±87
1094±57a
1194±99bd
1302±92bd
1414±111bd
, 百拇医药
1737±132bd
LDH
Control
99±9
124±10a
203±16b
317±20b
385±27b
489±36b
Captopril
98±8
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117±11
155±13bd
217±14bd
283±19bd
383±28bd
ACE
Control
40±6
45±5
64±5b
72±6b
, 百拇医药
91±5b
131±6b
Captopril
39±5
43±5
55±4bd
63±4bd
69±4bd
83±5bd
aP<0.05, bP<0.01 vs preanoxia; cP<0.05, dP<0.01 vs control; GOT: glutamic-oxalacetic transaminase.3 讨论
, 百拇医药
心脏在缺氧或缺氧再灌注时，其心肌细胞内的心肌酶系可因细胞的损伤而漏出，我们利用培养的原代心室肌细胞，建立缺氧再灌注模型，以心肌细胞内CPK，ALP，LDH，AST，ACE的漏出作为反映心肌细胞损伤的指标. 为了更好地模拟在体时细胞的缺氧再灌注，在缺氧时采用D-Hanks液培养细胞，除造成缺氧外，同时限制糖，钙及液体量，而再灌注时则用含糖，钙的Hanks液，并给予充分的氧，以满足再灌注的条件. 本实验结果显示，随着缺氧及缺氧后再灌注时间的延长，心肌细胞内CPK，ALP，LDH，AST，ACE诸酶的漏出增多，表明在这一过程中心肌细胞膜的通透性的增高，心肌细胞结构和功能的损伤的加重是逐渐发展的，而ALP，CPK反映其损伤的程度在早期较为敏感.
临床试验和实验室研究表明，卡托普利应用于急性心肌梗死的治疗，可保护心脏功能，减少心肌梗死面积，降低病死率[5，6]. ACEI可抑制缺氧再灌注时被激活的循环和局部的肾素-血管紧张素系统，具有保护心肌细胞缺氧再灌注损伤的作用. 本结果显示，卡托普利可明显减少心肌细胞缺氧再灌注时细胞酶的漏出，减轻心肌细胞的损伤，因而对心肌细胞缺氧再灌注具有保护作用. LDH是糖酵解酶，LDH释放量的多少可反映细胞膜损伤程度，亲心肌酶系中CPK，ALP，LDH，AST诸酶的少量漏出提示细胞膜通透性的增高，一定程度的缺氧并不引起细胞的死亡，但可引起细胞膜的损伤，细胞膜的通透性增高，使细胞酶漏出；而严重缺氧及再灌注则可引起细胞结构和功能的损伤甚至导致细胞的裂解，死亡，引起心肌酶大量的释放. 在人体组织中，心肌细胞也存在着ACE，可能参与心肌局部的RAS调节. 我们发现，卡托普利可降低ACE活性，这与其降低心肌组织水平的局部RAS有关；同时ACEI可减少缓激酶的降解及ET的分泌，增加前列环素的分泌，以减少AngⅡ，ET等活性物质的过度激活而引起的细胞损害，以保护心肌细胞结构的完整性和细胞膜的稳定性，此外，卡托普利具有清除自由基，减轻质脂过氧化的作用[7] . 本结果表明，卡托普利对心肌细胞的缺氧再灌注具有直接保护作用.
, 百拇医药
作者简介:俞世强(1962-)， 男(汉族)， 浙江省嵊州市人. 博士， 副主任医师， 副教授. Tel.(029)3373938 Email. yushiqiang@oculist.com
参考文献：
[1] Russell JC, Graham SE, Amy RM et al. Inhibition of myocardial lesions in the JCR: LA-corpulent rat by captopril [J]. J Cardiovasc Pharmacol,1998;31(6):971-977.
[2] Black SC, Driscoll EM, Lucchesi BR. Effect of ramiprilat or captopril on myocardial infarct size: Assessment in canine models of ischemia alone and ischemia with reperfusion [J]. Pharmacology, 1998; 57(1): 35-46.
, http://www.100md.com
[3] Mustafa SJ. Cell culture and application [M]. New York: Acad Press, 1977: 729-752.
[4] Lowry OH, Roseberough NJ, Farr AL et al. Protein measurement with folin phenol-reagent [J]. J Bio Chem, 1951;193(1):265-275.
[5] Chinese Cardiac Study (CCS-1) Collaborative Group. Oral captopril versus placebo among 14962 patients with suspected acute myocardial infarction: A multicenter, randomized, double-blind, placebo controlled clinical trial [J]. Chin Med J, 1997;110(11):834-838.
, 百拇医药
[6] Dogan R, Sarigul A, Isbir S et al. Beneficial effect of captopril against ischaemia-reperfusion injury in isolated guinea pig hearts [J]. Scand J Clin Lab Invest, 1998; 58(2): 119-126.
[7] de Cavanagh EM, Fraga CG, Ferder L et al. Enalapril and captopril enhance antioxidant defenses in mouse tissues [J]. Am J Physiol, 1997; 272(2 Pt 2): R514-R518.
收稿日期：2000-01-15； 修回日期：2000-03-28, 百拇医药