风心病心肌细胞培养模型的建立及其胶原合成
作者：宋智钢 刘维永
单位：宋智钢(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；刘维永(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)
关键词：风湿性心脏病；成熟心肌细胞；体外培养；胶原
第四军医大学学报000508 摘 要： 目的 建立风心病心肌细胞体外培养方法，观察其胶原合成变化. 方法 采用快速贴 壁法对正常成人7例和风心患者15例左室乳头肌心肌细胞进行原代培养，观察培养期间其形 态、超微结构、活性及胶原合成的变化. 结果 培养的成人心肌细胞短而 粗呈杆状，无明显 自主收缩；48 h后杆状细胞率为(87.2±4.1)%，细胞存活率为(92.8±4.1)%，两者随培 养 时间延长而降低；透射电镜显示杆状细胞超微结构正常；免疫组化染色显示风心病心肌细胞 Ⅰ,Ⅲ型胶原呈阳性表达，正常组呈阴性或弱阳性表达；胶原合成测定结果显示风心组[2,3 -3H]-脯胺酸摄取量显著高于正常组. 结论 我们建立的成熟心肌细 胞分离和培养方法可靠，培养心肌细胞保持了在体的杆状形态，风心病心肌细胞培养48 h后 胶原合成表型仍存在，该方法的建立为研究心肌细胞参与风心病心肌纤维化的调控机制提供 了一个有效的实验手段.
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中图号：R654.2 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-0543-04
Establishment of culturing adult cardiomyocytes model with rheumatic heart disea se and study on its collagen synthesis
SONG Zhi-Gang, LIU Wei-Yong
(Department of Cardiovascular Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical U niversity, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To establish a method for culturing adult cardiomyocytes with rheu matic heart disease (ACMR) in vitro, and to study the changes in its collage n sy nthesis. METHODS The adult cardiomyocytes (ACM) of left ven-tricular papillary mu scle of seven normal persons and fifteen patients with rheumatic heart disease w ere cultured primarily in vitro by means of rapid attachment. The changes in mor phology, ultrastructure, viability and collagen synthesis of ACM were studied in culture. RESULTS The cultured ACM were rod-shaped without sp ontaneous contract ility. The ratio of rod-shaped cells and viable cells was (87.2±4.1)% and (92 .8±4.1)% after 48 h in culture, and the ultrastructure of rod-shaped cells was sim ilar to that of the cardiac tissue in vivo. Immunohistochemistry staining sh owed that the expression of type Ⅰ, Ⅲ collagen in cultured ACMR was positive, whil e that of the control group was negative or weakly positive. The collagen synthe sis of ACMR cultured in medium with normal human or RHD patient's serum was sign ificantly higher than that of the control group. CONCLUSION Th e method for isola ting and culturing ACM is reliable, and the phenotype of collagen synthesis of A CMR still existed after 48 h in culture. This model provides an effective experi m ental method for studying the mechanism of myocardial fibrosis in rheumatic hear t disease that cardiomyocytes participate in.
, 百拇医药
Keywords: rheumatic heart disease; adult cardiomyocytes; culture in vitro; collagen
0 引言
风心病心肌纤维化是一个复杂的病理过程，主要由免疫反应、缺血及血液动力学改变所导致 . 以往研究发现，不仅间质细胞参与风心病心肌纤维化的形成过程，而且左室心肌细胞亦发 生表型改变，参与心肌胶原的合成[1, 2]. 成熟心肌细胞(adult cardiomyocytes , ACM) 的体外培养虽有报道，但风心患者左室心肌细胞的体外培养未见研究报道. 我们建立一种风 心病心肌细胞(adult cardiomyocytes with rheu-matic heart disease, ACMR)体外培 养 模型，并初步观察其生物学行为及胶原合成的改变，为进一步研究风心病心肌细胞参与胶原 合成的调控机制奠定基础.
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1 材料和方法
1.1 材料 标本取自左室乳头肌. 正常组(Con-trol) 7例， 20～25岁， 为脑死亡且尸检中排除 有心血管及胶原系统疾病者，死后1 h内取材. 风心组(RHD)15例，40～60岁，为风湿性心 脏 瓣膜病行二尖瓣或双瓣置换术者，心功能Ⅲ～Ⅳ级，术中取材，标本采集后放入4℃氧合的M 199合成培养基中. 根据培养条件不同各组又分两个亚组，A：ACM培养于正常人血清中，B： ACM培养于风心患者血清中. 主要试剂有溶液A (mmol.L-1)： NaCl 130, KCl 4.5, MgCl2 5, NaH2PO4 1,丙酮酸钠5, HEPES 23, 葡萄糖21, 牛磺酸20, 肌酸 5 (NaOH调pH 7.2, 950 mL.L-1 O2和50 mL.L-1 CO2混合气氧合). 溶液B (mmol.L-1): KCl 20, KH2 PO4 10, EGTA 5, 葡萄糖10, 谷胺酸70, 牛磺酸10 (KOH调pH 7.2, 950 mL.L-1 O2和50 mL.L-1 CO2 混合气氧合). 合成培养基： 不含L-谷氨酰胺的M199培养基(Hyclon公司)，BSA 2 g.L-1，HEPES 25 mmol.L -1，胰岛素20 U.L-1 ，丙酮酸钠5 mmol.L-1，肌酸5 mmol.L-1，牛磺酸5 mmol.L-1， L-肉毒碱2 mmol.L-1，青霉素10万U.L-1, 链霉素100 mg.L-1(NaO H调pH 7.2).
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1.2 方法 将左室乳头肌剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的 组织块，1 g.L-1胶原酶(ⅠA型，Sigma公司 )37℃消化弃消化液，溶液B振荡，弃上清. 再用胶原酶多次消化组织块，弃消化液，分别 加入含10 g.L-1牛血清白蛋白(BSA)的溶液B，振荡吹打并收集细胞悬液，混合以上 各细胞悬液 离心(50 g×2 min)，沉淀分别用含0.5, 1.0 mmol.L-1 Ca2+及10 g.L- 1 BSA的溶液A重悬、离心后， 用含150 mL.L-1胎牛血清(Hyclon公司)的M199培养基悬浮细胞，以104/cm2的 密度接种于层粘 连蛋白预覆4 h的培养板中，于37℃，50 mL.L-1 CO2培养箱中培养，8 h后更换培 养基. 培养期间 倒置显微镜观察细胞形态，计杆状细胞率，台盼蓝排斥法计算细胞存活率，并进行以下测定 ：①培养48 h后收集细胞，30 mL.L-1戊二醛固定，包埋、超薄切片，透射电镜观察 ；②ACM接种 于L-多聚赖胺酸包被的盖玻片上，培养48 h后弃培养基，PBS洗，4℃丙酮固定20 min ，采用 Dako EnVisionTM两步法分别进行心肌横纹肌肌动蛋白和Ⅰ,Ⅲ型胶原免疫组化染色， 镜下观 察. 均设有空白对照和替代对照，结果阴性，表明本实验免疫组化染色方法特异，可靠；③ ACM接种于6孔培养板，无血清培养基培养24 h后根据分组分别更换含100 mL.L-1正 常人或风心病患者血清的M199培养基，24 h后每孔加入370 kBq [2,3-3H]-脯胺酸， 继续培养8 h弃培 养基，D-Hanks液洗涤，收集心肌细胞计数并行液闪测定ACM胶原合成量.
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统计学处理： 数值以平均值±标准差(
±s)表示，组间比较采用t检验.
2 结果
2.1 细胞形态学表现 ACM接种8 h后大部分已贴壁，细胞形态短而粗呈杆状 ，部分细胞末端呈 阶梯状，胞膜完整，横纹清晰，胞核清楚，无明显自主收缩(Fig 1A). 正常组杆状细胞大 小较均等，实验组可见部分杆状细胞异常肥大. 48 h后细胞有的开始变圆或末端阶梯状形态 消失(Fig 1B)；5 d后圆形细胞数增多，但细胞膜大多清晰可见(Fig 1C)；7 d后多数圆 形细 胞变为不规则形态，并有许多细胞碎片形成(Fig 1D). 培养ACM各时间点杆状细胞率和细 胞 存活率见Tab 1. 风心病患者心肌细胞培养48 h后超微结构显示：圆形细胞T管消失，肌丝排 列紊 乱，有的溶解断裂，线粒体结构正常或有空泡形成(Fig 2A). 杆状细胞肌丝平行排列、清 晰，T管清楚，肌小节间可见糖元颗粒，肌浆网、线粒体结构正常(Fig 2B).
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表1 培养ACM各时间点杆状细胞率和细胞存活率
Tab 1 The ratio of rod-shaped cells
and viable cells of ACM in culture (%,±s) Cell
n
Isola-
ting
t(culture)/d
1/3
2
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7
Rod-shaped cells
Control
7
90±5
94±4
90±5
84±6
80±4
RHD
15
88±5
, http://www.100md.com
92±4
87±4
82±6
79±5
Viable cells
Control
6
-
-
95±3
90±5
87±4
RHD
, 百拇医药
8
-
-
93±4
87±3
84±4
2.2 免疫组化染色结果 正常组和风心组细胞心肌横纹肌肌动蛋白表达阳性 ，此为心肌特异性蛋白，说明培养的细胞均为心肌细胞[3]. 培养期间无成纤维细 胞生长. 风心组大部分ACM Ⅰ,Ⅲ型胶原蛋白呈强阳性表达，主要定位于胞质中(Fig 3B, 3 D)；而正常组呈弱阳性或阴性表达(Fig 3A, 3C).
2.3 ACM胶原合成的变化 RHDA组和RHDB组[2,3-3 H]-脯胺酸摄取量按cpm计算分别为(12.6± 3.6)×10-4/cell和(16.8±4.6)×10-4/cell，较ControlA组(0.9 ±0.3)×10-4/cell和ControlB组(1.1±0.3)×10-4/cell显著增高( P<0.01)；RHDB 组[2,3 -3H]-脯胺酸摄取量高于RHDA组(P<0.05)，而ControlA组和ControlB组无 显著差异.
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图1 风心病心肌细胞培养过程中形态
Fig 1 ACMR morphology in culture ×400
A: After 8 h; B: After 48 h; C: After 5 d; D: After 7 d.
图2 培养48 h后风心病心肌细胞超微结构
Fig 2 ACMR ultrastructure after 48 h in culture
A: Rounded cell ×10 000; B: Rod-shaped cell ×12 000.
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图3 培养心肌细胞Ⅰ，Ⅲ型胶原免疫组化染色结果
Fig 3 TypeⅠ, Ⅲ collagen expression in cultured ACM by immunohistochemistry st aining ×400
A: CollagenⅠin control; B: CollagenⅠin RHD; C: Collagen Ⅲ in control; D: Collagen Ⅲ in RHD.
3 讨论
ACM属终末期细胞，与新生细胞相比更脆弱，极易受缺血、缺氧、酶消化和机械刺激 等因素的损伤；而且ACM由闰盘和细胞外间质形成强有力的物理连接，因此难于分离；另外 ，无钙环境下分离的ACM为不耐钙细胞，当细胞外环境恢复为生理状态下时极易产生瞬间收 缩而失去在体的形态，为此ACM的分离培养具有相当的难度[4,5]. 目前，ACM的培 养技术主 要有再分化法(redifferentiation)和快速贴壁法(rapid attachment)，我们采用快速 贴壁法，细胞分离采用浸入法，标本取材和分离过程中的所有溶液均经氧合，组织块消化采 用短时间、多次消化，从而大大减轻各种因素对心肌细胞的损伤；分离后的心肌细胞进行梯 度复钙，使其逐渐适应钙浓度的变化，而且我们用10 g.L-1 BSA溶液对分离后细胞 进行短时间 多次离心，以去除圆形细胞和非心肌细胞，明显提高了杆状细胞率；在分离溶液和培养基中 我们加入牛磺酸和肉毒碱，此不仅能有效地保护细胞膜的功能，而且有助于心肌细胞在体外 培养条件下保持在体形态[6]. 风心病患者心肌均有不同程度的纤维化，因此消化 时 间应视纤维化程度加重和患者年龄的增高而适当延长，时间不宜超过20 min，否则将明显损 伤心肌细胞.
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我们成功建立人类风心病心肌细胞培养模型，在培养条件下成年和风心病心肌细胞保持了在 体的短杆状形态，有肌丝，散在性分部，无明显自主收缩，杆状细胞率在培养48 h内保持在 87%以上，其间8 h可达92%，心肌横纹肌肌动蛋白免疫组化染色均呈阳性表达，提示本组 建 立的ACM分离和培养方法可靠，纯度高. 48 h后杆状细胞周边轮廓变钝，有的开始变圆，随 着 培养时间的延长圆形细胞数逐渐上升，7 d可高达20%，胞质溶解，并形成较多细胞碎片；细 胞活性检测在48 h内为93%，其变化与形态学变化密切相关；培养48 h细胞超微结构观察显 示 杆状细胞结构完整，圆形细胞结构模糊，呈现退行性变甚至破裂，提示作为培养的ACM模型 以选择24～48 h点的标本进行实验比较适宜.
目前，由于缺乏一种理想的风心病动物模型，因此风心病心肌细胞表型改变的确切机 制仍不甚清楚. 利用心肌细胞的体外培养，可以排除神经体液及血液动力学等多因素的影响 ，在一种特定环境下从细胞水平研究各种因子对风心病心肌细胞的影响[3]. Bugai sky等[7] 认为，体外培养48 h内成年大鼠心肌细胞仍能表现在体表型. 本组培养48 h风心病心肌细胞 Ⅰ ,Ⅲ免疫组化染色结果显示胞质呈阳性表达，对照组为阴性或弱阳性，胶原合成测定显示正 常人血清特别是风心病自身血清可明显促进风心病心肌细胞胶原合成. 这不仅提示此类培养 心肌细胞参与合成胶原表型仍存在，而且该模型为进一步研究风心病心肌细胞表型改变的调 控机制奠定了基础.
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870790)
作者简介：宋智钢(1967-)， 男(汉族)， 山东省泰安市人. 主治医师， 博士后(导师刘维永). Tel.(029)3375314 Email. zhigangs@fmmu.edu.cn；
参考文献:
[1] 樊 宏，刘维永，晏培松et al. 风湿性心脏病二尖瓣和心肌间质 病理组织学及免疫组化观察[J]. 中华医学杂志，1996；76(3)：183-186.
[2] 张近宝，刘维永，晏培松et al. 增殖细胞核抗原、α-平滑肌肌动蛋白 在风湿性心脏病乳头肌中的表达及意义[J]. 中华医学杂志，1998；78(5)：337-339.
[3] Yu JZ, Bondy GP, Allard MF et al. Serum from patients with chron ic renal ins ufficiency alters growth characteristics and ANP mRNA expression of adult rat ca rdiac myocytes [J]. J Mol Cell Cardiol, 1996; 28(12): 2429-2441.
, 百拇医药
[4] Jacobson SL, Piper HM. Cell culture of adult cardiomyocytes as model s of the myocardium [J]. J Mol Cell Cardiol, 1986; 18(7): 661-678.
[5] Mitcheson JS, Hancox JC, Leve AJ. Culture adult cardiac myocytes: Fu ture app lications, culture methods, morphological and electrophysiological properties [ J]. Cardiovasc Res, 1998; 39(2): 280-300.
[6] Volz A, Piper HM, Siegmund B et al. Longevity of adult ventricul ar rat heart muscle cells in serum-free primary culture [J]. J Mol Cell Cardiol, 1991 ; 23(2): 161-173.
[7] Bugaisky LB, Zak R. Differentiation of adult rat cardiac myocytes in cell culture [J]. Circulation Res, 1989; 64(3): 493-500.
收稿日期：2000-01-18； 修回日期：2000-02-16, 百拇医药
单位：宋智钢(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；刘维永(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)
关键词：风湿性心脏病；成熟心肌细胞；体外培养；胶原
第四军医大学学报000508 摘 要： 目的 建立风心病心肌细胞体外培养方法，观察其胶原合成变化. 方法 采用快速贴 壁法对正常成人7例和风心患者15例左室乳头肌心肌细胞进行原代培养，观察培养期间其形 态、超微结构、活性及胶原合成的变化. 结果 培养的成人心肌细胞短而 粗呈杆状，无明显 自主收缩；48 h后杆状细胞率为(87.2±4.1)%，细胞存活率为(92.8±4.1)%，两者随培 养 时间延长而降低；透射电镜显示杆状细胞超微结构正常；免疫组化染色显示风心病心肌细胞 Ⅰ,Ⅲ型胶原呈阳性表达，正常组呈阴性或弱阳性表达；胶原合成测定结果显示风心组[2,3 -3H]-脯胺酸摄取量显著高于正常组. 结论 我们建立的成熟心肌细 胞分离和培养方法可靠，培养心肌细胞保持了在体的杆状形态，风心病心肌细胞培养48 h后 胶原合成表型仍存在，该方法的建立为研究心肌细胞参与风心病心肌纤维化的调控机制提供 了一个有效的实验手段.
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文章编号：1000-2790(2000)05-0543-04
Establishment of culturing adult cardiomyocytes model with rheumatic heart disea se and study on its collagen synthesis
SONG Zhi-Gang, LIU Wei-Yong
(Department of Cardiovascular Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical U niversity, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To establish a method for culturing adult cardiomyocytes with rheu matic heart disease (ACMR) in vitro, and to study the changes in its collage n sy nthesis. METHODS The adult cardiomyocytes (ACM) of left ven-tricular papillary mu scle of seven normal persons and fifteen patients with rheumatic heart disease w ere cultured primarily in vitro by means of rapid attachment. The changes in mor phology, ultrastructure, viability and collagen synthesis of ACM were studied in culture. RESULTS The cultured ACM were rod-shaped without sp ontaneous contract ility. The ratio of rod-shaped cells and viable cells was (87.2±4.1)% and (92 .8±4.1)% after 48 h in culture, and the ultrastructure of rod-shaped cells was sim ilar to that of the cardiac tissue in vivo. Immunohistochemistry staining sh owed that the expression of type Ⅰ, Ⅲ collagen in cultured ACMR was positive, whil e that of the control group was negative or weakly positive. The collagen synthe sis of ACMR cultured in medium with normal human or RHD patient's serum was sign ificantly higher than that of the control group. CONCLUSION Th e method for isola ting and culturing ACM is reliable, and the phenotype of collagen synthesis of A CMR still existed after 48 h in culture. This model provides an effective experi m ental method for studying the mechanism of myocardial fibrosis in rheumatic hear t disease that cardiomyocytes participate in.
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Keywords: rheumatic heart disease; adult cardiomyocytes; culture in vitro; collagen
0 引言
风心病心肌纤维化是一个复杂的病理过程，主要由免疫反应、缺血及血液动力学改变所导致 . 以往研究发现，不仅间质细胞参与风心病心肌纤维化的形成过程，而且左室心肌细胞亦发 生表型改变，参与心肌胶原的合成[1, 2]. 成熟心肌细胞(adult cardiomyocytes , ACM) 的体外培养虽有报道，但风心患者左室心肌细胞的体外培养未见研究报道. 我们建立一种风 心病心肌细胞(adult cardiomyocytes with rheu-matic heart disease, ACMR)体外培 养 模型，并初步观察其生物学行为及胶原合成的改变，为进一步研究风心病心肌细胞参与胶原 合成的调控机制奠定基础.
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1 材料和方法
1.1 材料 标本取自左室乳头肌. 正常组(Con-trol) 7例， 20～25岁， 为脑死亡且尸检中排除 有心血管及胶原系统疾病者，死后1 h内取材. 风心组(RHD)15例，40～60岁，为风湿性心 脏 瓣膜病行二尖瓣或双瓣置换术者，心功能Ⅲ～Ⅳ级，术中取材，标本采集后放入4℃氧合的M 199合成培养基中. 根据培养条件不同各组又分两个亚组，A：ACM培养于正常人血清中，B： ACM培养于风心患者血清中. 主要试剂有溶液A (mmol.L-1)： NaCl 130, KCl 4.5, MgCl2 5, NaH2PO4 1,丙酮酸钠5, HEPES 23, 葡萄糖21, 牛磺酸20, 肌酸 5 (NaOH调pH 7.2, 950 mL.L-1 O2和50 mL.L-1 CO2混合气氧合). 溶液B (mmol.L-1): KCl 20, KH2 PO4 10, EGTA 5, 葡萄糖10, 谷胺酸70, 牛磺酸10 (KOH调pH 7.2, 950 mL.L-1 O2和50 mL.L-1 CO2 混合气氧合). 合成培养基： 不含L-谷氨酰胺的M199培养基(Hyclon公司)，BSA 2 g.L-1，HEPES 25 mmol.L -1，胰岛素20 U.L-1 ，丙酮酸钠5 mmol.L-1，肌酸5 mmol.L-1，牛磺酸5 mmol.L-1， L-肉毒碱2 mmol.L-1，青霉素10万U.L-1, 链霉素100 mg.L-1(NaO H调pH 7.2).
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1.2 方法 将左室乳头肌剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的 组织块，1 g.L-1胶原酶(ⅠA型，Sigma公司 )37℃消化弃消化液，溶液B振荡，弃上清. 再用胶原酶多次消化组织块，弃消化液，分别 加入含10 g.L-1牛血清白蛋白(BSA)的溶液B，振荡吹打并收集细胞悬液，混合以上 各细胞悬液 离心(50 g×2 min)，沉淀分别用含0.5, 1.0 mmol.L-1 Ca2+及10 g.L- 1 BSA的溶液A重悬、离心后， 用含150 mL.L-1胎牛血清(Hyclon公司)的M199培养基悬浮细胞，以104/cm2的 密度接种于层粘 连蛋白预覆4 h的培养板中，于37℃，50 mL.L-1 CO2培养箱中培养，8 h后更换培 养基. 培养期间 倒置显微镜观察细胞形态，计杆状细胞率，台盼蓝排斥法计算细胞存活率，并进行以下测定 ：①培养48 h后收集细胞，30 mL.L-1戊二醛固定，包埋、超薄切片，透射电镜观察 ；②ACM接种 于L-多聚赖胺酸包被的盖玻片上，培养48 h后弃培养基，PBS洗，4℃丙酮固定20 min ，采用 Dako EnVisionTM两步法分别进行心肌横纹肌肌动蛋白和Ⅰ,Ⅲ型胶原免疫组化染色， 镜下观 察. 均设有空白对照和替代对照，结果阴性，表明本实验免疫组化染色方法特异，可靠；③ ACM接种于6孔培养板，无血清培养基培养24 h后根据分组分别更换含100 mL.L-1正 常人或风心病患者血清的M199培养基，24 h后每孔加入370 kBq [2,3-3H]-脯胺酸， 继续培养8 h弃培 养基，D-Hanks液洗涤，收集心肌细胞计数并行液闪测定ACM胶原合成量.
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统计学处理： 数值以平均值±标准差(
±s)表示，组间比较采用t检验.2 结果
2.1 细胞形态学表现 ACM接种8 h后大部分已贴壁，细胞形态短而粗呈杆状 ，部分细胞末端呈 阶梯状，胞膜完整，横纹清晰，胞核清楚，无明显自主收缩(Fig 1A). 正常组杆状细胞大 小较均等，实验组可见部分杆状细胞异常肥大. 48 h后细胞有的开始变圆或末端阶梯状形态 消失(Fig 1B)；5 d后圆形细胞数增多，但细胞膜大多清晰可见(Fig 1C)；7 d后多数圆 形细 胞变为不规则形态，并有许多细胞碎片形成(Fig 1D). 培养ACM各时间点杆状细胞率和细 胞 存活率见Tab 1. 风心病患者心肌细胞培养48 h后超微结构显示：圆形细胞T管消失，肌丝排 列紊 乱，有的溶解断裂，线粒体结构正常或有空泡形成(Fig 2A). 杆状细胞肌丝平行排列、清 晰，T管清楚，肌小节间可见糖元颗粒，肌浆网、线粒体结构正常(Fig 2B).
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表1 培养ACM各时间点杆状细胞率和细胞存活率
Tab 1 The ratio of rod-shaped cells
and viable cells of ACM in culture (%,
±s) Celln
Isola-
ting
t(culture)/d
1/3
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7
Rod-shaped cells
Control
7
90±5
94±4
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RHD
15
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Viable cells
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2.2 免疫组化染色结果 正常组和风心组细胞心肌横纹肌肌动蛋白表达阳性 ，此为心肌特异性蛋白，说明培养的细胞均为心肌细胞[3]. 培养期间无成纤维细 胞生长. 风心组大部分ACM Ⅰ,Ⅲ型胶原蛋白呈强阳性表达，主要定位于胞质中(Fig 3B, 3 D)；而正常组呈弱阳性或阴性表达(Fig 3A, 3C).
2.3 ACM胶原合成的变化 RHDA组和RHDB组[2,3-3 H]-脯胺酸摄取量按cpm计算分别为(12.6± 3.6)×10-4/cell和(16.8±4.6)×10-4/cell，较ControlA组(0.9 ±0.3)×10-4/cell和ControlB组(1.1±0.3)×10-4/cell显著增高( P<0.01)；RHDB 组[2,3 -3H]-脯胺酸摄取量高于RHDA组(P<0.05)，而ControlA组和ControlB组无 显著差异.
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图1 风心病心肌细胞培养过程中形态
Fig 1 ACMR morphology in culture ×400
A: After 8 h; B: After 48 h; C: After 5 d; D: After 7 d.
图2 培养48 h后风心病心肌细胞超微结构
Fig 2 ACMR ultrastructure after 48 h in culture
A: Rounded cell ×10 000; B: Rod-shaped cell ×12 000.
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图3 培养心肌细胞Ⅰ，Ⅲ型胶原免疫组化染色结果
Fig 3 TypeⅠ, Ⅲ collagen expression in cultured ACM by immunohistochemistry st aining ×400
A: CollagenⅠin control; B: CollagenⅠin RHD; C: Collagen Ⅲ in control; D: Collagen Ⅲ in RHD.
3 讨论
ACM属终末期细胞，与新生细胞相比更脆弱，极易受缺血、缺氧、酶消化和机械刺激 等因素的损伤；而且ACM由闰盘和细胞外间质形成强有力的物理连接，因此难于分离；另外 ，无钙环境下分离的ACM为不耐钙细胞，当细胞外环境恢复为生理状态下时极易产生瞬间收 缩而失去在体的形态，为此ACM的分离培养具有相当的难度[4,5]. 目前，ACM的培 养技术主 要有再分化法(redifferentiation)和快速贴壁法(rapid attachment)，我们采用快速 贴壁法，细胞分离采用浸入法，标本取材和分离过程中的所有溶液均经氧合，组织块消化采 用短时间、多次消化，从而大大减轻各种因素对心肌细胞的损伤；分离后的心肌细胞进行梯 度复钙，使其逐渐适应钙浓度的变化，而且我们用10 g.L-1 BSA溶液对分离后细胞 进行短时间 多次离心，以去除圆形细胞和非心肌细胞，明显提高了杆状细胞率；在分离溶液和培养基中 我们加入牛磺酸和肉毒碱，此不仅能有效地保护细胞膜的功能，而且有助于心肌细胞在体外 培养条件下保持在体形态[6]. 风心病患者心肌均有不同程度的纤维化，因此消化 时 间应视纤维化程度加重和患者年龄的增高而适当延长，时间不宜超过20 min，否则将明显损 伤心肌细胞.
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我们成功建立人类风心病心肌细胞培养模型，在培养条件下成年和风心病心肌细胞保持了在 体的短杆状形态，有肌丝，散在性分部，无明显自主收缩，杆状细胞率在培养48 h内保持在 87%以上，其间8 h可达92%，心肌横纹肌肌动蛋白免疫组化染色均呈阳性表达，提示本组 建 立的ACM分离和培养方法可靠，纯度高. 48 h后杆状细胞周边轮廓变钝，有的开始变圆，随 着 培养时间的延长圆形细胞数逐渐上升，7 d可高达20%，胞质溶解，并形成较多细胞碎片；细 胞活性检测在48 h内为93%，其变化与形态学变化密切相关；培养48 h细胞超微结构观察显 示 杆状细胞结构完整，圆形细胞结构模糊，呈现退行性变甚至破裂，提示作为培养的ACM模型 以选择24～48 h点的标本进行实验比较适宜.
目前，由于缺乏一种理想的风心病动物模型，因此风心病心肌细胞表型改变的确切机 制仍不甚清楚. 利用心肌细胞的体外培养，可以排除神经体液及血液动力学等多因素的影响 ，在一种特定环境下从细胞水平研究各种因子对风心病心肌细胞的影响[3]. Bugai sky等[7] 认为，体外培养48 h内成年大鼠心肌细胞仍能表现在体表型. 本组培养48 h风心病心肌细胞 Ⅰ ,Ⅲ免疫组化染色结果显示胞质呈阳性表达，对照组为阴性或弱阳性，胶原合成测定显示正 常人血清特别是风心病自身血清可明显促进风心病心肌细胞胶原合成. 这不仅提示此类培养 心肌细胞参与合成胶原表型仍存在，而且该模型为进一步研究风心病心肌细胞表型改变的调 控机制奠定了基础.
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870790)
作者简介：宋智钢(1967-)， 男(汉族)， 山东省泰安市人. 主治医师， 博士后(导师刘维永). Tel.(029)3375314 Email. zhigangs@fmmu.edu.cn；
参考文献:
[1] 樊 宏，刘维永，晏培松et al. 风湿性心脏病二尖瓣和心肌间质 病理组织学及免疫组化观察[J]. 中华医学杂志，1996；76(3)：183-186.
[2] 张近宝，刘维永，晏培松et al. 增殖细胞核抗原、α-平滑肌肌动蛋白 在风湿性心脏病乳头肌中的表达及意义[J]. 中华医学杂志，1998；78(5)：337-339.
[3] Yu JZ, Bondy GP, Allard MF et al. Serum from patients with chron ic renal ins ufficiency alters growth characteristics and ANP mRNA expression of adult rat ca rdiac myocytes [J]. J Mol Cell Cardiol, 1996; 28(12): 2429-2441.
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[4] Jacobson SL, Piper HM. Cell culture of adult cardiomyocytes as model s of the myocardium [J]. J Mol Cell Cardiol, 1986; 18(7): 661-678.
[5] Mitcheson JS, Hancox JC, Leve AJ. Culture adult cardiac myocytes: Fu ture app lications, culture methods, morphological and electrophysiological properties [ J]. Cardiovasc Res, 1998; 39(2): 280-300.
[6] Volz A, Piper HM, Siegmund B et al. Longevity of adult ventricul ar rat heart muscle cells in serum-free primary culture [J]. J Mol Cell Cardiol, 1991 ; 23(2): 161-173.
[7] Bugaisky LB, Zak R. Differentiation of adult rat cardiac myocytes in cell culture [J]. Circulation Res, 1989; 64(3): 493-500.
收稿日期：2000-01-18； 修回日期：2000-02-16, 百拇医药