SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析小分子多肽
作者：石继红 赵永同 王俊楼 韩苇 颜真 张英起
单位：石继红(第四军医大学生物技术中心，陕西 西安 710033)；赵永同(第四军医大学生物技术中心，陕西 西安 710033)；王俊楼(第四军医大学生物技术中心，陕西 西安 710033)；韩苇(第四军医大学生物技术中心，陕西 西安 710033)；颜真(第四军医大学生物技术中心，陕西 西安 710033)张英起(第四军医大学生物技术中心，陕西 西安 710033)
关键词：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；肽；蛋白质
第四军医大学学报000637 摘要：目的 研究SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示小分子多肽的方法. 方法 观察不同方法处理的样品，上样量对电泳结果的影响及对分子量标准(Mr 2512～16949)进行直线回归分析. 结果 样品的不同处理条件未见有差异；在该实验系统条件下上样样品为每孔5～10 μg较佳；分子量标准直线回归系数r=-0.962. 结论 样品处理方便；上样量少；在160 g.L-1 T，60 g.kg-1 C较低的丙烯酰胺含6 mol.L-1脲的分离胶中能够显示Mr为2512 的多肽，是一种显示小分子多肽的较好方法.
, 百拇医药
中图号：Q503 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0761-03
Analysis of low molecular peptides by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
SHI Ji-Hong ZHAO Yong-Tong WANG Jun-Lou HAN Wei YAN Zhen ZHANG Ying-Qi
(Biotechnology Centre, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To establish a sensitive method of electrophoresis for low molecular weight peptides. METHODS Tricine-SDS-polyarcrylamide gel electrophoresis with 6 mol.L-1 urea was used. The samples were treated with different methods(temperature and time interval) and varying loading quantity of samples. The linear regression analysis was made. RESULTS Different treatment of samples had no effect on the experimental results. The optimum loading scope of samples was 5～10 μg per lane. The correlation coefficient of molecular markers was -0.962. CONCLUSION Separating gel with 6 mol.L-1 urea at lower acrylamide concentration(160 g.L-1 T, 60 g.kg-1 C) is useful for identification of peptide with Mr from 2512 to 16949. It is convenient and simple to operate and is a well-established method for analysis of low molecular peptides.
, 百拇医药
Keywords: SDS-PAGE; peptides; proteins
0 引言
20世纪60年代Shapiro建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法之后，Weber，Glossmann和Douglas等人进行了多次改进，已显示出了在分离、鉴定和纯化蛋白质方面的优越性，但对于Mr小于10 000的蛋白质来说是无能为力的[1]. 20世纪80年代初Schägger等[2]应用脲分离蛋白质复合体亚单位的11种蛋白质，但分离效果不甚理想且重复性较差. 之后他们又进行了系统地研究和摸索，能够分离较大Mr范围内的蛋白质. 随着生物技术的飞速发展和基因工程药物的大量涌现，具有高生物活性的小分子多肽的分离、纯化和鉴定已显得尤为突出. 我们在进行基因工程药物的开发研制中，对SDS-PAGE方法进行了多次改进，在较低的丙烯酰胺浓度下取得了理想的结果. 此法所需仪器简单，操作方便，重现性好，时间短，只需微克量的多肽便可显带且能迅速估计出其Mr，值得进一步推广和利用.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 试剂和仪器 SDS、脲、甘油、过硫酸铵均为分析纯，西安化学试剂厂出品；丙烯酰胺(分析纯)为汕头市光华化学厂产品；N，N′-甲叉双丙烯酰胺(分析纯)为浙江黄岩人民化工厂生产； Tris(分析纯)为成都试剂厂出品；TEMED为BIO-RAD产品；Tricine(Ultra Pure Grade)为Solon Ind产品. BIO-RAD小型垂直式电泳附件模具；FD-201稳压稳流电泳仪(上海医用分析仪器厂).
1.2 肽分子质量标准 肽分子质量标准的Mr范围2512～16949为Pharmacia LKB 公司产品. 胸腺肽α1是美国加州圣马刁市赛生药品公司产品(商品名“ZADAXIN”)，是一乙酰化的多肽，Mr为3108， pI 3.8. 经 Sephadex G-25柱去除所含的甘露醇， 然后冷冻干燥，用样品缓冲液配成所需样品.
, 百拇医药
1.3 方法
1.3.1 电泳贮存液的配制 阳极缓冲液中Tris为0.2 mol.L-1用HCl调pH值至8.9. 阴极缓冲液为0.1 mol.L-1 的Tris， 0.1 mol.L-1的Tricine和0.01 g.L-1的SDS溶液，其pH值约为8.25. 胶缓冲液为3.0 mol.L-1的Tris和 0.03 g.L-1的SDS，用HCl调pH值至8.4.
称取48 g丙烯酰胺和1.5 g N，N′-甲叉双丙烯酰胺溶于100 mL纯水中，溶解混匀后经4号滤纸过滤即得到495 g.L-1 T，30 g.kg-1 C的贮存液；称取46.5 g丙烯酰胺和3.0 g N，N′-甲叉双丙烯酰胺溶于100 mL纯水中，同样得到495 g.L-1 T，60 g.kg-1 C的贮存液(T代表丙烯酰胺的总浓度，C代表交联度).
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1.3.2 胶的制备 与一般SDS-PAGE电泳相似[3]，按Tab 1给出的数据分别配制分离胶、间隙胶和浓缩胶，依次灌胶.
表 1 分离胶、间隙胶和浓缩胶的组成
Tab 1 Composition of separating, spacer and stacking gels Composition
Acrylamide
solution A
V/mL
Acrylamide
solution B
V/mL
, 百拇医药
Gel buffer
(V/mL)
Urea
Distilled
water
(V/mL)
Persulfate of
100 g.kg-1
(V/μL)
TEMED
(V/μL)
Final
, 百拇医药
volume
(V/mL)
Separating gel
160 g.L-1 T, 60 g.kg-1 C
with 6 mol.L-1 urea
-
3.3
3.3
3.6
1.0
, http://www.100md.com
45
4.5
10.05
Spacer gel
100 g.L-1 T, 30 g.kg-1 C
0.60
-
1.0
-
1.40
20
2.0
, 百拇医药
3.02
Stacking gel
60 g.L-1 T, 30 g.kg-1 C
0.30
-
0.93
-
1.27
25
2.5
2.53
, 百拇医药 A:495 g.L-1T,30 g.kg-1C;B:495 g.L-1 T,60 g.kg-1C. T: the total percentage concentration of both monomers； C: the percentage concentration of the corosslinkage.
1.3.3 样品缓冲液的制备及样品的处理 蛋白质样品与上样缓冲液(4 g.L-1 SDS，120 g.L-1甘油，50 mol.L-1 Tris，20 mL.L-1巯基乙醇含0.1 g.L-1溴酚蓝，pH 6.8)混合均匀，分别按40 ℃孵育30 min；60 ℃孵育10 min和煮沸2 min处理.
, 百拇医药
1.3.4 电泳条件 内槽装阴极缓冲液、外槽用阳极缓冲液恒压电泳，先40 V约1 h，当样品进入分离胶时，电压升至60 V约2 h.
1.3.5 染色、脱色和胶的保存 电泳完毕时胶置于染色液[ 2.5 g.L-1考马斯亮蓝R-250的乙醇(V)∶冰乙酸(V)∶水(V)为9∶2∶9 ]中振荡染色1.5～2 h，转至脱色液(400 mL.L-1的乙醇，40 mL.L-1的冰乙酸)中扩散脱色，直到背景清晰. 胶的保存与一般SDS-PAGE类同[3].
2 结果
2.1 不同处理的样品对SDS-PAGE的影响 多肽样品经上述3种不同处理，经SDS-PAGE后，分子质量蛋白标准(Mr 2512～16949)没有电泳差异，均能较清晰地显示6条带(Fig 1). 分子质量蛋白标准分别在每孔上不同量的蛋白质(Fig 2)，当上样量为1 μg时，分子质量蛋白标准仅能显示其中的5条带. 当上样量达到5～10 μg时，Mr 2512的肽带明显可见.
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2.2 分子量标准蛋白回归方程及对低分子量标准品的分析 应用160 g.L-1T，60 g.kg-1C含6 mol.L-1脲的丙烯酰胺凝胶能够较好地显示标准蛋白的6条带(Fig 1). 对其Mr对数(lgMr)和在分离胶中迁移的距离(μ)进行直线回归分析，回归方程为
= -0.0378x + 4.5512，相关系数r = -0.962，从曲线查及胸腺肽α1单体的Mr为3135(其理论Mr为3108).
图 1 样品的不同处理
, 百拇医药 Fig 1 Treated samples with different condition
Lane 1, 4: 40℃ 30 min; Lane 2, 5: 60℃ 10 min; Lane3,6:100℃ 2 min
图 2 样品量的不同对电泳的影响
Fig 2 Quantity's effect on electrophrosis
From lane 1 to 6 the protein quantity is 4, 8, 12, 16, 20, 24 μg respectively.
3 讨论
, 百拇医药
SDS-PAGE的有效分离范围取决于聚丙烯酰胺的浓度和交联度，其孔径随着双丙烯酰胺：丙烯酰胺比率的增加而减小，比率接近于1∶20时，孔径达到最小值[3]. Mr低于10 000的小分子肽，即使用较高浓度的聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE也不能完全分离[2]. 杨联萍等[4]指出用含脲的SDS-PAGE，即使用银染方法Mr小于8000的蛋白标准品也无着色. 而我们用含6 mol.L-1脲160 g.L-1 T，60 g.kg-1 C的SDS-PAGE方法，不需银染而直接用2.5 g.L-1的考马斯亮蓝R-250染色1.5～2 h，即可把标准品中的6条带显示得非常清楚，且简单方便，上样量小，重复性好. 实验范围内(蛋白标准Mr为2512～16 949)肽Mr的对数与迁移率呈良好的线性关系，相关系数r = -0.962. 我们以低Mr胸腺素α1作参照，其结果3153与实际Mr 3108标准相符，从而证明该方法的准确性和待测样品结果的可信性，该方法是一种显示小分子多肽和估测其Mr的较好方法. 在含SDS缓冲液的样品中，小分子多肽的浓缩是较困难的，这是因为小分子多肽与SDS形成的复合体具有和SDS本身类似的电荷和大小，因此浓缩对于小分子多肽的SDS-PAGE来说就成了一个突出的问题[5]. 上述方法中Tricine 以阳离子形式存在可以作为拖尾离子，使小分子多肽能够在浓缩胶中形成尽可能窄的带. 此外，快速的固定、染色和脱色对于小分子多肽电泳是必要的. 这主要是由于小分子多肽对染料的结合力较弱，易扩散冲洗掉而着色较差.随着生物活性多肽物质的发现和多肽类药物的研制，小分子多肽电泳变得越来越重要，已成为生物活性物质纯化分析过程中不可缺少、经常使用的快速鉴定方法.
, http://www.100md.com
作者简介：石继红(1963-)，男(汉族)，河北省枣强县人. 讲师. Tel.(029)3374774
参考文献：
[1] Cleveland DW, Fischer SG, Kirschner MW et al. Peptide mapping by limited proteolysis in sodiun dodecyl sulfate and analysis by gel electrophoresis[J]. J Bio Chem, 1977;252(3):1102-1106.
[2] Sch
gger H, Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 KDa[J]. Anal Biochem, 1987; 166(2): 368-397.
, 百拇医药
[3] 金冬雁，黎孟枫译. 分子克隆实验指南[M]，第2版. 北京：科学出版社，1992：880-887.
[4] 杨联萍，孔祥平，易学瑞. SDS-PAGE电泳对小分子多肽的分析[J]. 生物工程进展，1998；18(6)：49-51.
[5] Fish WW, Reynolds JA, Tanford C. Gel chromatography of proteins indenaturing solvents[J]. J Bio Chem, 1977; 245(19): 5166-5168.
收稿日期:1999-09-21
修回日期:1999-12-13, 百拇医药
单位：石继红(第四军医大学生物技术中心，陕西 西安 710033)；赵永同(第四军医大学生物技术中心，陕西 西安 710033)；王俊楼(第四军医大学生物技术中心，陕西 西安 710033)；韩苇(第四军医大学生物技术中心，陕西 西安 710033)；颜真(第四军医大学生物技术中心，陕西 西安 710033)张英起(第四军医大学生物技术中心，陕西 西安 710033)
关键词：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；肽；蛋白质
第四军医大学学报000637 摘要：目的 研究SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示小分子多肽的方法. 方法 观察不同方法处理的样品，上样量对电泳结果的影响及对分子量标准(Mr 2512～16949)进行直线回归分析. 结果 样品的不同处理条件未见有差异；在该实验系统条件下上样样品为每孔5～10 μg较佳；分子量标准直线回归系数r=-0.962. 结论 样品处理方便；上样量少；在160 g.L-1 T，60 g.kg-1 C较低的丙烯酰胺含6 mol.L-1脲的分离胶中能够显示Mr为2512 的多肽，是一种显示小分子多肽的较好方法.
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中图号：Q503 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0761-03
Analysis of low molecular peptides by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
SHI Ji-Hong ZHAO Yong-Tong WANG Jun-Lou HAN Wei YAN Zhen ZHANG Ying-Qi
(Biotechnology Centre, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To establish a sensitive method of electrophoresis for low molecular weight peptides. METHODS Tricine-SDS-polyarcrylamide gel electrophoresis with 6 mol.L-1 urea was used. The samples were treated with different methods(temperature and time interval) and varying loading quantity of samples. The linear regression analysis was made. RESULTS Different treatment of samples had no effect on the experimental results. The optimum loading scope of samples was 5～10 μg per lane. The correlation coefficient of molecular markers was -0.962. CONCLUSION Separating gel with 6 mol.L-1 urea at lower acrylamide concentration(160 g.L-1 T, 60 g.kg-1 C) is useful for identification of peptide with Mr from 2512 to 16949. It is convenient and simple to operate and is a well-established method for analysis of low molecular peptides.
, 百拇医药
Keywords: SDS-PAGE; peptides; proteins
0 引言
20世纪60年代Shapiro建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法之后，Weber，Glossmann和Douglas等人进行了多次改进，已显示出了在分离、鉴定和纯化蛋白质方面的优越性，但对于Mr小于10 000的蛋白质来说是无能为力的[1]. 20世纪80年代初Schägger等[2]应用脲分离蛋白质复合体亚单位的11种蛋白质，但分离效果不甚理想且重复性较差. 之后他们又进行了系统地研究和摸索，能够分离较大Mr范围内的蛋白质. 随着生物技术的飞速发展和基因工程药物的大量涌现，具有高生物活性的小分子多肽的分离、纯化和鉴定已显得尤为突出. 我们在进行基因工程药物的开发研制中，对SDS-PAGE方法进行了多次改进，在较低的丙烯酰胺浓度下取得了理想的结果. 此法所需仪器简单，操作方便，重现性好，时间短，只需微克量的多肽便可显带且能迅速估计出其Mr，值得进一步推广和利用.
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1 材料和方法
1.1 试剂和仪器 SDS、脲、甘油、过硫酸铵均为分析纯，西安化学试剂厂出品；丙烯酰胺(分析纯)为汕头市光华化学厂产品；N，N′-甲叉双丙烯酰胺(分析纯)为浙江黄岩人民化工厂生产； Tris(分析纯)为成都试剂厂出品；TEMED为BIO-RAD产品；Tricine(Ultra Pure Grade)为Solon Ind产品. BIO-RAD小型垂直式电泳附件模具；FD-201稳压稳流电泳仪(上海医用分析仪器厂).
1.2 肽分子质量标准 肽分子质量标准的Mr范围2512～16949为Pharmacia LKB 公司产品. 胸腺肽α1是美国加州圣马刁市赛生药品公司产品(商品名“ZADAXIN”)，是一乙酰化的多肽，Mr为3108， pI 3.8. 经 Sephadex G-25柱去除所含的甘露醇， 然后冷冻干燥，用样品缓冲液配成所需样品.
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1.3 方法
1.3.1 电泳贮存液的配制 阳极缓冲液中Tris为0.2 mol.L-1用HCl调pH值至8.9. 阴极缓冲液为0.1 mol.L-1 的Tris， 0.1 mol.L-1的Tricine和0.01 g.L-1的SDS溶液，其pH值约为8.25. 胶缓冲液为3.0 mol.L-1的Tris和 0.03 g.L-1的SDS，用HCl调pH值至8.4.
称取48 g丙烯酰胺和1.5 g N，N′-甲叉双丙烯酰胺溶于100 mL纯水中，溶解混匀后经4号滤纸过滤即得到495 g.L-1 T，30 g.kg-1 C的贮存液；称取46.5 g丙烯酰胺和3.0 g N，N′-甲叉双丙烯酰胺溶于100 mL纯水中，同样得到495 g.L-1 T，60 g.kg-1 C的贮存液(T代表丙烯酰胺的总浓度，C代表交联度).
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1.3.2 胶的制备 与一般SDS-PAGE电泳相似[3]，按Tab 1给出的数据分别配制分离胶、间隙胶和浓缩胶，依次灌胶.
表 1 分离胶、间隙胶和浓缩胶的组成
Tab 1 Composition of separating, spacer and stacking gels Composition
Acrylamide
solution A
V/mL
Acrylamide
solution B
V/mL
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Gel buffer
(V/mL)
Urea
Distilled
water
(V/mL)
Persulfate of
100 g.kg-1
(V/μL)
TEMED
(V/μL)
Final
, 百拇医药
volume
(V/mL)
Separating gel
160 g.L-1 T, 60 g.kg-1 C
with 6 mol.L-1 urea
-
3.3
3.3
3.6
1.0
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45
4.5
10.05
Spacer gel
100 g.L-1 T, 30 g.kg-1 C
0.60
-
1.0
-
1.40
20
2.0
, 百拇医药
3.02
Stacking gel
60 g.L-1 T, 30 g.kg-1 C
0.30
-
0.93
-
1.27
25
2.5
2.53
, 百拇医药 A:495 g.L-1T,30 g.kg-1C;B:495 g.L-1 T,60 g.kg-1C. T: the total percentage concentration of both monomers； C: the percentage concentration of the corosslinkage.
1.3.3 样品缓冲液的制备及样品的处理 蛋白质样品与上样缓冲液(4 g.L-1 SDS，120 g.L-1甘油，50 mol.L-1 Tris，20 mL.L-1巯基乙醇含0.1 g.L-1溴酚蓝，pH 6.8)混合均匀，分别按40 ℃孵育30 min；60 ℃孵育10 min和煮沸2 min处理.
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1.3.4 电泳条件 内槽装阴极缓冲液、外槽用阳极缓冲液恒压电泳，先40 V约1 h，当样品进入分离胶时，电压升至60 V约2 h.
1.3.5 染色、脱色和胶的保存 电泳完毕时胶置于染色液[ 2.5 g.L-1考马斯亮蓝R-250的乙醇(V)∶冰乙酸(V)∶水(V)为9∶2∶9 ]中振荡染色1.5～2 h，转至脱色液(400 mL.L-1的乙醇，40 mL.L-1的冰乙酸)中扩散脱色，直到背景清晰. 胶的保存与一般SDS-PAGE类同[3].
2 结果
2.1 不同处理的样品对SDS-PAGE的影响 多肽样品经上述3种不同处理，经SDS-PAGE后，分子质量蛋白标准(Mr 2512～16949)没有电泳差异，均能较清晰地显示6条带(Fig 1). 分子质量蛋白标准分别在每孔上不同量的蛋白质(Fig 2)，当上样量为1 μg时，分子质量蛋白标准仅能显示其中的5条带. 当上样量达到5～10 μg时，Mr 2512的肽带明显可见.
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2.2 分子量标准蛋白回归方程及对低分子量标准品的分析 应用160 g.L-1T，60 g.kg-1C含6 mol.L-1脲的丙烯酰胺凝胶能够较好地显示标准蛋白的6条带(Fig 1). 对其Mr对数(lgMr)和在分离胶中迁移的距离(μ)进行直线回归分析，回归方程为
= -0.0378x + 4.5512，相关系数r = -0.962，从曲线查及胸腺肽α1单体的Mr为3135(其理论Mr为3108).图 1 样品的不同处理
, 百拇医药 Fig 1 Treated samples with different condition
Lane 1, 4: 40℃ 30 min; Lane 2, 5: 60℃ 10 min; Lane3,6:100℃ 2 min
图 2 样品量的不同对电泳的影响
Fig 2 Quantity's effect on electrophrosis
From lane 1 to 6 the protein quantity is 4, 8, 12, 16, 20, 24 μg respectively.
3 讨论
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SDS-PAGE的有效分离范围取决于聚丙烯酰胺的浓度和交联度，其孔径随着双丙烯酰胺：丙烯酰胺比率的增加而减小，比率接近于1∶20时，孔径达到最小值[3]. Mr低于10 000的小分子肽，即使用较高浓度的聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE也不能完全分离[2]. 杨联萍等[4]指出用含脲的SDS-PAGE，即使用银染方法Mr小于8000的蛋白标准品也无着色. 而我们用含6 mol.L-1脲160 g.L-1 T，60 g.kg-1 C的SDS-PAGE方法，不需银染而直接用2.5 g.L-1的考马斯亮蓝R-250染色1.5～2 h，即可把标准品中的6条带显示得非常清楚，且简单方便，上样量小，重复性好. 实验范围内(蛋白标准Mr为2512～16 949)肽Mr的对数与迁移率呈良好的线性关系，相关系数r = -0.962. 我们以低Mr胸腺素α1作参照，其结果3153与实际Mr 3108标准相符，从而证明该方法的准确性和待测样品结果的可信性，该方法是一种显示小分子多肽和估测其Mr的较好方法. 在含SDS缓冲液的样品中，小分子多肽的浓缩是较困难的，这是因为小分子多肽与SDS形成的复合体具有和SDS本身类似的电荷和大小，因此浓缩对于小分子多肽的SDS-PAGE来说就成了一个突出的问题[5]. 上述方法中Tricine 以阳离子形式存在可以作为拖尾离子，使小分子多肽能够在浓缩胶中形成尽可能窄的带. 此外，快速的固定、染色和脱色对于小分子多肽电泳是必要的. 这主要是由于小分子多肽对染料的结合力较弱，易扩散冲洗掉而着色较差.随着生物活性多肽物质的发现和多肽类药物的研制，小分子多肽电泳变得越来越重要，已成为生物活性物质纯化分析过程中不可缺少、经常使用的快速鉴定方法.
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作者简介：石继红(1963-)，男(汉族)，河北省枣强县人. 讲师. Tel.(029)3374774
参考文献：
[1] Cleveland DW, Fischer SG, Kirschner MW et al. Peptide mapping by limited proteolysis in sodiun dodecyl sulfate and analysis by gel electrophoresis[J]. J Bio Chem, 1977;252(3):1102-1106.
[2] Sch
gger H, Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 KDa[J]. Anal Biochem, 1987; 166(2): 368-397., 百拇医药
[3] 金冬雁，黎孟枫译. 分子克隆实验指南[M]，第2版. 北京：科学出版社，1992：880-887.
[4] 杨联萍，孔祥平，易学瑞. SDS-PAGE电泳对小分子多肽的分析[J]. 生物工程进展，1998；18(6)：49-51.
[5] Fish WW, Reynolds JA, Tanford C. Gel chromatography of proteins indenaturing solvents[J]. J Bio Chem, 1977; 245(19): 5166-5168.
收稿日期:1999-09-21
修回日期:1999-12-13, 百拇医药