维甲酸诱导前列腺癌细胞DU-145凋亡有关的基因克隆
作者：邵晨 朱峰 晏伟 赵忠良 柴玉波 王成济 邵国兴
单位：邵晨(第四军医大学：西京医院泌尿外科，陕西 西安 710033)；朱峰(第四军医大学：基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033)；晏伟(第四军医大学：基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)；赵忠良(第四军医大学：基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033)；柴玉波(第四军医大学：基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033)；王成济(第四军医大学：基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033)
关键词：前列腺癌；凋亡；维甲酸；克隆
第四军医大学学报000636 摘要： 目的 克隆维甲酸诱导的前列腺癌细胞DU-145凋亡的未知相关基因. 方法 以全反式维甲酸(all-trans retinoic acid)诱导前列腺癌细胞系DU-145细胞凋亡，在此基础上，采用基于PCR技术的改良消减杂交方法克隆前列腺癌凋亡相关基因. 结果 成功克隆出一条与凋亡可能有密切关系的未知基因pcar，已被GenBank收录，登录号为AF174394. 结论 维甲酸诱导前列腺癌细胞DU-145凋亡的过程是一个多基因参与的复杂过程，pcar可能是参与这一过程的基因之一.
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中图号：R737.25 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0757-04
Cloning of apoptosis-related genes from prostate cancer cell line DU-145 induced by all trans retinoic acid
SHAO Chen SHAO Guo-Xing
(Department of Urology Surgery, Xijing Hospital)
ZHU Feng ZHAO Zhong-Liang CHAI Yu-Bo WANG Cheng-Ji
(Department of Biochemistry and Molecular Biology)
, http://www.100md.com
YAN Wei
(Department of Pathology, Faculty of Preclinical Medicine, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To clone apoptosis-related genes from prostate cancer cell line DU-145 induced by all trans retinoic acid(ATRA). METHODS The gene was cloned by improved PCR-based subtractive hybridization from apoptotic prostate cancer cell line DU-145 cells induced by ATRA. RESULTS We found an unknown gene-pcar which might berelated with apoptosis. It was registrated in Genbank with the accession number AF174394. CONCLUSION ATRA-induced apoptosis of DU-145 cell is a complex process with multiple genes involved. Pcar may be one of them.
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Keywords: prostate cancer; apoptosis; retinoic acid; clone
0 引言
细胞凋亡是细胞的一种主动死亡方式，它与细胞的增殖活动一道，共同调节生物的生命活动[1]. 凋亡是一个受遗传调控的自身编码死亡方式，涉及许多基因的共同作用[2]，这些基因中仍有相当一部分是未知的. 因此，对于这些未知凋亡基因的克隆，有助于人们进一步认识凋亡这一生命活动，对揭示一些疾病的发生、发展有着重要意义. 我们通过以全反式维甲酸(ATRA)诱导前列腺癌细胞系DU-145细胞凋亡[3]，建立细胞模型，应用基于PCR技术的改良消减杂交法，克隆与凋亡有关的新基因，这种经过改良的克隆基因方法，与原来的方法相比，操作步骤大大简化，而实验结果可能更为理想.
1 材料和方法
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1.1 材料 前列腺癌细胞系DU-145细胞由美国MD Anderson cancer center 分子生物学实验室提供，Bluescripe KS, DH5α由本校生物化学和分子生物学教研室保存. RPMI 1640(Gibco), All Trans-Retinoic Acid(Sigma)，Poly AT tract System-1000 kit (Promega) , Klen Taq LA Polymerase (Clontech)，Nucleo Trap Gel Extraction kit (Clontech)，柱离心式质粒(小量)抽提纯化试剂盒(上海华舜生物工程有限公司).
1.2 方法
1.2.1 细胞模型的建立 将处于对数生长期的DU-145细胞分为实验组、对照组两组，每组含1×106个细胞，在实验组中加入10 μL 10-2 mol.L-1 ATRA(溶于无水乙醇)，使培养液中ATRA终浓度为10-5 mol.L-1，对照组加入10 μL无水乙醇，培养液中小牛血清浓度为130 mL.L-1，培养36 h，收集细胞.
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1.2.2 提纯mRNA 应用Promega Poly AT tract system 1000试剂盒，提纯mRNA.
1.2.3 制备cDNA 实验组细胞mRNA用SMARTTM PCR cDNA synthesis kit(clontech)进行反转录，将试剂盒中的3′引物“T30(A/G/C)(A/G/C/T)”替代为3′锚定引物TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAAT30(A/G/C)(A/G/C/T)，该引物与“cap-finder” 引物前24 nt是一样的，其目的在于以后只用一条引物来扩增cDNA. 对照组细胞mRNA按常规进行反转录，以T18及10-mer随机引物R进行PCR，扩增产物作为杂交探针. 将3 μL实验组cDNA与100 μL杂交探针进行杂交，杂交16 h.
1.2.4 差异cDNA模板的获得 将杂交液加到Sephacryl S-400 spin column (Promega)，离心收集液体，将上述液体加到0.1 mL streptavidin magnesphere paramagnetic particles(Promega)中，37℃结合2 min，65℃温育5 min，减少非特异性杂交，在磁场作用下分离出上清作为PCR模板.
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1.2.5 差异片段的获得与克隆 由于差异cDNA模板在反转录时其两端已偶联上引物序列，因此可直接用PCR将其扩增出来. 将PCR产物沉淀，重新溶解于20 μL H2O中，加入PCR Buffer，100 mmol.L-1 dATP 1 μL, Taq酶4 μL 于72℃，反应1 h，此后进行15 g.L-1 Agarose电泳分离，用核酸胶回收试剂盒(Nucleo Trap Gel Extraction kit clontech)回收0.6～1.5 kb的片段，以T vector常规方法进行连接，转化，并挑选白色克隆，摇菌.
1.2.6 质粒的提取及鉴定 应用柱离心式质粒(小量)抽提纯化试剂盒提取质粒，用EcoRⅠ及HindⅢ进行插段鉴定，选取有插段的质粒. 以对照组cDNA为模板，用PCR方法制备探针. 反向点杂交方法鉴定有插段的质粒，选取阳性克隆，杂交时设立阴性和阳性对照.
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1.2.7 序列分析 纯化所选取的克隆，按说明进行测序反应，测定序列，正向测序完成后，进行BLAST比较，无同源性的序列再进行反向测序. 使用计算机软件PC/GENE 6.60版，并通过国际互联网(internet)利用NCBI Genbank和SWLSS-PROT ProDom数据库对所测得的基因进行：核酸及蛋白序列同源性分析(BLAST)，基因片段的编码区分析，局部组成复杂性分析(Local composition complexity Lcc).
2 结果
含有差异cDNA插段克隆的鉴定结果：选取鉴定大小在0.6～1.5 kb插段的克隆，较长片段的鉴定准备后续完成. 随机挑选16个白色克隆，鉴定出其中10个含有插段，Fig 1为部分克隆的酶切鉴定图(EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切).
, 百拇医药 图 1 部分克隆的酶切鉴定图
Fig 1 Identification of clones with inserted fragments by restriction enzymes digestion
A:DNA/EcoRⅠ & HindⅢ marker；B-J:white clones；H:clone of No.3.
反向Southern点杂交结果：将10个含有插段的克隆点膜，进行反向杂交，探针为对照组的PCR产物，杂交后放射自显影(Fig 2)，共有4个杂交阳性信号，右上方为阳性对照.
图 2 反向杂交后放射自显影图，右上角为阳性对照
Fig 2 Identification of flase positive clones by reverse dot bloting, the right-up dot is positive control
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序列测定及BLAST初步分析结果：将6个克隆以正向引物为测序引物，测序后进行计算机分析，其中3号克隆有可能为新基因，其余多为TNF, c-erbB-2等已知基因. 对3号克隆进行反向测序并进行拼接，可以接成完整序列(Fig 3). 利用internet对其核酸序列进行BLAST分析(Tab 1)，局部组成复杂性(LCC)分析，读框分析及推导其蛋白质序列(Fig 4)，并命名为pcar，登录入Genbank, 登录号为AF174394.
3 讨论
3.1 关于细胞模型 维甲酸是一类与维生素A结构相似的天然或合成物质，最早临床用于白血病的治疗，并认为其具有调控生物细胞增殖、分化的作用. 近年来，人们发现其对前列腺癌细胞的生长也有双向性的影响，Fong等[4]以ATRA作用于前列腺癌细胞LNCaP, 当浓度为10 μmol.L-1时，细胞生长明显受抑制并出现凋亡，而作用浓度降至0.1 μmol.L-1则促进细胞生长，这种作用和维甲酸的作用浓度关系密切. 同时，维甲酸对抗表皮生长因子EGF和TGF-α对前列腺癌细胞的促生长作用，加强了TGF-β对前列腺癌细胞生长的抑制作用，并且与去氢睾酮共同影响前列腺癌细胞分泌PSA的能力. 而维甲酸受体已证实为类固醇/甲状腺激素样受体家族成员之一[5]，它与雌激素对前列腺癌细胞的作用有类似之处[6]. 同时维甲酸可以使前列腺癌细胞的细胞核受体基因hRxR-alpha的表达升高，使细胞代谢发生改变[7]. Esquenet等[8]也发现，前列腺癌的生长与分化，不但受雄激素与生长因子的调控，RA及VD3等也参与调控. 高浓度维甲酸可以导致体外前列腺癌细胞凋亡已被广泛实验证实，但对于维甲酸在人体内对前列腺癌的影响尚存争议. 我们曾应用ATRA(10-5 mol.L-1)作用DU-145细胞48 h，发现细胞形态改变明显，伪足消失，细胞变圆，胞内颗粒增多，流式细胞仪出现凋亡峰(2.4%)，考虑到基因水平的改变往往应在细胞形态发生变化之前，因此选择在形态改变尚不显著的作用36 h(有关文章在整理中)，这是一个折中的选择，未必是最佳的时间点.
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图 3 3号克隆完整核酸序列
Fig 3 Whole nuclear acid sequence of clone No.3
表 1 基因序列的BLAST分析
Tab 1 The rough BLAST results of sequence of clone No.3 sequences producing significant alignements
Score (bits)
E Value
gb|AF184978-1|AF184978 Binary vector Pcldo454, complete seq…
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228
3e-57
gb|AD001531|SYNPGR 8V Cloning vector pGR8, complete seq…
228
3e-57
gb|U34887|U34887 Yeast integrating vector PRS 306 containing…
228
3e-57
gb|U84006|EVU84006 Expression vector pBSII-LUCINT firefly 1…
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222
2e-55
gb|AC005753|AC005753 Homo sapiens chromosome 5 PL clone 25…
216
1e-53
gb|AC006578.5|AC006578 Homo sapiens chromosome 17, clone 27
208
3e-51
T A A R R R E K G T A A R R R Q K G T A A R R R Q E G T A A R R R Q K G T A A R R R R G R R G G R G R R R G R R K E E G G G G K V G R G G G G E K R E K E R K K E I G K K R K K N K S R K E M S P F T C S Q P Q E K H S S I L Q L G E T Y L I S T A K I V L S R L G K T E Q V E L L L C E M F C Y Stop R P C L G Q V Stop W L Met P V I P P Q W E A E A G G S L E P R S S R P A W A T W Q N P I S T K N T T S S W A W Stop P A L V V P A T R E P E V G R S L E H G R C R L Q Stop A K S R L R H C T P A W Met T E Stop G P V S K K K K E R K K E K E K K K T Stop L Stop T H K P A G E F A L S G E T Q Stop K P S A K L Q Stop C G T I T T K S E R I K A F A L K Met Stop W Stop S Stop Y D V Met R L A L F T F V V F C S R
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图 4 推导的蛋白质序列
Fig 4 Sequence of translated protein
3.2 关于克隆的未知基因 从pcar的核酸序列BLAST分析结果(Tab 1)来看，它与目前的已知序列同源性极低，同时，我们利用计算机软件PC/GENE 6.60版对其进行局部组成复杂性分析，证明其编码区的LCC值曲线平缓，接近于1，相对于非编码区要高出许多，推导的蛋白质序列发现其有可能编码145个氨基酸(Fig 4)，而PDB蛋白库比较未发现其有同源蛋白，上述LCC分析及读框分析结果，说明pcar可能编码一未知蛋白. 我们实验中克隆出大量肿瘤坏死因子及c-erb B-2基因，而这两者均与凋亡关系密切，结合实验设计的“靶向性”较好，说明pcar有可能为一个与凋亡有密切关系的新基因，最后结论尚有待进一步实验证实.
3.3 关于克隆基因方法的改进 传统的DD-PCR技术工作量很大，得到的片段较小，而且片段在编码区内的几率小，假阳性率也高，最高可达80%，因而工作效率低. 而消减杂交技术同样步骤烦琐，工作量大，假阳性率高，而且对于低丰度的基因不能进行有效克隆[9]. 我们所采用的由赵忠良士首创的基于PCR的消减杂交方法是建立在Cap-finder技术，LD-PCR Biotion-dNTP，磁性分离系统及Sephacryl离心柱分离技术等多种新技术手段之上，在很大程度上解决了上述问题，它简化了实验步骤，减少了假阳性率的发生，对低丰度基因的克隆效果有很大提高，而且得到的序列多在编码区内. 这种新方法为克隆新基因提供了一个有意义的新的尝试.
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作者简介：邵 晨(1969-)，男(满族)，广东省南海县人. 博士生(导师邵国兴，王成济),住院医师. Tel.(029)3375624 Email.Shaochen@pub.xaonline.com
邵国兴(第四军医大学：西京医院泌尿外科，陕西 西安 710033)
参考文献：
[1] Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis a basic biologiphenomenon with wide-raging implications in tissue kinetics[J]. Br J Cancer, 1972;26(4):239-257.
[2] Ellis RE, Yuan JY, Horvitz. Mechanisms and functions of cell death[J]. Annu Rev Cell Biol,1991;7(2):663-698.
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[3] Shao ZM, Dawson MJ, Xiao SL et al. P53-independent Go/G, arest and apoptosis induced by a novel retinoid in human breast cancer cells[J]. Oncogene, 1995;11(3):493-505.
[4] Fong CJ, Debra M, Sutkowski et al . Effect of retinoic acid on the proliferation and secretory activity of androgen-responsive prostatic carcinoma cells[J]. T J Urol, 1993;149(5):1190-1194.
[5] Petkovich M, Brand H, Krust S et al. A human retinoic acid receptor which belongs to the family of nuclear recepors[J]. Nature, 1987;330(6147):440-450.
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[6] Hirose T, Kouhara H, Tomas J et al . Effect of retinonic acid on proliferation of estrogen-responsive transformed murine leydig cells in serum-free culure[J]. Caner Res, 1990;50(16):5060-5063.
[7] Dahiya R, Boyle B, Park HD et al. 13-Cis-retinoic acid-mediated growth inhibition of DU-145 human prostate cancer cell[J]. Biochem Mol Biol Int, 1994;32(1):1-12.
[8] Esquenet M, Swinnen TV, Heyns W et al. Control of LNCaP proliferation and differentiation:VD3 actions and interactions of andrgoens, l alpha. 25-dihydvoxy cholecalciferol all trans retinoic acid, 9-cis-RA and phenylacetate[J]. Prostate, 1996;28(30):182-194.
[9] 朱 峰. 参与PCR技术的缺陷与对策[J]. 生命科学，1998;10(11):37-39.
收稿日期：2000-01-19
修回日期：2000-03-03, 百拇医药
单位：邵晨(第四军医大学：西京医院泌尿外科，陕西 西安 710033)；朱峰(第四军医大学：基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033)；晏伟(第四军医大学：基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)；赵忠良(第四军医大学：基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033)；柴玉波(第四军医大学：基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033)；王成济(第四军医大学：基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033)
关键词：前列腺癌；凋亡；维甲酸；克隆
第四军医大学学报000636 摘要： 目的 克隆维甲酸诱导的前列腺癌细胞DU-145凋亡的未知相关基因. 方法 以全反式维甲酸(all-trans retinoic acid)诱导前列腺癌细胞系DU-145细胞凋亡，在此基础上，采用基于PCR技术的改良消减杂交方法克隆前列腺癌凋亡相关基因. 结果 成功克隆出一条与凋亡可能有密切关系的未知基因pcar，已被GenBank收录，登录号为AF174394. 结论 维甲酸诱导前列腺癌细胞DU-145凋亡的过程是一个多基因参与的复杂过程，pcar可能是参与这一过程的基因之一.
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中图号：R737.25 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0757-04
Cloning of apoptosis-related genes from prostate cancer cell line DU-145 induced by all trans retinoic acid
SHAO Chen SHAO Guo-Xing
(Department of Urology Surgery, Xijing Hospital)
ZHU Feng ZHAO Zhong-Liang CHAI Yu-Bo WANG Cheng-Ji
(Department of Biochemistry and Molecular Biology)
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YAN Wei
(Department of Pathology, Faculty of Preclinical Medicine, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To clone apoptosis-related genes from prostate cancer cell line DU-145 induced by all trans retinoic acid(ATRA). METHODS The gene was cloned by improved PCR-based subtractive hybridization from apoptotic prostate cancer cell line DU-145 cells induced by ATRA. RESULTS We found an unknown gene-pcar which might berelated with apoptosis. It was registrated in Genbank with the accession number AF174394. CONCLUSION ATRA-induced apoptosis of DU-145 cell is a complex process with multiple genes involved. Pcar may be one of them.
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Keywords: prostate cancer; apoptosis; retinoic acid; clone
0 引言
细胞凋亡是细胞的一种主动死亡方式，它与细胞的增殖活动一道，共同调节生物的生命活动[1]. 凋亡是一个受遗传调控的自身编码死亡方式，涉及许多基因的共同作用[2]，这些基因中仍有相当一部分是未知的. 因此，对于这些未知凋亡基因的克隆，有助于人们进一步认识凋亡这一生命活动，对揭示一些疾病的发生、发展有着重要意义. 我们通过以全反式维甲酸(ATRA)诱导前列腺癌细胞系DU-145细胞凋亡[3]，建立细胞模型，应用基于PCR技术的改良消减杂交法，克隆与凋亡有关的新基因，这种经过改良的克隆基因方法，与原来的方法相比，操作步骤大大简化，而实验结果可能更为理想.
1 材料和方法
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1.1 材料 前列腺癌细胞系DU-145细胞由美国MD Anderson cancer center 分子生物学实验室提供，Bluescripe KS, DH5α由本校生物化学和分子生物学教研室保存. RPMI 1640(Gibco), All Trans-Retinoic Acid(Sigma)，Poly AT tract System-1000 kit (Promega) , Klen Taq LA Polymerase (Clontech)，Nucleo Trap Gel Extraction kit (Clontech)，柱离心式质粒(小量)抽提纯化试剂盒(上海华舜生物工程有限公司).
1.2 方法
1.2.1 细胞模型的建立 将处于对数生长期的DU-145细胞分为实验组、对照组两组，每组含1×106个细胞，在实验组中加入10 μL 10-2 mol.L-1 ATRA(溶于无水乙醇)，使培养液中ATRA终浓度为10-5 mol.L-1，对照组加入10 μL无水乙醇，培养液中小牛血清浓度为130 mL.L-1，培养36 h，收集细胞.
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1.2.2 提纯mRNA 应用Promega Poly AT tract system 1000试剂盒，提纯mRNA.
1.2.3 制备cDNA 实验组细胞mRNA用SMARTTM PCR cDNA synthesis kit(clontech)进行反转录，将试剂盒中的3′引物“T30(A/G/C)(A/G/C/T)”替代为3′锚定引物TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAAT30(A/G/C)(A/G/C/T)，该引物与“cap-finder” 引物前24 nt是一样的，其目的在于以后只用一条引物来扩增cDNA. 对照组细胞mRNA按常规进行反转录，以T18及10-mer随机引物R进行PCR，扩增产物作为杂交探针. 将3 μL实验组cDNA与100 μL杂交探针进行杂交，杂交16 h.
1.2.4 差异cDNA模板的获得 将杂交液加到Sephacryl S-400 spin column (Promega)，离心收集液体，将上述液体加到0.1 mL streptavidin magnesphere paramagnetic particles(Promega)中，37℃结合2 min，65℃温育5 min，减少非特异性杂交，在磁场作用下分离出上清作为PCR模板.
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1.2.5 差异片段的获得与克隆 由于差异cDNA模板在反转录时其两端已偶联上引物序列，因此可直接用PCR将其扩增出来. 将PCR产物沉淀，重新溶解于20 μL H2O中，加入PCR Buffer，100 mmol.L-1 dATP 1 μL, Taq酶4 μL 于72℃，反应1 h，此后进行15 g.L-1 Agarose电泳分离，用核酸胶回收试剂盒(Nucleo Trap Gel Extraction kit clontech)回收0.6～1.5 kb的片段，以T vector常规方法进行连接，转化，并挑选白色克隆，摇菌.
1.2.6 质粒的提取及鉴定 应用柱离心式质粒(小量)抽提纯化试剂盒提取质粒，用EcoRⅠ及HindⅢ进行插段鉴定，选取有插段的质粒. 以对照组cDNA为模板，用PCR方法制备探针. 反向点杂交方法鉴定有插段的质粒，选取阳性克隆，杂交时设立阴性和阳性对照.
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1.2.7 序列分析 纯化所选取的克隆，按说明进行测序反应，测定序列，正向测序完成后，进行BLAST比较，无同源性的序列再进行反向测序. 使用计算机软件PC/GENE 6.60版，并通过国际互联网(internet)利用NCBI Genbank和SWLSS-PROT ProDom数据库对所测得的基因进行：核酸及蛋白序列同源性分析(BLAST)，基因片段的编码区分析，局部组成复杂性分析(Local composition complexity Lcc).
2 结果
含有差异cDNA插段克隆的鉴定结果：选取鉴定大小在0.6～1.5 kb插段的克隆，较长片段的鉴定准备后续完成. 随机挑选16个白色克隆，鉴定出其中10个含有插段，Fig 1为部分克隆的酶切鉴定图(EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切).
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Fig 1 Identification of clones with inserted fragments by restriction enzymes digestion
A:DNA/EcoRⅠ & HindⅢ marker；B-J:white clones；H:clone of No.3.
反向Southern点杂交结果：将10个含有插段的克隆点膜，进行反向杂交，探针为对照组的PCR产物，杂交后放射自显影(Fig 2)，共有4个杂交阳性信号，右上方为阳性对照.
图 2 反向杂交后放射自显影图，右上角为阳性对照
Fig 2 Identification of flase positive clones by reverse dot bloting, the right-up dot is positive control
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序列测定及BLAST初步分析结果：将6个克隆以正向引物为测序引物，测序后进行计算机分析，其中3号克隆有可能为新基因，其余多为TNF, c-erbB-2等已知基因. 对3号克隆进行反向测序并进行拼接，可以接成完整序列(Fig 3). 利用internet对其核酸序列进行BLAST分析(Tab 1)，局部组成复杂性(LCC)分析，读框分析及推导其蛋白质序列(Fig 4)，并命名为pcar，登录入Genbank, 登录号为AF174394.
3 讨论
3.1 关于细胞模型 维甲酸是一类与维生素A结构相似的天然或合成物质，最早临床用于白血病的治疗，并认为其具有调控生物细胞增殖、分化的作用. 近年来，人们发现其对前列腺癌细胞的生长也有双向性的影响，Fong等[4]以ATRA作用于前列腺癌细胞LNCaP, 当浓度为10 μmol.L-1时，细胞生长明显受抑制并出现凋亡，而作用浓度降至0.1 μmol.L-1则促进细胞生长，这种作用和维甲酸的作用浓度关系密切. 同时，维甲酸对抗表皮生长因子EGF和TGF-α对前列腺癌细胞的促生长作用，加强了TGF-β对前列腺癌细胞生长的抑制作用，并且与去氢睾酮共同影响前列腺癌细胞分泌PSA的能力. 而维甲酸受体已证实为类固醇/甲状腺激素样受体家族成员之一[5]，它与雌激素对前列腺癌细胞的作用有类似之处[6]. 同时维甲酸可以使前列腺癌细胞的细胞核受体基因hRxR-alpha的表达升高，使细胞代谢发生改变[7]. Esquenet等[8]也发现，前列腺癌的生长与分化，不但受雄激素与生长因子的调控，RA及VD3等也参与调控. 高浓度维甲酸可以导致体外前列腺癌细胞凋亡已被广泛实验证实，但对于维甲酸在人体内对前列腺癌的影响尚存争议. 我们曾应用ATRA(10-5 mol.L-1)作用DU-145细胞48 h，发现细胞形态改变明显，伪足消失，细胞变圆，胞内颗粒增多，流式细胞仪出现凋亡峰(2.4%)，考虑到基因水平的改变往往应在细胞形态发生变化之前，因此选择在形态改变尚不显著的作用36 h(有关文章在整理中)，这是一个折中的选择，未必是最佳的时间点.
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图 3 3号克隆完整核酸序列
Fig 3 Whole nuclear acid sequence of clone No.3
表 1 基因序列的BLAST分析
Tab 1 The rough BLAST results of sequence of clone No.3 sequences producing significant alignements
Score (bits)
E Value
gb|AF184978-1|AF184978 Binary vector Pcldo454, complete seq…
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gb|AD001531|SYNPGR 8V Cloning vector pGR8, complete seq…
228
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gb|U34887|U34887 Yeast integrating vector PRS 306 containing…
228
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gb|U84006|EVU84006 Expression vector pBSII-LUCINT firefly 1…
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图 4 推导的蛋白质序列
Fig 4 Sequence of translated protein
3.2 关于克隆的未知基因 从pcar的核酸序列BLAST分析结果(Tab 1)来看，它与目前的已知序列同源性极低，同时，我们利用计算机软件PC/GENE 6.60版对其进行局部组成复杂性分析，证明其编码区的LCC值曲线平缓，接近于1，相对于非编码区要高出许多，推导的蛋白质序列发现其有可能编码145个氨基酸(Fig 4)，而PDB蛋白库比较未发现其有同源蛋白，上述LCC分析及读框分析结果，说明pcar可能编码一未知蛋白. 我们实验中克隆出大量肿瘤坏死因子及c-erb B-2基因，而这两者均与凋亡关系密切，结合实验设计的“靶向性”较好，说明pcar有可能为一个与凋亡有密切关系的新基因，最后结论尚有待进一步实验证实.
3.3 关于克隆基因方法的改进 传统的DD-PCR技术工作量很大，得到的片段较小，而且片段在编码区内的几率小，假阳性率也高，最高可达80%，因而工作效率低. 而消减杂交技术同样步骤烦琐，工作量大，假阳性率高，而且对于低丰度的基因不能进行有效克隆[9]. 我们所采用的由赵忠良士首创的基于PCR的消减杂交方法是建立在Cap-finder技术，LD-PCR Biotion-dNTP，磁性分离系统及Sephacryl离心柱分离技术等多种新技术手段之上，在很大程度上解决了上述问题，它简化了实验步骤，减少了假阳性率的发生，对低丰度基因的克隆效果有很大提高，而且得到的序列多在编码区内. 这种新方法为克隆新基因提供了一个有意义的新的尝试.
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作者简介：邵 晨(1969-)，男(满族)，广东省南海县人. 博士生(导师邵国兴，王成济),住院医师. Tel.(029)3375624 Email.Shaochen@pub.xaonline.com
邵国兴(第四军医大学：西京医院泌尿外科，陕西 西安 710033)
参考文献：
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收稿日期：2000-01-19
修回日期：2000-03-03, 百拇医药