四种传代细胞株软琼脂抛锚能力观察
作者：李六金 李秦 施新猷 张海 张志培 师长宏 赵世君 押宗保
单位：李六金(第四军医大学实验动物研究中心, 陕西 西安 710033)；李秦(第四军医大学实验动物研究中心, 陕西 西安 710033)；施新猷(第四军医大学实验动物研究中心, 陕西 西安 710033)；张海(第四军医大学实验动物研究中心, 陕西 西安 710033)；张志培(第四军医大学实验动物研究中心, 陕西 西安 710033)；师长宏(第四军医大学实验动物研究中心, 陕西 西安 710033)
关键词：传代细胞系；克隆；克隆率；致瘤性
第四军医大学学报000629 摘要：目的 观察传代细胞在软琼脂中生长情况. 方法 将4种细胞与软琼脂混合均匀，铺于平皿中，置37℃,50～100 mL.L-1 CO2环境中培养. 观察细胞集落形成情况. 结果 本实验室的五株非洲绿猴肾细胞Vero-XAYU，Vero-XAYE，Vero-XAH，Vero-XAJN和Vero-XAM，三株猫肾细胞F81-XAJU，F81-XAM和F81-XAK不呈现致瘤性独立抛锚生长；犬肾细胞MDCK-XAYE，MDCK-XAYU，MDCK-XAJN，MDCK-XAJA和MDCK-XAM五株则呈现较低的致瘤性独立抛锚生长；两株金黄地鼠肾细胞BHK21-XAYU和BHK21-XAM及两株非洲绿猴肾细胞Vero-XAYU和Vero-XAK则呈现较高的致瘤性独立抛锚生长.
, 百拇医药
中图号：Q253 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0736-02
Anchoring ability of 4 passage cells strain in soft-agar
LI Liu-Jin LI Qin SHI Xin-You ZHANG Hai ZHANG Zhi-Pei SHI Chang-Hong ZHAO Shi-Jun YA Zong-Bao
(Laboratory Animal Research Center， Fourth Military Medical University,Xi'an, 710033,China)
Abstract:AIM To observe the growth of passage cells in soft-agar. METHODS Four kinds of passage cells were blended with soft-agar and cultured at 37℃, 5%～10% CO2 atmosphere and then the clone forming was observed. RESULTS Of the five strains of Vero-XAYU, Vero-XAYE, Vero-XAH, Vero-XAJN and Vero-XAM in our laboratory, 3 strains of F81-XAJU, F81-XAM,and F81-XAK grew anchor-free without carcinogenesis, but 5 strains of MDCK-XAYE,MDCK-XAYU,MDCK-XAJN,MDCK-XAJA,and MDCK-XAM grew anchor-free with lower-carcinogenesis; 2 strains of BHK21-XAYu,BHK21-XAM and another 2 strains of Vero-XAYU,Vero-XAK demonstrated an anchor-free growth with high carcinogenesis.
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Keyword:passage cell line; clone; clone ratio; carcinogenesis
0 引言
世界各国对兽医生物制品的制备型生产细胞、种毒质量及制备疫苗所涉及的试剂都非常重视，不仅制定有严格的制造法规、检验规程(法规)和质量标准(如药典规程等)，而且对制品的生产、推广和使用也颁布了严格的管理制度. 本实验结果客观地初步筛选出适合用于犬四联活疫苗制备的细胞.
1 材料和方法
1.1 材料 MEM-EAGLE(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青公司)；软琼脂(上海生物化学公司日本进口分装)；细胞Vero,MDCK,BHK21,F81由本中心冻存、提供.
1.2 方法 按照《中国兽药生产销售质量检验规程》关于软琼脂抛锚实验[1,2]的有关规定进行.
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2 结果
2.1 非洲绿猴肾细胞(Vero)系 本实验对Vero-XAJU;Vero-XAK;Vero-XAYU;Vero-XAYE;Vero-XAH;Vero-XAJN;Vero-XAM等7种不同地方引入的非洲绿猴肾细胞(Vero)系，进行各代次的软琼脂实验，表明Vero-XAJU和Vero-XAK细胞的两剂量水平有显著的克隆生长(P<0.01)，说明具有抛锚独立性生长这一特性. Vero-XAYU,Vero-XAYE,Vero-XAH,Vero-XAJN,Vero-XAM细胞的两剂量水平均不呈现克隆生长，说明不具有抛锚独立性生长特性.
2.2 猫肾细胞(F81)系 本实验对F81-XAJU；F81-XAK；F81-XAM等3种不同地方引入的猫肾细胞(F81)系，进行各代次的软琼脂实验，表明F81-XAJU,F81-XAK,F81-XAM细胞的两剂量水平均不呈现克隆生长，说明这种细胞均不具有抛锚独立性生长特性.
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2.3 犬肾细胞(MDCK)系 本实验对MDCK-XAYE；MDCK-XAYU；MDCK-XAJN；MDCK-XAJA；MDCK-XAM等5种不同地方引入的犬肾细胞(MDCK)系，进行各代次的软琼脂实验，结果表明MDCK-XAYE,MDCK-XAYU；MDCK-XAJN,MDCK-XAJA和MDCK-XAM细胞的两剂量水平均呈现较低的克隆生长(P<0.01)，说明五种细胞均具有较低的抛锚独立性生长特性.
2.4 金黄地鼠肾细胞(BHK21)系 本实验对BHK21-XAYU；BHK21-XAM等两种不同地方引入的金黄地鼠肾细胞(BHK21)系，进行各代次的软琼脂实验，结果表明BHK21-XAYU,BHK21-XAM细胞的两剂量水平有显著的克隆生长(P<0.01)，说明均具有抛锚独立性生长特性.
3 讨论
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由正常细胞演变为恶变性转化细胞是一个多阶段综合性过程，在此过程中恶变性细胞逐渐获得了与正常细胞不同的新的生物学特性，据此，可以判断该细胞是否具有致瘤性[3,4]. 这些新的生物学特征包括细胞染色体的数目和结构的改变，具有抛锚独立性生长能力(在软琼脂中能够形成克隆)和在适当的宿主体内形成肿瘤等表现，而后两个指标具有良好的平行关系，是衡量细胞是否发生恶性转化的重要标志.
我们通过两种剂量的软琼脂克隆实验，说明软琼脂克隆的发生率和重复率是可信的. 同时，通过与裸鼠致瘤实验相对比后可以看出，软琼脂克隆实验和裸鼠致瘤实验的结果一致，这表明：①非洲绿猴肾细胞(Vero)系中的Vero-XAJU，Vero-XAK等细胞传至90代时，仍然具有旺盛的连续性增殖能力，在低血清培养基中能够生长，接种软琼脂培养基上能够形成克隆，说明这些细胞具有致瘤性，不适于制苗. 而Vero-XAYU，Vero-XAYE，Vero-XAH，Vero-XAJN和Vero-XAM等五种细胞接种软琼脂培养基上不能形成克隆，接种于无胸腺裸鼠不能在皮下形成肿瘤. 表明此七种细胞不具有致瘤性. 所以选择此四种细胞用于生产制苗是可行的. ②猫肾细胞(F81)系中的F81-XAJU，F81-XAK和F81-XAM等四种细胞接种软琼脂培养基上不能形成克隆，证明此四种细胞不具有致瘤性. 所以选择此四种细胞用于生产制苗是可行的. ③犬肾细胞(MDCK)系中的MDCK-XAYE，MDCK-XAYU，MDCK-XAJN，MDCK-XAJA和MDCK-XAM等五种细胞接种软琼脂培养基上形成的克隆较低，表明此五种细胞致瘤性较低. 所以可以用MDCK进行生产疫苗. ④金黄地鼠肾细胞(BHK21)系中的BHK21-XAYU和BHK21-XAM两种细胞传至90代，仍然具有旺盛的连续性增殖能力，在低血清培养基中能够生长，接种软琼脂培养基上能够形成克隆，表明这些细胞具有致瘤性，不适于制苗.
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基金项目：国家火炬计划[火炬发(1997)109号]
作者简介：李六金(1951-)，男(汉族)，陕西省合阳县人.硕士，副教授. Tel.(029)2513031 Email.liujin@fmmu.edu.cn
赵世君(第四军医大学实验动物研究中心, 陕西 西安 710033)
押宗保(第四军医大学实验动物研究中心, 陕西 西安 710033)
参考文献:
[1] 殷 震,刘景华. 动物病毒学[M].北京：科学出版社，1997：467.
[2] 王明俊. 兽医生物制品学[M]. 北京：中国农业出版社，1998：512.
[3] 王衡文. 实验肿瘤学基础[M]. 北京：人民卫生出版社，1992：310.
[4] 汪希明. 肿瘤生物学[M]. 杭州：浙江科技出版社，1990：213.
收稿日期：1999-12-01
修回日期：2000-03-01, 百拇医药
单位：李六金(第四军医大学实验动物研究中心, 陕西 西安 710033)；李秦(第四军医大学实验动物研究中心, 陕西 西安 710033)；施新猷(第四军医大学实验动物研究中心, 陕西 西安 710033)；张海(第四军医大学实验动物研究中心, 陕西 西安 710033)；张志培(第四军医大学实验动物研究中心, 陕西 西安 710033)；师长宏(第四军医大学实验动物研究中心, 陕西 西安 710033)
关键词：传代细胞系；克隆；克隆率；致瘤性
第四军医大学学报000629 摘要：目的 观察传代细胞在软琼脂中生长情况. 方法 将4种细胞与软琼脂混合均匀，铺于平皿中，置37℃,50～100 mL.L-1 CO2环境中培养. 观察细胞集落形成情况. 结果 本实验室的五株非洲绿猴肾细胞Vero-XAYU，Vero-XAYE，Vero-XAH，Vero-XAJN和Vero-XAM，三株猫肾细胞F81-XAJU，F81-XAM和F81-XAK不呈现致瘤性独立抛锚生长；犬肾细胞MDCK-XAYE，MDCK-XAYU，MDCK-XAJN，MDCK-XAJA和MDCK-XAM五株则呈现较低的致瘤性独立抛锚生长；两株金黄地鼠肾细胞BHK21-XAYU和BHK21-XAM及两株非洲绿猴肾细胞Vero-XAYU和Vero-XAK则呈现较高的致瘤性独立抛锚生长.
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中图号：Q253 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0736-02
Anchoring ability of 4 passage cells strain in soft-agar
LI Liu-Jin LI Qin SHI Xin-You ZHANG Hai ZHANG Zhi-Pei SHI Chang-Hong ZHAO Shi-Jun YA Zong-Bao
(Laboratory Animal Research Center， Fourth Military Medical University,Xi'an, 710033,China)
Abstract:AIM To observe the growth of passage cells in soft-agar. METHODS Four kinds of passage cells were blended with soft-agar and cultured at 37℃, 5%～10% CO2 atmosphere and then the clone forming was observed. RESULTS Of the five strains of Vero-XAYU, Vero-XAYE, Vero-XAH, Vero-XAJN and Vero-XAM in our laboratory, 3 strains of F81-XAJU, F81-XAM,and F81-XAK grew anchor-free without carcinogenesis, but 5 strains of MDCK-XAYE,MDCK-XAYU,MDCK-XAJN,MDCK-XAJA,and MDCK-XAM grew anchor-free with lower-carcinogenesis; 2 strains of BHK21-XAYu,BHK21-XAM and another 2 strains of Vero-XAYU,Vero-XAK demonstrated an anchor-free growth with high carcinogenesis.
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Keyword:passage cell line; clone; clone ratio; carcinogenesis
0 引言
世界各国对兽医生物制品的制备型生产细胞、种毒质量及制备疫苗所涉及的试剂都非常重视，不仅制定有严格的制造法规、检验规程(法规)和质量标准(如药典规程等)，而且对制品的生产、推广和使用也颁布了严格的管理制度. 本实验结果客观地初步筛选出适合用于犬四联活疫苗制备的细胞.
1 材料和方法
1.1 材料 MEM-EAGLE(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青公司)；软琼脂(上海生物化学公司日本进口分装)；细胞Vero,MDCK,BHK21,F81由本中心冻存、提供.
1.2 方法 按照《中国兽药生产销售质量检验规程》关于软琼脂抛锚实验[1,2]的有关规定进行.
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2 结果
2.1 非洲绿猴肾细胞(Vero)系 本实验对Vero-XAJU;Vero-XAK;Vero-XAYU;Vero-XAYE;Vero-XAH;Vero-XAJN;Vero-XAM等7种不同地方引入的非洲绿猴肾细胞(Vero)系，进行各代次的软琼脂实验，表明Vero-XAJU和Vero-XAK细胞的两剂量水平有显著的克隆生长(P<0.01)，说明具有抛锚独立性生长这一特性. Vero-XAYU,Vero-XAYE,Vero-XAH,Vero-XAJN,Vero-XAM细胞的两剂量水平均不呈现克隆生长，说明不具有抛锚独立性生长特性.
2.2 猫肾细胞(F81)系 本实验对F81-XAJU；F81-XAK；F81-XAM等3种不同地方引入的猫肾细胞(F81)系，进行各代次的软琼脂实验，表明F81-XAJU,F81-XAK,F81-XAM细胞的两剂量水平均不呈现克隆生长，说明这种细胞均不具有抛锚独立性生长特性.
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2.3 犬肾细胞(MDCK)系 本实验对MDCK-XAYE；MDCK-XAYU；MDCK-XAJN；MDCK-XAJA；MDCK-XAM等5种不同地方引入的犬肾细胞(MDCK)系，进行各代次的软琼脂实验，结果表明MDCK-XAYE,MDCK-XAYU；MDCK-XAJN,MDCK-XAJA和MDCK-XAM细胞的两剂量水平均呈现较低的克隆生长(P<0.01)，说明五种细胞均具有较低的抛锚独立性生长特性.
2.4 金黄地鼠肾细胞(BHK21)系 本实验对BHK21-XAYU；BHK21-XAM等两种不同地方引入的金黄地鼠肾细胞(BHK21)系，进行各代次的软琼脂实验，结果表明BHK21-XAYU,BHK21-XAM细胞的两剂量水平有显著的克隆生长(P<0.01)，说明均具有抛锚独立性生长特性.
3 讨论
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由正常细胞演变为恶变性转化细胞是一个多阶段综合性过程，在此过程中恶变性细胞逐渐获得了与正常细胞不同的新的生物学特性，据此，可以判断该细胞是否具有致瘤性[3,4]. 这些新的生物学特征包括细胞染色体的数目和结构的改变，具有抛锚独立性生长能力(在软琼脂中能够形成克隆)和在适当的宿主体内形成肿瘤等表现，而后两个指标具有良好的平行关系，是衡量细胞是否发生恶性转化的重要标志.
我们通过两种剂量的软琼脂克隆实验，说明软琼脂克隆的发生率和重复率是可信的. 同时，通过与裸鼠致瘤实验相对比后可以看出，软琼脂克隆实验和裸鼠致瘤实验的结果一致，这表明：①非洲绿猴肾细胞(Vero)系中的Vero-XAJU，Vero-XAK等细胞传至90代时，仍然具有旺盛的连续性增殖能力，在低血清培养基中能够生长，接种软琼脂培养基上能够形成克隆，说明这些细胞具有致瘤性，不适于制苗. 而Vero-XAYU，Vero-XAYE，Vero-XAH，Vero-XAJN和Vero-XAM等五种细胞接种软琼脂培养基上不能形成克隆，接种于无胸腺裸鼠不能在皮下形成肿瘤. 表明此七种细胞不具有致瘤性. 所以选择此四种细胞用于生产制苗是可行的. ②猫肾细胞(F81)系中的F81-XAJU，F81-XAK和F81-XAM等四种细胞接种软琼脂培养基上不能形成克隆，证明此四种细胞不具有致瘤性. 所以选择此四种细胞用于生产制苗是可行的. ③犬肾细胞(MDCK)系中的MDCK-XAYE，MDCK-XAYU，MDCK-XAJN，MDCK-XAJA和MDCK-XAM等五种细胞接种软琼脂培养基上形成的克隆较低，表明此五种细胞致瘤性较低. 所以可以用MDCK进行生产疫苗. ④金黄地鼠肾细胞(BHK21)系中的BHK21-XAYU和BHK21-XAM两种细胞传至90代，仍然具有旺盛的连续性增殖能力，在低血清培养基中能够生长，接种软琼脂培养基上能够形成克隆，表明这些细胞具有致瘤性，不适于制苗.
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基金项目：国家火炬计划[火炬发(1997)109号]
作者简介：李六金(1951-)，男(汉族)，陕西省合阳县人.硕士，副教授. Tel.(029)2513031 Email.liujin@fmmu.edu.cn
赵世君(第四军医大学实验动物研究中心, 陕西 西安 710033)
押宗保(第四军医大学实验动物研究中心, 陕西 西安 710033)
参考文献:
[1] 殷 震,刘景华. 动物病毒学[M].北京：科学出版社，1997：467.
[2] 王明俊. 兽医生物制品学[M]. 北京：中国农业出版社，1998：512.
[3] 王衡文. 实验肿瘤学基础[M]. 北京：人民卫生出版社，1992：310.
[4] 汪希明. 肿瘤生物学[M]. 杭州：浙江科技出版社，1990：213.
收稿日期：1999-12-01
修回日期：2000-03-01, 百拇医药