犬瘟热病毒流行株的驯化与鉴定
作者：李六金 金昌德 李秦 施新猷 张海 师长宏 张志培
单位：李六金(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；金昌德(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；李秦(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；施新猷(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；张海(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；师长宏(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；张志培(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)
关键词：犬瘟热流行株；病毒；驯化；鉴定
第四军医大学学报000625 摘要：目的 驯化并鉴定犬瘟热病毒疫苗候选毒株. 方法 犬瘟热流行毒株经鸡胚绒毛尿囊膜→MA104→Vero→MDCK→MA104上依次连续传112代，传代过程中进行蚀斑克隆、扩增以及每代TCID50效价测定. 驯化获得1株弱毒株(简称CDV-XN112)，然后进行电镜观察及抗原性、遗传稳定性、神经毒力等试验. 结果 分离到的犬瘟热流行毒株，驯化到90代时失去对犬的致病性，TOID50效价达10-5.5.mL-1，电镜负染观察可见此毒株具有较典型的犬瘟热形态结构；免疫电镜观察发现CDV-XN112的兔抗IgG与国际标准毒株Onder stepoot病毒粒子有清晰可见的桥连支架. 其病毒的中和抗体效价(SN)达512. CDV-XN112和SH-CDV以及onder stepoot-CDV等3种毒株之间均有程度不同的交叉中和现象. 在MA104细胞传代过程中未发现返祖现象. 结论 CDV-XN112毒株为弱毒疫苗候选毒株.
, 百拇医药
中图号:S852.653 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0725-03
Domestication and identification of canine distemper virus epidemic strain
LI Liu-Jin JIN Chang-De LI Qin SHI Xin-You ZHANG Hai SHI Chang-Hong ZHANG Zhi-Pei
(Laboratory Animal Research Center，Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,China)
Abstract:AIM To domesticate and identify canine distemper virus as a candidate for vaccine strain. METHOD The epidemic attenuate canine distemper virus was passage 110(times)according to the following process: Via Chick chorioallantoic membrane to MA104 cells→Vero cells→MDCK cells, then to MA104 cells, during which the attenuate strain was cloned and the TCID50 was assayed titer in every passage. The obtained attenuate stra+in(named CDV-XN112)was observed under the electron microscope and tested with the immunogenicity, heredity vaccinating quantity of the virus culture-temperature, vaccinating method and revolving-velocity of culturing cells with rotation-ball. RESULTS The isolated epidemic attenuate strain of vaccine distemper virus lost its pathogenicity to dogs after being domesticated to 90 passages, and the TCID50 titer was 10-5.5. mL-1. The toxic-strain by negative-staining had the typical structure of canine distemper virus under electron microscope and there was a clear bridge-link frame between the rabbit anti-CDV-XN112 IgG and virus of Onder Stepoot. Its SN could reach 512.Among CDV-XN112, SH-CDV and OnderStepoot-CDV, there existed,to some different extent, cross-neutralizations. During passage of MA104,no reversion was found. CONCLUSION CDV-XN112 Strain could be a candidate for attenuate vaccine strain.
, 百拇医药
Keywords:canine distemper virus epidemic strain; domestication; identification
0 引言
犬瘟热是危害犬、狐、鼬科动物最严重的烈性传染病之一. 临床上常出现高热、眼结膜炎、皮肤湿疹或后期出现中枢神经性脑炎症状. 国外近十多年来，一直延用以鸡胚成纤维细胞—Vero细胞交替驯化的减毒方式来筛选种毒[1]，各国陆续研制成功源于本国的弱毒株，并取得了一定的控制本病蔓延的效果. 但国外疫苗价格昂贵，而国内生产的疫苗效价不稳定. 因此，我们对来自西安地区的犬瘟热流行毒株进行驯化，并鉴定其特性，获得符合我国犬群的制苗用犬瘟热弱毒株.
1 材料和方法
1.1 材料
, http://www.100md.com 1.1.1 病毒 犬瘟热流行毒株系由西安地区一病犬脏器分离获得. 其TCID50值为10-3.0.mL-1；Onder stepoot株和SH-CDV毒株从美国Fort Dodge 公司购进，已在Vero 细胞传80代，鸡胚成纤维细胞(CEF)上传40代. 其TCID50值为10-3.0.mL-1.
1.1.2 免疫血清 Onder stepoot-CDV,SH-CDV免疫血清从美国Fort Dodge 公司购进，CDV-XN112的兔抗免疫血清由本实验室制备.
1.1.3 细胞 MDCK,MA-104,Vero细胞，从美国ATCC引进，本中心保存和提供. 鸡胚成纤维细胞(CEF)由本中心实验室提供.
1.1.4 实验动物 选用5窝共30条犬，均从非疫区引进，并且未注射过任何疫苗的2 mo龄健康断乳犬. 昆明种乳鼠由本校实验动物中心提供.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 病毒驯化及TCID50的测定 分离获得的CDV流行毒株，经鸡胚绒毛尿囊膜上盲传5代，MA104细胞上连传47代，MDCK细胞上传40代，再于MA104细胞和Vero细胞各传10代. 在传代过程中经3次蚀斑克隆筛选，最后确定以小斑扩增起来的病毒作种毒，标记为CDV-XN112株，在MA104细胞→MDCK细胞→Vero细胞上共计传112代. 在40孔U型塑胶板上测定TCID50 [2].
1.2.2 驯化过程中病毒抗原性测定 收集驯化第50,90,100,110代病毒，分别经iv,im途径接种到犬. 接种后第7,14,21日采血，测定其抗体效价.
1.2.3 电镜观察 收集接毒后7 d的Vero细胞培养液10 mL作为负染样品，按常规方法负染色.
, 百拇医药
1.2.4 免疫电镜 收集接毒后7 d的Vero细胞培养液5 mL，加0.1 mL兔抗CDV高免血清，混匀后在37℃温室中感作60 min,以4000 r.min-1离心15 min,弃上清，取沉淀物，用1滴蒸馏水悬浮，按常规法负染色，电镜观察.
1.2.5 中和试验 用平底微量培养板以固定病毒稀释血清法用Vero细胞测定[2].
1.2.6 交叉中和试验 Onder stepoot-CDV,SH-CDV及CDV-XN1123种病毒之间按固定病毒-稀释血清的方法[2]进行交叉中和实验.
1.2.7 测定病毒神经毒力 选用2～3日龄乳鼠，每只脑内接种病毒悬液(TCID5010-4.5.mL-1) 0.03 mL. 逐日观察是否出现脑炎、麻痹等症状. 观察时间为4～20 d.
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2 结果
2.1 病毒驯化及遗传稳定性 当1～3代CDV毒株在鸡胚绒毛尿囊膜上接种后，对乳鼠的神经毒力由10-1.0增至10-3.0，回归动物由呈双相热变为精神萎顿；当转入MA-104细胞或Vero细胞单层后，其TCID50为10-3.5.mL-1，乳鼠神经毒力为10-4.0，回归动物精神不振，电镜观察病毒颗粒显而易见. 于4～10代进行细胞单层(MA-104)蚀斑克隆后，该毒株TCID50值为10-4.0.mL-1，乳鼠神经毒力为10-3.0 ，回归动物呈一过型现象；随着11～20代的小蚀斑(0.1～0.5 nm)筛选扩增，该株毒株对本动物仍呈轻微减食. 31～50代，回归动物呈一过型暂时精神萎靡状态. 51～80代和81～100代又回转到MDCK细胞，结果发现该毒株TCID50值增强(10-5.0.m-1)，乳鼠毒力仍保持在10-3.0，但在犬体则丧失了致病作用，其TCID50稳定在10-4.5.mL-1，对动物已失去致病性.
, http://www.100md.com
2.2 驯化过程中抗原性测定 CDV-XN112株待传至110代仍有良好的抗原性，不论通过肌肉、静脉或口鼻途径接种，在接种后的第7,14或21日，其最高SN值分别为16,128和512.
2.3 中和试验 5个不同稀释度的血清分别与CDV-XN112病毒作用后，其复合物在Vero细胞单层上均未出现CPE，其中和抗体效价可达1024.
2.4 交叉中和试验 CDV-XN112与国外SH-CDV毒株和Onder stepoort-CDV(os-CDV)株起交叉中和反应，其中和效价为640和320(Tab 1).
表 1 犬瘟热病毒流行株CDV-XN112与国外毒株的交叉中和试验结果
Tab 1 The results of cross-neutralization assay (SN) Virus
, http://www.100md.com
Antibody
CDV-XN112
SH-CDV
os-CDV
CDV-XN112
640
640
320
SH-CDV
320
1280
320
, 百拇医药
Os-CDV
320
640
1280
2.5 电镜观察 在电镜下可见，许多大小不一、形态各异的病毒粒子(Fig 1)，该粒子外层被病毒膜包裹，病毒膜表面附有纤细且排列整齐的纤突，由病毒膜和纤突构成病毒囊膜，囊膜内有螺旋对称的核衣壳，呈无定形盘卷填充其内. 有的由于囊膜破裂，核衣壳溢出，呈绳索样结构.
2.6 免疫电镜观察 在电镜下可见，堆积的病毒粒子，有的粒子已破裂，核衣壳溢出，游离在单个存在的粒子附近(Fig 2)或群聚存在. 即使是单个存在的粒子，在其周围，吸附了大量的抗体分子，导致纤突结构不清，囊膜层增厚现象.
3 讨论
, 百拇医药
3.1 历史回顾 犬瘟热疫苗的研究曾走过4个阶段，即①同源组织脏器甲醛灭活苗；②鸡胚尿囊液甲醛灭活苗；③鸡胚成纤维细胞弱毒疫苗；④Vero细胞弱毒疫苗. 根据弱毒疫苗驯化谱的不同，国外已研制出各自专用于犬、狐、貂等动物的弱毒疫苗，例如国外已驯化出OFE,PSA-IC,Hg94-IC和Onder stpoot株[3,4]. 我们借鉴国外经验，立足本国的流行毒株，采取SPF鸡胚绒毛尿囊膜作初期分离，再于MA-104细胞上连续传代，以后又转至MDCK细胞上传代，至90代该毒株失去了致病性，经在动物体盲传3代未见到返祖现象，随后又将该毒株在Vero细胞上适应增毒，大量的试验数据证明，CDV-XN112株的遗传稳定性可靠，驯化谱清晰，也可考虑将其作为CDV疫苗的候选毒株.
图 1 犬瘟热病毒流行株CDV-XN112粒子
, 百拇医药
Fig 1 CDV -XN112 particle
图 2 犬瘟热病毒流行株CDV-XN112抗原抗体免疫复合物
Fig 2 CDV-XN112 antigen-antibody immunological complex
3.2 犬瘟热的抗原性 试验证明CDV-XN112毒株与国际标准毒株SH-CDV及Onder stepoot-CDV株具有共同抗原性，其交叉中和价为640和320. 在免疫电镜下可见，CDV-XN112的IgG与Onder stepoot-CDV病毒粒子有清晰可见的桥连支架，这进一步证明该毒株的特异性.
, 百拇医药
3.3 犬瘟热的保护性 当CDV流行毒株适应于敏感细胞后，很容易变弱，但要避免返祖，必须在异种动物上连续传代100代以上. 强毒复归动物能否成功，关系到整个犬瘟热研究的进一步深入的问题. 用CDV-XN112毒株50代、90代、100代与110代的制品接种幼犬，各代的中和抗体效价无明显差异，证明在驯化减毒过程中，其抗原性尚未丢失，试验表明该毒株的最小免疫剂量为0.4×103 TCID50，其血清抗体值保护值介于80～160之间.
3.4 结论 CDV-XN112毒株系源于我国流行毒株的成员，经多年驯化，符合中国国情，针对性强，安全、稳定. 说明成功地驯化出CDV-XN112毒株.
基金项目：国家火炬计划[火炬发(1997)109号]
作者简介：李六金(1951-)，男(汉族)，陕西省合阳县人.硕士，副教授. Tel.(029)2513031 Email.liujin@fmmu.edu.cn
, 百拇医药
参考文献:
[1] Visser IK, Kumarev VP, Orvell C et al. Comparison of two morbilliviruses isolated from seals during outbreaks of distemper in north west Europe and Siberia[J]. Arch Virol, 1990; 111(3-4): 149-164.
[2] 殷 震，刘景华. 动物病毒学[M]. 第2版. 北京：科学出版社，1988：204-437.
[3] Curran MD, O'Loan D, Rima-BK et al. Nucleotide sequence analysis of phocine distemper virus reveals its distinctness from canine distemper virus[J]. Vet Rec, 1990; 127(17): 430-431.
[4] Siegel C, Johnson S, Adair S. Isolation of measles virus in primary rhesus monkey cells from a child with acute interstitial pneumonia who cytologically had giant-cell pneumonia without a rash[J]. Am J Clin Pathol, 1990; 94(4): 464-469.
收稿日期：2000-01-01
修回日期：2000-02-28, http://www.100md.com
单位：李六金(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；金昌德(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；李秦(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；施新猷(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；张海(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；师长宏(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；张志培(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)
关键词：犬瘟热流行株；病毒；驯化；鉴定
第四军医大学学报000625 摘要：目的 驯化并鉴定犬瘟热病毒疫苗候选毒株. 方法 犬瘟热流行毒株经鸡胚绒毛尿囊膜→MA104→Vero→MDCK→MA104上依次连续传112代，传代过程中进行蚀斑克隆、扩增以及每代TCID50效价测定. 驯化获得1株弱毒株(简称CDV-XN112)，然后进行电镜观察及抗原性、遗传稳定性、神经毒力等试验. 结果 分离到的犬瘟热流行毒株，驯化到90代时失去对犬的致病性，TOID50效价达10-5.5.mL-1，电镜负染观察可见此毒株具有较典型的犬瘟热形态结构；免疫电镜观察发现CDV-XN112的兔抗IgG与国际标准毒株Onder stepoot病毒粒子有清晰可见的桥连支架. 其病毒的中和抗体效价(SN)达512. CDV-XN112和SH-CDV以及onder stepoot-CDV等3种毒株之间均有程度不同的交叉中和现象. 在MA104细胞传代过程中未发现返祖现象. 结论 CDV-XN112毒株为弱毒疫苗候选毒株.
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中图号:S852.653 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0725-03
Domestication and identification of canine distemper virus epidemic strain
LI Liu-Jin JIN Chang-De LI Qin SHI Xin-You ZHANG Hai SHI Chang-Hong ZHANG Zhi-Pei
(Laboratory Animal Research Center，Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,China)
Abstract:AIM To domesticate and identify canine distemper virus as a candidate for vaccine strain. METHOD The epidemic attenuate canine distemper virus was passage 110(times)according to the following process: Via Chick chorioallantoic membrane to MA104 cells→Vero cells→MDCK cells, then to MA104 cells, during which the attenuate strain was cloned and the TCID50 was assayed titer in every passage. The obtained attenuate stra+in(named CDV-XN112)was observed under the electron microscope and tested with the immunogenicity, heredity vaccinating quantity of the virus culture-temperature, vaccinating method and revolving-velocity of culturing cells with rotation-ball. RESULTS The isolated epidemic attenuate strain of vaccine distemper virus lost its pathogenicity to dogs after being domesticated to 90 passages, and the TCID50 titer was 10-5.5. mL-1. The toxic-strain by negative-staining had the typical structure of canine distemper virus under electron microscope and there was a clear bridge-link frame between the rabbit anti-CDV-XN112 IgG and virus of Onder Stepoot. Its SN could reach 512.Among CDV-XN112, SH-CDV and OnderStepoot-CDV, there existed,to some different extent, cross-neutralizations. During passage of MA104,no reversion was found. CONCLUSION CDV-XN112 Strain could be a candidate for attenuate vaccine strain.
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Keywords:canine distemper virus epidemic strain; domestication; identification
0 引言
犬瘟热是危害犬、狐、鼬科动物最严重的烈性传染病之一. 临床上常出现高热、眼结膜炎、皮肤湿疹或后期出现中枢神经性脑炎症状. 国外近十多年来，一直延用以鸡胚成纤维细胞—Vero细胞交替驯化的减毒方式来筛选种毒[1]，各国陆续研制成功源于本国的弱毒株，并取得了一定的控制本病蔓延的效果. 但国外疫苗价格昂贵，而国内生产的疫苗效价不稳定. 因此，我们对来自西安地区的犬瘟热流行毒株进行驯化，并鉴定其特性，获得符合我国犬群的制苗用犬瘟热弱毒株.
1 材料和方法
1.1 材料
, http://www.100md.com 1.1.1 病毒 犬瘟热流行毒株系由西安地区一病犬脏器分离获得. 其TCID50值为10-3.0.mL-1；Onder stepoot株和SH-CDV毒株从美国Fort Dodge 公司购进，已在Vero 细胞传80代，鸡胚成纤维细胞(CEF)上传40代. 其TCID50值为10-3.0.mL-1.
1.1.2 免疫血清 Onder stepoot-CDV,SH-CDV免疫血清从美国Fort Dodge 公司购进，CDV-XN112的兔抗免疫血清由本实验室制备.
1.1.3 细胞 MDCK,MA-104,Vero细胞，从美国ATCC引进，本中心保存和提供. 鸡胚成纤维细胞(CEF)由本中心实验室提供.
1.1.4 实验动物 选用5窝共30条犬，均从非疫区引进，并且未注射过任何疫苗的2 mo龄健康断乳犬. 昆明种乳鼠由本校实验动物中心提供.
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1.2 方法
1.2.1 病毒驯化及TCID50的测定 分离获得的CDV流行毒株，经鸡胚绒毛尿囊膜上盲传5代，MA104细胞上连传47代，MDCK细胞上传40代，再于MA104细胞和Vero细胞各传10代. 在传代过程中经3次蚀斑克隆筛选，最后确定以小斑扩增起来的病毒作种毒，标记为CDV-XN112株，在MA104细胞→MDCK细胞→Vero细胞上共计传112代. 在40孔U型塑胶板上测定TCID50 [2].
1.2.2 驯化过程中病毒抗原性测定 收集驯化第50,90,100,110代病毒，分别经iv,im途径接种到犬. 接种后第7,14,21日采血，测定其抗体效价.
1.2.3 电镜观察 收集接毒后7 d的Vero细胞培养液10 mL作为负染样品，按常规方法负染色.
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1.2.4 免疫电镜 收集接毒后7 d的Vero细胞培养液5 mL，加0.1 mL兔抗CDV高免血清，混匀后在37℃温室中感作60 min,以4000 r.min-1离心15 min,弃上清，取沉淀物，用1滴蒸馏水悬浮，按常规法负染色，电镜观察.
1.2.5 中和试验 用平底微量培养板以固定病毒稀释血清法用Vero细胞测定[2].
1.2.6 交叉中和试验 Onder stepoot-CDV,SH-CDV及CDV-XN1123种病毒之间按固定病毒-稀释血清的方法[2]进行交叉中和实验.
1.2.7 测定病毒神经毒力 选用2～3日龄乳鼠，每只脑内接种病毒悬液(TCID5010-4.5.mL-1) 0.03 mL. 逐日观察是否出现脑炎、麻痹等症状. 观察时间为4～20 d.
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2 结果
2.1 病毒驯化及遗传稳定性 当1～3代CDV毒株在鸡胚绒毛尿囊膜上接种后，对乳鼠的神经毒力由10-1.0增至10-3.0，回归动物由呈双相热变为精神萎顿；当转入MA-104细胞或Vero细胞单层后，其TCID50为10-3.5.mL-1，乳鼠神经毒力为10-4.0，回归动物精神不振，电镜观察病毒颗粒显而易见. 于4～10代进行细胞单层(MA-104)蚀斑克隆后，该毒株TCID50值为10-4.0.mL-1，乳鼠神经毒力为10-3.0 ，回归动物呈一过型现象；随着11～20代的小蚀斑(0.1～0.5 nm)筛选扩增，该株毒株对本动物仍呈轻微减食. 31～50代，回归动物呈一过型暂时精神萎靡状态. 51～80代和81～100代又回转到MDCK细胞，结果发现该毒株TCID50值增强(10-5.0.m-1)，乳鼠毒力仍保持在10-3.0，但在犬体则丧失了致病作用，其TCID50稳定在10-4.5.mL-1，对动物已失去致病性.
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2.2 驯化过程中抗原性测定 CDV-XN112株待传至110代仍有良好的抗原性，不论通过肌肉、静脉或口鼻途径接种，在接种后的第7,14或21日，其最高SN值分别为16,128和512.
2.3 中和试验 5个不同稀释度的血清分别与CDV-XN112病毒作用后，其复合物在Vero细胞单层上均未出现CPE，其中和抗体效价可达1024.
2.4 交叉中和试验 CDV-XN112与国外SH-CDV毒株和Onder stepoort-CDV(os-CDV)株起交叉中和反应，其中和效价为640和320(Tab 1).
表 1 犬瘟热病毒流行株CDV-XN112与国外毒株的交叉中和试验结果
Tab 1 The results of cross-neutralization assay (SN) Virus
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Antibody
CDV-XN112
SH-CDV
os-CDV
CDV-XN112
640
640
320
SH-CDV
320
1280
320
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Os-CDV
320
640
1280
2.5 电镜观察 在电镜下可见，许多大小不一、形态各异的病毒粒子(Fig 1)，该粒子外层被病毒膜包裹，病毒膜表面附有纤细且排列整齐的纤突，由病毒膜和纤突构成病毒囊膜，囊膜内有螺旋对称的核衣壳，呈无定形盘卷填充其内. 有的由于囊膜破裂，核衣壳溢出，呈绳索样结构.
2.6 免疫电镜观察 在电镜下可见，堆积的病毒粒子，有的粒子已破裂，核衣壳溢出，游离在单个存在的粒子附近(Fig 2)或群聚存在. 即使是单个存在的粒子，在其周围，吸附了大量的抗体分子，导致纤突结构不清，囊膜层增厚现象.
3 讨论
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3.1 历史回顾 犬瘟热疫苗的研究曾走过4个阶段，即①同源组织脏器甲醛灭活苗；②鸡胚尿囊液甲醛灭活苗；③鸡胚成纤维细胞弱毒疫苗；④Vero细胞弱毒疫苗. 根据弱毒疫苗驯化谱的不同，国外已研制出各自专用于犬、狐、貂等动物的弱毒疫苗，例如国外已驯化出OFE,PSA-IC,Hg94-IC和Onder stpoot株[3,4]. 我们借鉴国外经验，立足本国的流行毒株，采取SPF鸡胚绒毛尿囊膜作初期分离，再于MA-104细胞上连续传代，以后又转至MDCK细胞上传代，至90代该毒株失去了致病性，经在动物体盲传3代未见到返祖现象，随后又将该毒株在Vero细胞上适应增毒，大量的试验数据证明，CDV-XN112株的遗传稳定性可靠，驯化谱清晰，也可考虑将其作为CDV疫苗的候选毒株.
图 1 犬瘟热病毒流行株CDV-XN112粒子
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Fig 1 CDV -XN112 particle
图 2 犬瘟热病毒流行株CDV-XN112抗原抗体免疫复合物
Fig 2 CDV-XN112 antigen-antibody immunological complex
3.2 犬瘟热的抗原性 试验证明CDV-XN112毒株与国际标准毒株SH-CDV及Onder stepoot-CDV株具有共同抗原性，其交叉中和价为640和320. 在免疫电镜下可见，CDV-XN112的IgG与Onder stepoot-CDV病毒粒子有清晰可见的桥连支架，这进一步证明该毒株的特异性.
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3.3 犬瘟热的保护性 当CDV流行毒株适应于敏感细胞后，很容易变弱，但要避免返祖，必须在异种动物上连续传代100代以上. 强毒复归动物能否成功，关系到整个犬瘟热研究的进一步深入的问题. 用CDV-XN112毒株50代、90代、100代与110代的制品接种幼犬，各代的中和抗体效价无明显差异，证明在驯化减毒过程中，其抗原性尚未丢失，试验表明该毒株的最小免疫剂量为0.4×103 TCID50，其血清抗体值保护值介于80～160之间.
3.4 结论 CDV-XN112毒株系源于我国流行毒株的成员，经多年驯化，符合中国国情，针对性强，安全、稳定. 说明成功地驯化出CDV-XN112毒株.
基金项目：国家火炬计划[火炬发(1997)109号]
作者简介：李六金(1951-)，男(汉族)，陕西省合阳县人.硕士，副教授. Tel.(029)2513031 Email.liujin@fmmu.edu.cn
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参考文献:
[1] Visser IK, Kumarev VP, Orvell C et al. Comparison of two morbilliviruses isolated from seals during outbreaks of distemper in north west Europe and Siberia[J]. Arch Virol, 1990; 111(3-4): 149-164.
[2] 殷 震，刘景华. 动物病毒学[M]. 第2版. 北京：科学出版社，1988：204-437.
[3] Curran MD, O'Loan D, Rima-BK et al. Nucleotide sequence analysis of phocine distemper virus reveals its distinctness from canine distemper virus[J]. Vet Rec, 1990; 127(17): 430-431.
[4] Siegel C, Johnson S, Adair S. Isolation of measles virus in primary rhesus monkey cells from a child with acute interstitial pneumonia who cytologically had giant-cell pneumonia without a rash[J]. Am J Clin Pathol, 1990; 94(4): 464-469.
收稿日期：2000-01-01
修回日期：2000-02-28, http://www.100md.com