陕西株庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV )RNA NS3区 cDNA(4248nt～4465nt)的扩增、克隆和序列分析
作者：李如琳 徐德忠 闫永平 张景霞
单位：李如琳(第四军医大学预防医学系流行病学教研室, 陕西 西安 710033)；徐德忠(第四军医大学预防医学系流行病学教研室, 陕西 西安 710033)；闫永平(第四军医大学预防医学系流行病学教研室, 陕西 西安 710033)；张景霞(第四军医大学预防医学系流行病学教研室, 陕西 西安 710033)
关键词：庚型肝炎病毒；聚合酶链反应；克隆；序列排列
第四军医大学学报000612 摘要: 目的 了解陕西株庚型肝炎病毒(HGV，RNA/GBV-C)的核苷酸序列特点. 方法 从陕西省西安市两位非甲、乙、丙、丁、戊型肝炎患者的血清中，应用反转录及套式PCR技术,从血清中提取RNA，经特异性的反转录引物P4反转录成cDNA， 以此为模板分别用P3, P4及P1, P2两对引物进行PCR扩增，扩增到218 bp 的HGV RNA NS3区部分基因，将其克隆入PinPointTM Xal-T载体，挑选阳性克隆并进行了序列分析. 结果 SG2与HGV的核苷酸同源性分别为85.64%与84.48%；与GBV-C的核苷酸同源性为86.21%与84.48%，其二者之间同源性为97.13%；二者与HGV的氨基酸同源性分别为98.28%和93.10%，与GBV-C的氨基酸同源性也为98.28%,93.10%，二者之间的氨基酸同源性达94.83%. 结论 庚型肝炎病毒NS3区核苷酸同源性较高，同义突变率也较高，可能是一个对其生存环境较为适应的病毒.
, 百拇医药
中图号:R512.6 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0685-04
Molecular cloning and sequencing of GBV-C/HGV RNA NS3 region cDNA (4248nt～4465nt) of Shaanxi strains
LI Ru-Lin XU De-Zhong YAN Yong-Ping ZHANG Jing-Xia
(Department of Epidemiology, Faculty of Preventive Medicine, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
, 百拇医药
Abstract:AIM To inquire about the characteristics of Shaanxi strain of HGVRNA. METHODS The NS3 region cDNA (4248nt～4465nt) fragment of HGV with 218 bp was determined by PCR, cloning and sequencing, from two inpatients in Xi'an, who were diagnosed with nonA～E, using reverse transcription polymerase chain reaction. RESULTS Comparing these Shaanxi isolates with other known isolates of HGV and GBV-C, we found that the homology of nucleotides was 85.64% between HGV and SG2 strain; 86.21% between SG2 and GBV-C; 97.13% between SG2 and SG3; 84.48% between SG3 and HGV; 84.48% between SG3 and GBV-C, The result also showed that the homology of amino acid was 98.28% and 93.10%. CONCLUSION HGV is a virus adapted to its surroundings.
, 百拇医药
Keywords:hepatitis G virus; polymerase chain reaction; cloning; sequence alignment
0 引言
庚型肝炎病毒(HGV)是单股正链RNA病毒，基因组全长约9.4 kb,含有单个长开放读码区. 约2900个氨基酸的病毒多蛋白经加工形成E1, E2, NS2, NS3(解旋酶和蛋白酶), NS4(A和B)和NS5(A和B, RNA聚合酶)[1]. 现有资料表明，HGV的感染呈全球性分布，目前已公布的HGV基因组全序列共有11株，但对于已发现的所有HGV分离株是否属于同一个基因型,HGV是否存在着不同的基因型(Genotype)，目前尚存在着一定的争议[2-8]. 因此有必要尽快尽多地得到不同地区不同人群的分离株基因序列，对于深入研究HGV的感染特征，以及对预防和治疗病毒性肝炎等具有重要意义.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 标本来源 血清样品取自两位男性患者，一为32岁, 命名为SG2, 二为51岁，命名为SG3, 均以急性肝炎症状入院，经ELISA检测为非甲、乙、丙、丁、戊型肝炎，HBsAg(-),抗-HBc(-), 抗-HAVIgM(-), HDAg(-),抗-HDIgG(-),抗-HDIgM(-),抗-HEVIgG(-),抗-HCV IgG(-).
1.2 引物 根据国内外发表的GBV-C/HGV RNA的序列，经计算机分析采用较为保守且特异性较强的来自于GBV-C/HGV NS3区(解旋酶区)的两对引物，采用固相亚磷酰胺法由中科院微生物所在ABI公司生产的381A型DNA合成仪上合成. 引物纯化采用FPLC(Pharmacia LKB) MonoQ阴离子交换柱进行.
内侧引物:
, 百拇医药
P1 5′ GGATCCCCTTTTATGGGCATGGC 3′(4248～4270)
P2 5′ ATGGATCCCGGTAGATAGCGC 3′ (4444～4465)
外侧引物:
P3 5′ GACGTTGGTGAGATCCCCTT 3′ (4238～4257)
P4 5′ CGAAGTTTCCTGTGTACCC 3′ (4457～4475)
1.3 主要试剂 逆转录酶SuperscriptⅡ，RNasin， Taq酶及其Buffer， T4DNA连接酶及其Buffer均购自于Promega 公司，RNA酶购自于华美公司，载体PinPointTMXa1-T购自于Promega公司.
, 百拇医药
1.4 HGV RNA的提取、逆转录和PCR扩增 取患者血清200 μL, 参照文献[9]的方法提取HGV RNA，随后加入1 μL特异性的逆转录负向引物P4，在30 μL反应体积中[含50 mmol*L-1 Tris-HCL(pH8.3, 25℃)，75 mmol*L-1 KCl， 3 mmol*L-1MgCl2， 10 mmol*L-1 DTT, 1 mmol*L-1 dNTP, SuperscriptⅡ 1 μL]42℃反应1 h，然后加入特异的PCR正向引物P3 1 μL，在50 μL反应体积中进行PCR反应，94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min，进行35个循环，其中第一个循环变性时间延长5 min，最后一个循环时间延长7 min. 取10 μL PCR产物在15 g*L-1的琼脂糖凝胶电泳鉴定.
, 百拇医药 1.5 PCR产物的克隆及序列分析 将PCR产物用电泳洗脱法回收后，在10 μL反应体积中直接与PinPointTMXa1-T载体进行连接反应，16℃过夜. 取连接液1 μL转化JM109宿主菌，挑选克隆进行PCR鉴定. 挑出的阳性克隆大提质粒后采用双脱氧末端终止法双链直接测序.
2 结果
2.1 PCR产物的扩增 经两轮PCR扩增后，取10 μL产物在15 g*L-1的琼脂糖凝胶电泳，可见有一条与预期大小(218 bp)相符的DNA条带.
2.2 PCR产物的回收 PCR产物回收后取2 μL在15 g*L-1的琼脂糖凝胶电泳，经初步定量为100 ng*μL-1.
2.3 阳性克隆的PCR鉴定 2#样品挑选10个克隆经PCR鉴定后，结果有8个呈阳性. 3#样品挑选8个克隆经PCR鉴定后，结果有6个呈阳性. 各取一个阳性克隆分别命名为SG2,SG3株. 2.4 陕西株HGV NS3区cDNA(4246nt-4465nt)阳性克隆的序列分析
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图 1 陕西株HGV cDNA(4248nt～4465nt)与HGV[1], GBV-C[10], CHT1, CHT2[11]的核苷酸序列比较
Fig 1 Comparison of partial nucleotide sequence between two Shaanxi strains HGVcDNA(4248nt～4465nt) and HGV[1], GBV-C[10], CHT1 and CHT2[11] Accession numbers of SG2 and SG3: BankIt 198244 AF067842; BankIt 197295 AF067843
核苷酸同源性的比较(Fig 1)，SG2 VS HGV为85.64%, SG2 VS GBV-C为86.21%, SG3 VS HGV为84.48%, SG3 VS GBV-C为84.48%， 而SG2 VS SG3为97.13%; 氨基酸同源性的比较(Fig 2)，SG2 VS HGV为98.28%, SG2 VS GBV-C为98.28%, SG3 VS HGV为93.10%, SG3 VS GBV-C为93.10%，SG2 VS SG3达94.83%. SG2株与汪太兴等[11]分离到的CHT1株的核苷酸同源性达到了90.80%, SG3与CHT1的同源性达到了87.93%; SG2与CHT2的同源性达到了89.66%，SG3与CHT2的同源性达到了88.51%, CHT1与CHT2之间的同源性达到了97.13%. 如Tab 1所示，SG2株相对于HGV的氨基酸同义突变率为92.00%，相对于GBV-C的同义突变率为95.65%；SG3株相对于HGV的氨基酸同义突变率为81.48%，相对于GBV-C的同义突变率为83.32%.
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图 2 陕西株(SG2，SG3)与其他各株的氨基酸序列比较
Fig 2 Comparision of partial amino acid sequence between two Shaanxi strains HGVcDNA(4248nt～4465nt) and other strains
表 1 陕西株庚型肝炎病毒SG2株、SG3株与HGV,GBV-C相比的同义突变情况
Tab 1 Samesense mutation between Shaanxi SG2 strain, SG3 strain and HGV, GBV-C
HGV
GBV-C
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Strain
NT mutation
AA
Samesense
mutation AA
Samesense mutation
rate(%)
NT mutation
AA
Samesense
mutation AA
Samesense mutation
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rate(%)
SG2
25
23
92.00
23
22
95.65
SG3
27
22
81.48
24
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20
83.32
3 讨论
对目前已公布的HGV基因组共11株全序列所进行的分析表明，世界各地的HGV序列同源性很高，来自健康献血员的序列与来自患者的序列也无显著差异，王海林等[2，3]认为目前所发现的所有分离株均属于同一基因型. 而日本的Mukaide等[6]则认为存在着不同的基因型. 关于这一问题目前尚存在着一定的争论. 但从以上结果我们可以看到相对于与HGV 和GBV-C的核苷酸同源性85%左右相比，SG2与SG3的同源性达到了97.13%,同时我们看到由汪太兴等[11]分离到的两株CHT1与CHT2的核苷酸同源性也高达97.13%，而SG2, SG3与CHT1, CHT2 的同源性达到87.93%～90.80%,也大于它们与HGV,GBV-C的同源性(84.48%～86.21%)，因而我们认为来自于同一地理区域的分离株往往同源性较高. 这一点与王海林等[2，3]的研究结果较为一致. 另一方面，结果也提示，SG2株, SG3株与CHT1, CHT2两株也存在着一定的核苷酸差异，表明了国内各省区之间病毒株的变异. 通过对核苷酸突变和氨基酸同义突变情况的分析来看，相对于HGV来说，SG2株和SG3株的同义突变率分别达到了92.00%和81.48%，而相对GBV-C来说，SG2株和SG3株的同义突变率分别达到了95.65%和83.33%，同义突变率均在80%以上，且分布比较均匀. 同时这也说明，HGV 与HCV的进化史不同，恰恰相反，HGV进化过程中所受到的对非同义突变的选择很弱. 可能是由于HGV RNA基因组的内在多变性受到了其病毒蛋白功能的制约. 同时我们从SG2, SG3与HGV, GBV-C的较高的氨基酸同源性(98.28%,93.10%)可以看出，尽管HGV/GBV-C与HCV被非正式地列入黄病毒科，但是HGV基因组的变异率要比HCV低得多，其蛋白序列更为保守，它很可能是一种对其生活环境(即人体)更为适应的病毒. 从以上结果可以看出，HGV/GBV-C NS3区基因在不同株之间同源性较高，比较保守，适合于RT-PCR检测. 有关GBV-C/HGV的许多问题尚待探索，本文报道的陕西株部分HGV/GBV-C的核苷酸序列分析，将对今后HGV/GBV-C的分子生物学研究以及诊断试剂和疫苗的研制具有一定意义.
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作者简介：李如琳(1969-)，男(汉族)，河南省洛阳市人. 硕士. Tel. (029)3374871 Email.junliu@fmmu.edu.cn
参考文献:
[1] Linnen J, Wagges J, Zhang-Keck ZY et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:A transfusion-transmissible agent[J]. Science, 1996; 271(2):505-508.
[2] Wang HL, Jin DY. Prevalence and genotype of hepatitis G virus in Chinese professional blood donors and hepatitis patients[J]. J Inf Dis, 1997;175(16):1229-1232.
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[3] Wang HL,Hou YD,Identification of a single genetype of hepatitis G virus by comparison of one complete genome from healthy carrier with eight from patients with hepatitis[J]. J Gen Virol,1997;78(11):in press
[4] Okamoto H, Nakao H, Inoue T et al. The entire nucleotide sequences of two GB virus c/hepatitis G virus isolates of distinct genotypes from japar[J]. J Gen virol, 1997;78(5):737-739.
[5] Nakao H, Okamoto H, Fukuda M et al. Mutation rate of GB virus c/hepatitis G virus over the entire genome and in sllbgenomic regions[J]. Virology, 1997;233(10):43-46.
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[6] Mukaide M, Mizokami M, Orito E et al. Three diffenent GB virus C/ hepatitis G virus genctypes. phylogenetic analysis and a genotyping assay based on restriction fragment length polymorphism[J]. FEBS Let, 1997;407(5):51.
[7] Muerhoff AS, Smith DB, Leary TP et al. Idntification of GB virus C viriants by phylogenetic analysis of 5′ -untranslated and coding region sequences[J]. J Virol, 1997;71(14):6501-6503.
[8] Khudyakov YE, Cong ME, Bonafonte MT et al. Sequence variation within a nonstructural region of the hepatitis G virus genome[J]. J Virol, 1997;71(12):6875-6878.
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[9] Chomcynski P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phend-chloroform extraction[J]. Anal Biochem, 1987;162(8):156-159.
[10] Simons JN, Leary TP, Dawson GJ et al.Isolation of novel virus-like sequence associated with human hepatitis[J]. Nature Med, 1995;1(6)：564-568.
[11] 汪太兴, 庄 辉, 李河民 et al. 中国株庚型肝炎病毒感染的检测及部分序列测定. 中华微生物和免疫学杂志, 1996;16(4)：263-266.
收稿日期：1999-11-22
修回日期：2000-03-03, http://www.100md.com
单位：李如琳(第四军医大学预防医学系流行病学教研室, 陕西 西安 710033)；徐德忠(第四军医大学预防医学系流行病学教研室, 陕西 西安 710033)；闫永平(第四军医大学预防医学系流行病学教研室, 陕西 西安 710033)；张景霞(第四军医大学预防医学系流行病学教研室, 陕西 西安 710033)
关键词：庚型肝炎病毒；聚合酶链反应；克隆；序列排列
第四军医大学学报000612 摘要: 目的 了解陕西株庚型肝炎病毒(HGV，RNA/GBV-C)的核苷酸序列特点. 方法 从陕西省西安市两位非甲、乙、丙、丁、戊型肝炎患者的血清中，应用反转录及套式PCR技术,从血清中提取RNA，经特异性的反转录引物P4反转录成cDNA， 以此为模板分别用P3, P4及P1, P2两对引物进行PCR扩增，扩增到218 bp 的HGV RNA NS3区部分基因，将其克隆入PinPointTM Xal-T载体，挑选阳性克隆并进行了序列分析. 结果 SG2与HGV的核苷酸同源性分别为85.64%与84.48%；与GBV-C的核苷酸同源性为86.21%与84.48%，其二者之间同源性为97.13%；二者与HGV的氨基酸同源性分别为98.28%和93.10%，与GBV-C的氨基酸同源性也为98.28%,93.10%，二者之间的氨基酸同源性达94.83%. 结论 庚型肝炎病毒NS3区核苷酸同源性较高，同义突变率也较高，可能是一个对其生存环境较为适应的病毒.
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文章编号：1000-2790(2000)06-0685-04
Molecular cloning and sequencing of GBV-C/HGV RNA NS3 region cDNA (4248nt～4465nt) of Shaanxi strains
LI Ru-Lin XU De-Zhong YAN Yong-Ping ZHANG Jing-Xia
(Department of Epidemiology, Faculty of Preventive Medicine, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
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Abstract:AIM To inquire about the characteristics of Shaanxi strain of HGVRNA. METHODS The NS3 region cDNA (4248nt～4465nt) fragment of HGV with 218 bp was determined by PCR, cloning and sequencing, from two inpatients in Xi'an, who were diagnosed with nonA～E, using reverse transcription polymerase chain reaction. RESULTS Comparing these Shaanxi isolates with other known isolates of HGV and GBV-C, we found that the homology of nucleotides was 85.64% between HGV and SG2 strain; 86.21% between SG2 and GBV-C; 97.13% between SG2 and SG3; 84.48% between SG3 and HGV; 84.48% between SG3 and GBV-C, The result also showed that the homology of amino acid was 98.28% and 93.10%. CONCLUSION HGV is a virus adapted to its surroundings.
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Keywords:hepatitis G virus; polymerase chain reaction; cloning; sequence alignment
0 引言
庚型肝炎病毒(HGV)是单股正链RNA病毒，基因组全长约9.4 kb,含有单个长开放读码区. 约2900个氨基酸的病毒多蛋白经加工形成E1, E2, NS2, NS3(解旋酶和蛋白酶), NS4(A和B)和NS5(A和B, RNA聚合酶)[1]. 现有资料表明，HGV的感染呈全球性分布，目前已公布的HGV基因组全序列共有11株，但对于已发现的所有HGV分离株是否属于同一个基因型,HGV是否存在着不同的基因型(Genotype)，目前尚存在着一定的争议[2-8]. 因此有必要尽快尽多地得到不同地区不同人群的分离株基因序列，对于深入研究HGV的感染特征，以及对预防和治疗病毒性肝炎等具有重要意义.
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1 材料和方法
1.1 标本来源 血清样品取自两位男性患者，一为32岁, 命名为SG2, 二为51岁，命名为SG3, 均以急性肝炎症状入院，经ELISA检测为非甲、乙、丙、丁、戊型肝炎，HBsAg(-),抗-HBc(-), 抗-HAVIgM(-), HDAg(-),抗-HDIgG(-),抗-HDIgM(-),抗-HEVIgG(-),抗-HCV IgG(-).
1.2 引物 根据国内外发表的GBV-C/HGV RNA的序列，经计算机分析采用较为保守且特异性较强的来自于GBV-C/HGV NS3区(解旋酶区)的两对引物，采用固相亚磷酰胺法由中科院微生物所在ABI公司生产的381A型DNA合成仪上合成. 引物纯化采用FPLC(Pharmacia LKB) MonoQ阴离子交换柱进行.
内侧引物:
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P1 5′ GGATCCCCTTTTATGGGCATGGC 3′(4248～4270)
P2 5′ ATGGATCCCGGTAGATAGCGC 3′ (4444～4465)
外侧引物:
P3 5′ GACGTTGGTGAGATCCCCTT 3′ (4238～4257)
P4 5′ CGAAGTTTCCTGTGTACCC 3′ (4457～4475)
1.3 主要试剂 逆转录酶SuperscriptⅡ，RNasin， Taq酶及其Buffer， T4DNA连接酶及其Buffer均购自于Promega 公司，RNA酶购自于华美公司，载体PinPointTMXa1-T购自于Promega公司.
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1.4 HGV RNA的提取、逆转录和PCR扩增 取患者血清200 μL, 参照文献[9]的方法提取HGV RNA，随后加入1 μL特异性的逆转录负向引物P4，在30 μL反应体积中[含50 mmol*L-1 Tris-HCL(pH8.3, 25℃)，75 mmol*L-1 KCl， 3 mmol*L-1MgCl2， 10 mmol*L-1 DTT, 1 mmol*L-1 dNTP, SuperscriptⅡ 1 μL]42℃反应1 h，然后加入特异的PCR正向引物P3 1 μL，在50 μL反应体积中进行PCR反应，94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min，进行35个循环，其中第一个循环变性时间延长5 min，最后一个循环时间延长7 min. 取10 μL PCR产物在15 g*L-1的琼脂糖凝胶电泳鉴定.
, 百拇医药 1.5 PCR产物的克隆及序列分析 将PCR产物用电泳洗脱法回收后，在10 μL反应体积中直接与PinPointTMXa1-T载体进行连接反应，16℃过夜. 取连接液1 μL转化JM109宿主菌，挑选克隆进行PCR鉴定. 挑出的阳性克隆大提质粒后采用双脱氧末端终止法双链直接测序.
2 结果
2.1 PCR产物的扩增 经两轮PCR扩增后，取10 μL产物在15 g*L-1的琼脂糖凝胶电泳，可见有一条与预期大小(218 bp)相符的DNA条带.
2.2 PCR产物的回收 PCR产物回收后取2 μL在15 g*L-1的琼脂糖凝胶电泳，经初步定量为100 ng*μL-1.
2.3 阳性克隆的PCR鉴定 2#样品挑选10个克隆经PCR鉴定后，结果有8个呈阳性. 3#样品挑选8个克隆经PCR鉴定后，结果有6个呈阳性. 各取一个阳性克隆分别命名为SG2,SG3株. 2.4 陕西株HGV NS3区cDNA(4246nt-4465nt)阳性克隆的序列分析
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图 1 陕西株HGV cDNA(4248nt～4465nt)与HGV[1], GBV-C[10], CHT1, CHT2[11]的核苷酸序列比较
Fig 1 Comparison of partial nucleotide sequence between two Shaanxi strains HGVcDNA(4248nt～4465nt) and HGV[1], GBV-C[10], CHT1 and CHT2[11] Accession numbers of SG2 and SG3: BankIt 198244 AF067842; BankIt 197295 AF067843
核苷酸同源性的比较(Fig 1)，SG2 VS HGV为85.64%, SG2 VS GBV-C为86.21%, SG3 VS HGV为84.48%, SG3 VS GBV-C为84.48%， 而SG2 VS SG3为97.13%; 氨基酸同源性的比较(Fig 2)，SG2 VS HGV为98.28%, SG2 VS GBV-C为98.28%, SG3 VS HGV为93.10%, SG3 VS GBV-C为93.10%，SG2 VS SG3达94.83%. SG2株与汪太兴等[11]分离到的CHT1株的核苷酸同源性达到了90.80%, SG3与CHT1的同源性达到了87.93%; SG2与CHT2的同源性达到了89.66%，SG3与CHT2的同源性达到了88.51%, CHT1与CHT2之间的同源性达到了97.13%. 如Tab 1所示，SG2株相对于HGV的氨基酸同义突变率为92.00%，相对于GBV-C的同义突变率为95.65%；SG3株相对于HGV的氨基酸同义突变率为81.48%，相对于GBV-C的同义突变率为83.32%.
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图 2 陕西株(SG2，SG3)与其他各株的氨基酸序列比较
Fig 2 Comparision of partial amino acid sequence between two Shaanxi strains HGVcDNA(4248nt～4465nt) and other strains
表 1 陕西株庚型肝炎病毒SG2株、SG3株与HGV,GBV-C相比的同义突变情况
Tab 1 Samesense mutation between Shaanxi SG2 strain, SG3 strain and HGV, GBV-C
HGV
GBV-C
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Strain
NT mutation
AA
Samesense
mutation AA
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rate(%)
NT mutation
AA
Samesense
mutation AA
Samesense mutation
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25
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3 讨论
对目前已公布的HGV基因组共11株全序列所进行的分析表明，世界各地的HGV序列同源性很高，来自健康献血员的序列与来自患者的序列也无显著差异，王海林等[2，3]认为目前所发现的所有分离株均属于同一基因型. 而日本的Mukaide等[6]则认为存在着不同的基因型. 关于这一问题目前尚存在着一定的争论. 但从以上结果我们可以看到相对于与HGV 和GBV-C的核苷酸同源性85%左右相比，SG2与SG3的同源性达到了97.13%,同时我们看到由汪太兴等[11]分离到的两株CHT1与CHT2的核苷酸同源性也高达97.13%，而SG2, SG3与CHT1, CHT2 的同源性达到87.93%～90.80%,也大于它们与HGV,GBV-C的同源性(84.48%～86.21%)，因而我们认为来自于同一地理区域的分离株往往同源性较高. 这一点与王海林等[2，3]的研究结果较为一致. 另一方面，结果也提示，SG2株, SG3株与CHT1, CHT2两株也存在着一定的核苷酸差异，表明了国内各省区之间病毒株的变异. 通过对核苷酸突变和氨基酸同义突变情况的分析来看，相对于HGV来说，SG2株和SG3株的同义突变率分别达到了92.00%和81.48%，而相对GBV-C来说，SG2株和SG3株的同义突变率分别达到了95.65%和83.33%，同义突变率均在80%以上，且分布比较均匀. 同时这也说明，HGV 与HCV的进化史不同，恰恰相反，HGV进化过程中所受到的对非同义突变的选择很弱. 可能是由于HGV RNA基因组的内在多变性受到了其病毒蛋白功能的制约. 同时我们从SG2, SG3与HGV, GBV-C的较高的氨基酸同源性(98.28%,93.10%)可以看出，尽管HGV/GBV-C与HCV被非正式地列入黄病毒科，但是HGV基因组的变异率要比HCV低得多，其蛋白序列更为保守，它很可能是一种对其生活环境(即人体)更为适应的病毒. 从以上结果可以看出，HGV/GBV-C NS3区基因在不同株之间同源性较高，比较保守，适合于RT-PCR检测. 有关GBV-C/HGV的许多问题尚待探索，本文报道的陕西株部分HGV/GBV-C的核苷酸序列分析，将对今后HGV/GBV-C的分子生物学研究以及诊断试剂和疫苗的研制具有一定意义.
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作者简介：李如琳(1969-)，男(汉族)，河南省洛阳市人. 硕士. Tel. (029)3374871 Email.junliu@fmmu.edu.cn
参考文献:
[1] Linnen J, Wagges J, Zhang-Keck ZY et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:A transfusion-transmissible agent[J]. Science, 1996; 271(2):505-508.
[2] Wang HL, Jin DY. Prevalence and genotype of hepatitis G virus in Chinese professional blood donors and hepatitis patients[J]. J Inf Dis, 1997;175(16):1229-1232.
, http://www.100md.com
[3] Wang HL,Hou YD,Identification of a single genetype of hepatitis G virus by comparison of one complete genome from healthy carrier with eight from patients with hepatitis[J]. J Gen Virol,1997;78(11):in press
[4] Okamoto H, Nakao H, Inoue T et al. The entire nucleotide sequences of two GB virus c/hepatitis G virus isolates of distinct genotypes from japar[J]. J Gen virol, 1997;78(5):737-739.
[5] Nakao H, Okamoto H, Fukuda M et al. Mutation rate of GB virus c/hepatitis G virus over the entire genome and in sllbgenomic regions[J]. Virology, 1997;233(10):43-46.
, http://www.100md.com
[6] Mukaide M, Mizokami M, Orito E et al. Three diffenent GB virus C/ hepatitis G virus genctypes. phylogenetic analysis and a genotyping assay based on restriction fragment length polymorphism[J]. FEBS Let, 1997;407(5):51.
[7] Muerhoff AS, Smith DB, Leary TP et al. Idntification of GB virus C viriants by phylogenetic analysis of 5′ -untranslated and coding region sequences[J]. J Virol, 1997;71(14):6501-6503.
[8] Khudyakov YE, Cong ME, Bonafonte MT et al. Sequence variation within a nonstructural region of the hepatitis G virus genome[J]. J Virol, 1997;71(12):6875-6878.
, 百拇医药
[9] Chomcynski P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phend-chloroform extraction[J]. Anal Biochem, 1987;162(8):156-159.
[10] Simons JN, Leary TP, Dawson GJ et al.Isolation of novel virus-like sequence associated with human hepatitis[J]. Nature Med, 1995;1(6)：564-568.
[11] 汪太兴, 庄 辉, 李河民 et al. 中国株庚型肝炎病毒感染的检测及部分序列测定. 中华微生物和免疫学杂志, 1996;16(4)：263-266.
收稿日期：1999-11-22
修回日期：2000-03-03, http://www.100md.com