正常人皮肤成纤维细胞不同培养条件下的生物学特性
作者：韩军涛 陈璧 刘淑娟 汤朝武 苏映军
单位：韩军涛 陈璧 汤朝武 苏映军(第四军医大学西京医院烧伤科)；刘淑娟(第四军医大学西京医院妇产科，陕西 西安 710033)
关键词：成纤维细胞；三维培养；细胞培养
第四军医大学学报001005 摘 要：目的 观察成纤维细胞在不同培养条件下生长，增殖，代谢及蛋白质合成等情况，探讨成纤维细胞的最佳培养模型. 方法 将正常皮肤中的成纤维细胞(NsFb)分离出来并进行原代及继代培养，之后建立不同的成纤维细胞培养系统，分别利用绘制细胞生长曲线，3H-胸腺嘧啶(3H -TdR)掺入及3H-脯氨酸掺入等方法观察细胞的增殖，DNA代谢及胶原合成等情况，研究细胞在不同条件下的生物学特性. 结果 成纤维细胞在单层及纤维蛋白胶中培养时细胞的增殖，代谢及蛋白质合成等生物学功能均明显强于在两种胶原凝胶中培养时的情况.结论 以纤维蛋白胶为支架的三维培养系统能更好地模拟生理条件下创面愈合时成纤维细胞的生物学特性.
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中图号：Q2.271 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1185-04
Biological characteristics of human skin fibroblasts in different culture conditions
HAN Jun-Tao,CHEN Bi,TANG Chao-Wu,SU Ying-Jun
(Department of Burns, Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an 710033,China)
LIU Shu-Juan
(Department of Obstetrics and Gynecology, Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an 710033,China)
, 百拇医药
Abstract:AIM To investigate the optimum culture model of fibroblast，the difference of growth, proliferation, DNA metabolism and protein synthesis of the fibroblasts incubated in varied culture conditions. METHODS The different culture systems were established. The fibroblasts, being isolated from normal human skin samples, were cultivated and the cell growth curves were drawn. Meanwhile,3H-TdR and 3H-proline incorporations were employed to measure the DNA metabolism and collagen synthesis of the cells respectively. RESULTS The biological functions of fibroblasts in both monolayer culture and fibrin lattice demonstrated more active and higher expressing in cell proliferation, DNA metabolism and collagen synthesis than that in the other two collagen lattices. CONCLUSION The fibroblasts in the culture system of the three-dimensional fibrin lattice could be used more effectively to simulate the biological characteristics of the fibroblasts living in the wound in vivo.
, 百拇医药
Keywords:fibroblast; three-dimensional culture;cell culture
0 引言
组织创伤后的愈合过程是一个十分复杂的组织病理修复过程，其中成纤维细胞自始至终均起着关键性的作用. 近年来国内外学者利用细胞培养技术[1-3]，将成纤维细胞从组织中分离出来，并建立了不同的培养系统，为在细胞水平上研究创面愈合提供了一个有利的工具.我们的实验试图通过比较不同条件下成纤维细胞的生物学特性来筛选一种更为理想的培养方法.
1 材料和方法
1.1 材料 DMEM培养基、胰蛋白酶及胃蛋白酶均购自Gibco公司，人纤维蛋白原购自Sigma 公司，小牛血清购自杭州四季青公司，3H-TdR及3H-脯氨酸购自中科院原子能物理研究所，MTT购自华美生物工程公司.
, 百拇医药
1.2 方法 取临床手术中正常皮肤标本，应用组织块法进行培养，用2.5 g*L-1胰蛋白酶进行消化传代，实验用第3～8代处于对数生长期的细胞. ①单细胞悬液的制备：常规制备并调整细胞密度为107*L-1; NsFb-纤维蛋白原混悬液的制备：将单细胞悬液与人纤维蛋白原溶液混合制成细胞-纤维蛋白原混悬液，使两者的终密度分别为108*L-1和2.5 g*L-1. NsFb-胶原混悬液的制备：取鼠尾胶原10 mL，蛋白质含量为0.2 g*L-1，同时制备单细胞悬液并调整密度为5.0×108*L-1，按细胞悬液1V:5×DMEM 2V:11.76 g*L-1 NaHCO3 2V:0.2 g*L-1鼠尾胶原5V的比例，将4种成分混匀，调整pH值至中性，形成成纤维细胞-胶原混悬液. 将以上细胞悬液接种48孔培养板：单层培养组(M)1 mL*孔-1，纤维蛋白胶组(F-gel)100 μL*孔-1，每孔加1 U人凝血酶，胶原凝胶组分为贴附凝胶组(Ca-gel)和漂浮凝胶组(Cf-gel)，均为200 μL*孔-1，37℃，50 mL*L-1 CO2孵箱中孵育2 h后，给立体培养组细胞每孔加入100 mL*L-1小牛血清-DMEM 1 mL，然后将漂浮凝胶组的凝胶块轻轻挑起，使之漂浮于培养基中，继续在孵箱中培养，3 d换液1次. 接种后于不同时间点在倒置显微镜下观察细胞的形态变化，同时分别用四唑盐(MTT)比色法和细胞记数法每天定时观测细胞的增殖情况，连续12 d，根据所得数据绘制细胞生长曲线. ②同上方法接种细胞于48孔板，于接种后24 h吸弃培养基，进行3H-TdR掺入.每孔加入3H-TdR 37 kBq，100 mL*L-1小牛血清-DMEM 1 mL，然后37℃，50 mL*L-1CO2孵箱中孵育12 h，取出后吸弃培养基，单层培养组加入2.5 g*L-1胰酶300 μL*孔-1，其余3组加入10 g*L-1胃蛋白酶及2.5 g*L-1胰酶各150 μL*孔-1，4℃冰箱放置24 h，以多孔收集器收集于纤维滤纸上，烤干后加闪烁液于Beckman 6500 型闪烁仪上测定各孔的cpm值. ③同上方法接种细胞于48孔板，于接种后24 h吸弃培养基，进行3H-脯氨酸掺入.配制β-氨基丙晴100 mg*L-1，L-Vitc 50 mg*L-1，3H-脯氨酸 370 MBq*L-1的混合液，每孔加入100 μL，再每孔加入100 mL*L-1小牛血清-DMEM 900 μL，然后37℃，50 mL*L-1 CO2孵箱中孵育24 h，取出后吸弃培养基，单层培养组加入2.5 g*L-1胰酶300 μL*孔-1，其余3组加入10 g*L-1胃蛋白酶及2.5 g*L-1胰酶各150 μL*孔-1，4℃冰箱放置24 h，同上方法收集并测定各孔的cpm值.
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统计学处理: 实验数据均用
±s表示，并用Origin软件进行Student ttest.
2 结果
2.1 成纤维细胞形态及增殖 倒置显微镜下观察，接种后4 h仅见F-gel组有部分细胞伸展呈星状；接种后24 h，各组细胞均已伸展成梭形，形态无明显区别，均未见增殖；接种后48 h，各组细胞形态良好，增殖不明显，Cf-gel组凝胶块边缘卷曲收缩；接种后3 d，M组和F-gel组已出现较明显的细胞增殖现象，Ca-gel组无明显变化，Cf-gel组凝胶块进一步收缩，无法观察其中的细胞形态. 此后M组和F-gel组细胞增殖加快，Ca-gel组亦出现细胞增殖现象，但较慢，Cf-gel组于接种后5 d凝胶块收缩至直径约3～5 mm，此后未再收缩. 两种细胞计数法和MTT比色法所得生长曲线基本相似，均显示：M组和F-gel组细胞具有典型的细胞增殖现象，F-gel组细胞在后期的增殖略快于M组. Ca-gel组和Cf-gel组细胞增殖不明显，Cf-gel组几乎不存在细胞增殖现象(Fig 1,2).
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图 1 细胞生长曲线(计数法)
Fig 1 Cell growth curves by cell counting
图 2 细胞生长曲线(MTT比色法)
Fig 2 Cell growth curves by MTT assay
2.2 细胞DNA合成 M组和F-gel组均明显高于Ca-gel组和Cf-gel组(P<0.05)，说明成纤维细胞在两种胶原凝胶中的DNA代谢处于一种很低的水平，而在单层培养和纤维蛋白凝胶中则代谢旺盛(Fig 3).
图 3 各组细胞的DNA合成情况
Fig 3 DNA synthesis of fibroblasts
, 百拇医药
bP<0.05 vs M and F-gel.
2.3 细胞胶原合成的测定 与细胞DNA的合成代谢情况相似，M组和F-gel组的胶原合成量均明显高于Ca-gel组和Cf-gel组(P<0.05)，说明成纤维细胞在单层培养和纤维蛋白凝胶条件下胶原的合成十分旺盛，间接地反映出了成纤维细胞的生物学功能(Fig 4).
图 4 各组细胞的胶原合成情况
Fig 4 Collagen synthesis of fibroblasts
bP<0.05 vs M and F-gel.
3 讨论
现代研究表明，创面的愈合过程及后期瘢痕的形成均与组织内成纤维细胞的生物学活动密切相关[4,5]. 随着成纤维细胞体外培养技术的建立和进一步完善，伤口愈合的基础研究已经提高到了一个新的水平. 目前广泛应用并发展较为完善的培养方法是成纤维细胞的单层培养方法，但这种二维培养方法并不适合于研究细胞在体条件下的生物学功能功能，因为在机体组织中，细胞是被细胞外基质包围着的，它们与细胞之间有着密切的联系[6]. 我们知道细胞的形态与其所依附的环境密切相关，而细胞的功能又与其形态相关. 因此国内外学者为能更好地研究成纤维细胞在体条件下的生物学特性，相继建立了一系列不同的成纤维细胞三维培养方法，其中研究最多的是胶原凝胶和纤维蛋白凝胶系统，而这两种方法又因在实验中具体操作的不同分为漂浮凝胶和贴附凝胶. 大量研究表明，细胞外基质的主要成分是胶原，蛋白多糖，氨基聚糖等，因此许多学者认为将成纤维细胞接种在胶原凝胶中，使成纤维细胞处于一个胶原所形成的外环境中，而且成纤维细胞在此系统中通过与胶原纤维的相互作用，可以引起凝胶的收缩，有类似创面愈合过程中伤口收缩的效应[1]，但从另一个角度讲，成纤维细胞在该系统中几乎处于静息状态，即细胞几乎无分裂增殖现象，而且其胶原合成量也处于极低水平. 众所周知,胶原合成是成纤维细胞最重要的功能之一，直接关系到伤口的愈合及后期瘢痕的形成. 那么究竟是纤维结构本身还是这种胶原凝胶环境引起了成纤维细胞的这种改变，国内外学者在这方面做了大量的工作，有研究表明由于人皮肤胶原和鼠尾胶原的抗原性的种属特异性不强，因而均能被成纤维细胞膜表面受体所识别而发生黏附. 当细胞表面的胶原蛋白受体被饱和时，细胞对血清中的生长因子的反应性就会减弱，细胞的增殖就会停滞. 也有研究认为成纤维细胞在不受张力的条件下，其细胞增殖和胶原合成的能力是降低的, 这种情况类似于成纤维细胞在正常生理条件下的表现[2,7]. 但在创面愈合过程中，细胞的增殖，胶原的合成与分泌，细胞外基质的重新形成均是关键性的因素. 鉴于此，有人提出了以纤维蛋白凝胶为支架的成纤维细胞培养模式[2,3]. 纤维蛋白是创面愈合过程中重要的细胞外基质成分之一. 在早期，纤维蛋白和纤维黏连素是引起细胞迁移和黏附的主要因素，同时对成纤维细胞的一系列生物学活动也起着重要的作用. 在体外培养条件下，成纤维细胞在纤维蛋白凝胶中有着活跃的细胞增殖和胶原合成现象，而且通过与纤维蛋白的相互作用可以引起凝胶的收缩,其收缩程度与细胞数，血清浓度，作用时间等多种因素有关. 研究表明，这种收缩可被cytochalasin D所抑制，因此推测可能是细胞的活性骨架结构提供了一个类似机械性外力的作用而使纤维蛋白发生结构重排[8].
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我们通过观测不同条件下成纤维细胞的生物学特性，发现在纤维蛋白胶中细胞伸展得最快，单层培养下次之，在胶原漂浮凝胶中最慢. 完全伸展后，细胞在各种条件下的形态基本相似.说明无论是纤维蛋白胶还是胶原凝胶，其本身对成纤维细胞的形态并没有明显的影响. 此外在单层培养和纤维蛋白胶培养条件下，细胞的功能如DNA的代谢，胶原的合成及细胞的增殖均明显较后两者活跃. 我们认为这除了与细胞在胶原中对外界的生长因子的反应减弱外，还可能是在胶原凝胶中胶原本身是不降解的，因此细胞在其中并没有受到任何来自外界的张力作用. 在纤维蛋白胶中情况则不同，首先不存在细胞表面的胶原蛋白受体被饱和的情况，其次纤维蛋白的逐步降解及快速收缩可能使细胞受到一种被拉伸的作用力，因此细胞在纤维蛋白胶中有着活跃的细胞增殖及胶原合成现象.
综上所述，我们认为成纤维细胞在纤维蛋白胶中有着活跃的生物学特性，而这在胶原凝胶中是不具备的，而且这种活跃的细胞表现与其在创面愈合中的表现相似，因此在研究成纤维细胞在创面愈合中的生物学行为时，以纤维蛋白为支架的三维培养系统较胶原凝胶系统更为科学.
, http://www.100md.com
作者简介：韩军涛(1968-)，男(汉族)，山东省广饶市人.
硕士生(导师陈 璧). Tel.(029)3375297
参考文献:
[1] Moulin V, Castilloux G, Jean A et al.In vitro models to study wound healing fibroblasts[J]. Burns，1996;22(5):359-362.
[2] Gillery P, Bellon G, Constry G et al. Cultures of fibroblasts in fibrin lattices: Models for the study of metabolic activities of cells in physiological conditions[J]. J Cell Physiol，1989;140(2):483-490.
, 百拇医药
[3] Tuan TT, Song A, Chang S et al. In vitro Fibroplasia: matrix contraction, cell growth, and collagen production of fibroblasts cultured in fibrin gels[J]. Exp Cell Res, 1996;223(1):127-134.
[4] Rudolph R. Contraction and the control of contraction[J]. World J Surg, 1980;4(2):279-287.
[5] Diegelmann RF. Cell culture and biochemical aspects of normal and abnormal wound healing: An overview[J]. J Urol，1997;157(2):298-302.
, 百拇医药
[6] Colige AC, Lambert CA, Nusgens BV et al. Effect of cell-cell and cell-matrix interactions on the response of fibroblasts to EGF in vitro[J]. Biochem J，1992; 285(3): 215-221.
[7] Delvoye P, Nusgens B, Lapiere CM. Regulation of metabolism of skin fibroblasts by mechanical tension[J]. J Invest Dermatol， 1987;9(3):332-336.
[8] Tuan TL, Grinnell F. Fibronectin and fibrinolysis are not required for fibrin gel contraction by human skin fibroblasts[J]. J Cell Physiol, 1989;140(4):577-583.
收稿日期:2000-01-05; 修回日期:2000-03-28, 百拇医药
单位：韩军涛 陈璧 汤朝武 苏映军(第四军医大学西京医院烧伤科)；刘淑娟(第四军医大学西京医院妇产科，陕西 西安 710033)
关键词：成纤维细胞；三维培养；细胞培养
第四军医大学学报001005 摘 要：目的 观察成纤维细胞在不同培养条件下生长，增殖，代谢及蛋白质合成等情况，探讨成纤维细胞的最佳培养模型. 方法 将正常皮肤中的成纤维细胞(NsFb)分离出来并进行原代及继代培养，之后建立不同的成纤维细胞培养系统，分别利用绘制细胞生长曲线，3H-胸腺嘧啶(3H -TdR)掺入及3H-脯氨酸掺入等方法观察细胞的增殖，DNA代谢及胶原合成等情况，研究细胞在不同条件下的生物学特性. 结果 成纤维细胞在单层及纤维蛋白胶中培养时细胞的增殖，代谢及蛋白质合成等生物学功能均明显强于在两种胶原凝胶中培养时的情况.结论 以纤维蛋白胶为支架的三维培养系统能更好地模拟生理条件下创面愈合时成纤维细胞的生物学特性.
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中图号：Q2.271 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1185-04
Biological characteristics of human skin fibroblasts in different culture conditions
HAN Jun-Tao,CHEN Bi,TANG Chao-Wu,SU Ying-Jun
(Department of Burns, Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an 710033,China)
LIU Shu-Juan
(Department of Obstetrics and Gynecology, Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an 710033,China)
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Abstract:AIM To investigate the optimum culture model of fibroblast，the difference of growth, proliferation, DNA metabolism and protein synthesis of the fibroblasts incubated in varied culture conditions. METHODS The different culture systems were established. The fibroblasts, being isolated from normal human skin samples, were cultivated and the cell growth curves were drawn. Meanwhile,3H-TdR and 3H-proline incorporations were employed to measure the DNA metabolism and collagen synthesis of the cells respectively. RESULTS The biological functions of fibroblasts in both monolayer culture and fibrin lattice demonstrated more active and higher expressing in cell proliferation, DNA metabolism and collagen synthesis than that in the other two collagen lattices. CONCLUSION The fibroblasts in the culture system of the three-dimensional fibrin lattice could be used more effectively to simulate the biological characteristics of the fibroblasts living in the wound in vivo.
, 百拇医药
Keywords:fibroblast; three-dimensional culture;cell culture
0 引言
组织创伤后的愈合过程是一个十分复杂的组织病理修复过程，其中成纤维细胞自始至终均起着关键性的作用. 近年来国内外学者利用细胞培养技术[1-3]，将成纤维细胞从组织中分离出来，并建立了不同的培养系统，为在细胞水平上研究创面愈合提供了一个有利的工具.我们的实验试图通过比较不同条件下成纤维细胞的生物学特性来筛选一种更为理想的培养方法.
1 材料和方法
1.1 材料 DMEM培养基、胰蛋白酶及胃蛋白酶均购自Gibco公司，人纤维蛋白原购自Sigma 公司，小牛血清购自杭州四季青公司，3H-TdR及3H-脯氨酸购自中科院原子能物理研究所，MTT购自华美生物工程公司.
, 百拇医药
1.2 方法 取临床手术中正常皮肤标本，应用组织块法进行培养，用2.5 g*L-1胰蛋白酶进行消化传代，实验用第3～8代处于对数生长期的细胞. ①单细胞悬液的制备：常规制备并调整细胞密度为107*L-1; NsFb-纤维蛋白原混悬液的制备：将单细胞悬液与人纤维蛋白原溶液混合制成细胞-纤维蛋白原混悬液，使两者的终密度分别为108*L-1和2.5 g*L-1. NsFb-胶原混悬液的制备：取鼠尾胶原10 mL，蛋白质含量为0.2 g*L-1，同时制备单细胞悬液并调整密度为5.0×108*L-1，按细胞悬液1V:5×DMEM 2V:11.76 g*L-1 NaHCO3 2V:0.2 g*L-1鼠尾胶原5V的比例，将4种成分混匀，调整pH值至中性，形成成纤维细胞-胶原混悬液. 将以上细胞悬液接种48孔培养板：单层培养组(M)1 mL*孔-1，纤维蛋白胶组(F-gel)100 μL*孔-1，每孔加1 U人凝血酶，胶原凝胶组分为贴附凝胶组(Ca-gel)和漂浮凝胶组(Cf-gel)，均为200 μL*孔-1，37℃，50 mL*L-1 CO2孵箱中孵育2 h后，给立体培养组细胞每孔加入100 mL*L-1小牛血清-DMEM 1 mL，然后将漂浮凝胶组的凝胶块轻轻挑起，使之漂浮于培养基中，继续在孵箱中培养，3 d换液1次. 接种后于不同时间点在倒置显微镜下观察细胞的形态变化，同时分别用四唑盐(MTT)比色法和细胞记数法每天定时观测细胞的增殖情况，连续12 d，根据所得数据绘制细胞生长曲线. ②同上方法接种细胞于48孔板，于接种后24 h吸弃培养基，进行3H-TdR掺入.每孔加入3H-TdR 37 kBq，100 mL*L-1小牛血清-DMEM 1 mL，然后37℃，50 mL*L-1CO2孵箱中孵育12 h，取出后吸弃培养基，单层培养组加入2.5 g*L-1胰酶300 μL*孔-1，其余3组加入10 g*L-1胃蛋白酶及2.5 g*L-1胰酶各150 μL*孔-1，4℃冰箱放置24 h，以多孔收集器收集于纤维滤纸上，烤干后加闪烁液于Beckman 6500 型闪烁仪上测定各孔的cpm值. ③同上方法接种细胞于48孔板，于接种后24 h吸弃培养基，进行3H-脯氨酸掺入.配制β-氨基丙晴100 mg*L-1，L-Vitc 50 mg*L-1，3H-脯氨酸 370 MBq*L-1的混合液，每孔加入100 μL，再每孔加入100 mL*L-1小牛血清-DMEM 900 μL，然后37℃，50 mL*L-1 CO2孵箱中孵育24 h，取出后吸弃培养基，单层培养组加入2.5 g*L-1胰酶300 μL*孔-1，其余3组加入10 g*L-1胃蛋白酶及2.5 g*L-1胰酶各150 μL*孔-1，4℃冰箱放置24 h，同上方法收集并测定各孔的cpm值.
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统计学处理: 实验数据均用
±s表示，并用Origin软件进行Student ttest.2 结果
2.1 成纤维细胞形态及增殖 倒置显微镜下观察，接种后4 h仅见F-gel组有部分细胞伸展呈星状；接种后24 h，各组细胞均已伸展成梭形，形态无明显区别，均未见增殖；接种后48 h，各组细胞形态良好，增殖不明显，Cf-gel组凝胶块边缘卷曲收缩；接种后3 d，M组和F-gel组已出现较明显的细胞增殖现象，Ca-gel组无明显变化，Cf-gel组凝胶块进一步收缩，无法观察其中的细胞形态. 此后M组和F-gel组细胞增殖加快，Ca-gel组亦出现细胞增殖现象，但较慢，Cf-gel组于接种后5 d凝胶块收缩至直径约3～5 mm，此后未再收缩. 两种细胞计数法和MTT比色法所得生长曲线基本相似，均显示：M组和F-gel组细胞具有典型的细胞增殖现象，F-gel组细胞在后期的增殖略快于M组. Ca-gel组和Cf-gel组细胞增殖不明显，Cf-gel组几乎不存在细胞增殖现象(Fig 1,2).
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图 1 细胞生长曲线(计数法)
Fig 1 Cell growth curves by cell counting
图 2 细胞生长曲线(MTT比色法)
Fig 2 Cell growth curves by MTT assay
2.2 细胞DNA合成 M组和F-gel组均明显高于Ca-gel组和Cf-gel组(P<0.05)，说明成纤维细胞在两种胶原凝胶中的DNA代谢处于一种很低的水平，而在单层培养和纤维蛋白凝胶中则代谢旺盛(Fig 3).
图 3 各组细胞的DNA合成情况
Fig 3 DNA synthesis of fibroblasts
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bP<0.05 vs M and F-gel.
2.3 细胞胶原合成的测定 与细胞DNA的合成代谢情况相似，M组和F-gel组的胶原合成量均明显高于Ca-gel组和Cf-gel组(P<0.05)，说明成纤维细胞在单层培养和纤维蛋白凝胶条件下胶原的合成十分旺盛，间接地反映出了成纤维细胞的生物学功能(Fig 4).
图 4 各组细胞的胶原合成情况
Fig 4 Collagen synthesis of fibroblasts
bP<0.05 vs M and F-gel.
3 讨论
现代研究表明，创面的愈合过程及后期瘢痕的形成均与组织内成纤维细胞的生物学活动密切相关[4,5]. 随着成纤维细胞体外培养技术的建立和进一步完善，伤口愈合的基础研究已经提高到了一个新的水平. 目前广泛应用并发展较为完善的培养方法是成纤维细胞的单层培养方法，但这种二维培养方法并不适合于研究细胞在体条件下的生物学功能功能，因为在机体组织中，细胞是被细胞外基质包围着的，它们与细胞之间有着密切的联系[6]. 我们知道细胞的形态与其所依附的环境密切相关，而细胞的功能又与其形态相关. 因此国内外学者为能更好地研究成纤维细胞在体条件下的生物学特性，相继建立了一系列不同的成纤维细胞三维培养方法，其中研究最多的是胶原凝胶和纤维蛋白凝胶系统，而这两种方法又因在实验中具体操作的不同分为漂浮凝胶和贴附凝胶. 大量研究表明，细胞外基质的主要成分是胶原，蛋白多糖，氨基聚糖等，因此许多学者认为将成纤维细胞接种在胶原凝胶中，使成纤维细胞处于一个胶原所形成的外环境中，而且成纤维细胞在此系统中通过与胶原纤维的相互作用，可以引起凝胶的收缩，有类似创面愈合过程中伤口收缩的效应[1]，但从另一个角度讲，成纤维细胞在该系统中几乎处于静息状态，即细胞几乎无分裂增殖现象，而且其胶原合成量也处于极低水平. 众所周知,胶原合成是成纤维细胞最重要的功能之一，直接关系到伤口的愈合及后期瘢痕的形成. 那么究竟是纤维结构本身还是这种胶原凝胶环境引起了成纤维细胞的这种改变，国内外学者在这方面做了大量的工作，有研究表明由于人皮肤胶原和鼠尾胶原的抗原性的种属特异性不强，因而均能被成纤维细胞膜表面受体所识别而发生黏附. 当细胞表面的胶原蛋白受体被饱和时，细胞对血清中的生长因子的反应性就会减弱，细胞的增殖就会停滞. 也有研究认为成纤维细胞在不受张力的条件下，其细胞增殖和胶原合成的能力是降低的, 这种情况类似于成纤维细胞在正常生理条件下的表现[2,7]. 但在创面愈合过程中，细胞的增殖，胶原的合成与分泌，细胞外基质的重新形成均是关键性的因素. 鉴于此，有人提出了以纤维蛋白凝胶为支架的成纤维细胞培养模式[2,3]. 纤维蛋白是创面愈合过程中重要的细胞外基质成分之一. 在早期，纤维蛋白和纤维黏连素是引起细胞迁移和黏附的主要因素，同时对成纤维细胞的一系列生物学活动也起着重要的作用. 在体外培养条件下，成纤维细胞在纤维蛋白凝胶中有着活跃的细胞增殖和胶原合成现象，而且通过与纤维蛋白的相互作用可以引起凝胶的收缩,其收缩程度与细胞数，血清浓度，作用时间等多种因素有关. 研究表明，这种收缩可被cytochalasin D所抑制，因此推测可能是细胞的活性骨架结构提供了一个类似机械性外力的作用而使纤维蛋白发生结构重排[8].
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我们通过观测不同条件下成纤维细胞的生物学特性，发现在纤维蛋白胶中细胞伸展得最快，单层培养下次之，在胶原漂浮凝胶中最慢. 完全伸展后，细胞在各种条件下的形态基本相似.说明无论是纤维蛋白胶还是胶原凝胶，其本身对成纤维细胞的形态并没有明显的影响. 此外在单层培养和纤维蛋白胶培养条件下，细胞的功能如DNA的代谢，胶原的合成及细胞的增殖均明显较后两者活跃. 我们认为这除了与细胞在胶原中对外界的生长因子的反应减弱外，还可能是在胶原凝胶中胶原本身是不降解的，因此细胞在其中并没有受到任何来自外界的张力作用. 在纤维蛋白胶中情况则不同，首先不存在细胞表面的胶原蛋白受体被饱和的情况，其次纤维蛋白的逐步降解及快速收缩可能使细胞受到一种被拉伸的作用力，因此细胞在纤维蛋白胶中有着活跃的细胞增殖及胶原合成现象.
综上所述，我们认为成纤维细胞在纤维蛋白胶中有着活跃的生物学特性，而这在胶原凝胶中是不具备的，而且这种活跃的细胞表现与其在创面愈合中的表现相似，因此在研究成纤维细胞在创面愈合中的生物学行为时，以纤维蛋白为支架的三维培养系统较胶原凝胶系统更为科学.
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作者简介：韩军涛(1968-)，男(汉族)，山东省广饶市人.
硕士生(导师陈 璧). Tel.(029)3375297
参考文献:
[1] Moulin V, Castilloux G, Jean A et al.In vitro models to study wound healing fibroblasts[J]. Burns，1996;22(5):359-362.
[2] Gillery P, Bellon G, Constry G et al. Cultures of fibroblasts in fibrin lattices: Models for the study of metabolic activities of cells in physiological conditions[J]. J Cell Physiol，1989;140(2):483-490.
, 百拇医药
[3] Tuan TT, Song A, Chang S et al. In vitro Fibroplasia: matrix contraction, cell growth, and collagen production of fibroblasts cultured in fibrin gels[J]. Exp Cell Res, 1996;223(1):127-134.
[4] Rudolph R. Contraction and the control of contraction[J]. World J Surg, 1980;4(2):279-287.
[5] Diegelmann RF. Cell culture and biochemical aspects of normal and abnormal wound healing: An overview[J]. J Urol，1997;157(2):298-302.
, 百拇医药
[6] Colige AC, Lambert CA, Nusgens BV et al. Effect of cell-cell and cell-matrix interactions on the response of fibroblasts to EGF in vitro[J]. Biochem J，1992; 285(3): 215-221.
[7] Delvoye P, Nusgens B, Lapiere CM. Regulation of metabolism of skin fibroblasts by mechanical tension[J]. J Invest Dermatol， 1987;9(3):332-336.
[8] Tuan TL, Grinnell F. Fibronectin and fibrinolysis are not required for fibrin gel contraction by human skin fibroblasts[J]. J Cell Physiol, 1989;140(4):577-583.
收稿日期:2000-01-05; 修回日期:2000-03-28, 百拇医药