口腔颌面部恶性肿瘤患者 CD4＋T 细胞缺陷的初步分析
作者：杨舸 张磊 陈钰 步荣发
单位：解放军总医院口腔科，北京 100853 杨舸 步荣发 解放军总医院基础研究所免疫室 张磊 陈钰
关键词：口腔颌面部恶性肿瘤；T淋巴细胞亚群；超抗原；PHA
军医进修学院学报990412 摘要 目的：初步探讨口腔颌面部恶性肿瘤患者免疫抑制的原因。方法：检测患者外周血淋巴细胞亚群及体外淋巴细胞增殖水平。结果：患者的 CD4+ T细胞数量增多，但对PHA和SEB刺激的反应性均低于正常人。在PHA刺激下，恶性肿瘤患者组 CD4+ T细胞百分含量呈下降趋势。结论：患者外周血中 CD4+ T细胞表面受体的vβ部分可能存在缺陷。
中国图书资料分类法分类号 R 739.8
, 百拇医药
Study on the defects of CD4+T cell in patients with oral and maxillofacial maligant tumors
Yang Ge, Zhang Lei, Chen Yu, Bu RongFa
(Department of Stomatology, General Hospital of PLA, Beijing 100853)
Abstract Objective:To determine if there is any defect of CD4+ T lymphocyte in the peripheral blood of patients with oral and maxillofacial malignant tumors. Methods:Use MTT dying and flow cytometry assay to identify the lymphocyte stimulation response to PHA or SEB, and the percent of T subset in the peripheral blood of these patients. Results:The percent of CD4+ T cell and the ratio of CD4/CD8 in patient group were both higher than those in health group. The response of lymphocyte in patients′ peripheral blood to PHA and SEB was lower than that in health group. Conclusion:The immune response of patients with oral and maxillofacial malignant tumors is lower than that of the healthy. There may be some defects on the vβ chain of TCR on CD4+ T cell in peripheral blood of these patients.
, 百拇医药
Key words oral and maxillofacial maligant tumors; T subset; superantigen; PHA
口腔颌面部恶性肿瘤患者存在不同程度的免疫功能紊乱，尤其细胞免疫功能低下。免疫失调与肿瘤的复发及转移关系密切〔1，2〕。作者采用外周血淋巴细胞体外培养及流式细胞技术，初步探讨了与肿瘤免疫关系最密切的T细胞结构缺陷的可能原因。
1 对象和方法
1.1 对象
1.1.1 正常人组 307 医院血站献血员，男性，年龄 21～29 岁。
1.1.2 恶性肿瘤组 解放军总医院口腔科住院病人，经病理检查明确诊断，待手术。
, http://www.100md.com
1.2 淋巴细胞表面标志物的检测〔5～7〕
1.2.1 肿瘤患者外周血CD4+、CD8+ T细胞的测定 方法见参考文献〔3〕。
1.2.2 肿瘤患者外周血CD4+、CD8+ T细胞体外增殖状况的测定 常规分离人外周血淋巴细胞后，于 24 孔培养板(Nunclon)每孔中加入PHA 10 μg/ml，细胞 2×105 个。 37 ℃， 5% CO2 孵育至 4 d、 6 d，FACScalibur测定CD4+、CD8+ T细胞含量。
1.3 丝裂原、超抗原刺激淋巴细胞增殖试验〔5，6〕(MTT法) 方法见参考文献〔4〕。
, 百拇医药
1.4 统计分析 应用SAS统计软件分析数据
2 结 果
2.1 口腔颌面部恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞的免疫应答能力 献血员为正常对照组，用植物血凝素(PHA)刺激原， 5 d 后观测恶性肿瘤组淋巴细胞免疫应答能力。结果，对照组的OD值为 0.666±0.016，肿瘤组为 0.534±0.140， P<0.05，差别有显著性意义。提示颌面部恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞免疫应答力较正常人明显低下。
2.2 颌面部恶性肿瘤患者CD4+、CD8+ T细胞亚群比例失衡 与正常组比较，颌面部恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞亚群中CD4+ T细胞的含量、CD4/CD8比值明显增高(表 1)。
表1 恶性肿瘤患者外周血免疫细胞表面分子表达的测定(x±s) 分组
, 百拇医药
例数
CD4(%)
CD8(%)
CD4/CD8
CD16(%)
正常组
6
35.68±6.41
27.56±7.26
1.35±0.28
11.79±7.95
肿瘤组
, http://www.100md.com
8
50.1±7.79*
27.04±5.40
1.96±0.65*
8.61±4.21
2.3 患者CD4+、CD8+ T细胞亚群在免疫应答中的变化 在PHA刺激下，恶性肿瘤患者组CD4+ T细胞百分含量呈下降趋势，而正常人组CD4+、CD8+T细胞亚群百分含量无明显变化。该结果进一步提示CD4+ T细胞可能存在缺陷(表 2)。表2 恶性肿瘤患者淋巴细胞在PHA刺激下T细胞亚群的变化(x±s) 分组
, http://www.100md.com
正常组
肿瘤组
CD4(%)
CD8(%)
CD4(%)
CD8(%)
0d
37.62±1.82
29.37±1.8
41.09±13.15
35.14±10.92
4d
, http://www.100md.com
32.8±14.75
40.61±9.37
39.99±0.22
29.34±3.81
6d
30.13±6.43
38.16±10.01
17.17±13.34
47.63±12.91
2.4 口腔颌面部恶性肿瘤患者CD4+ T细胞缺陷的机制 经t检验分析，SEB刺激淋巴细胞增殖时，肿瘤组OD值为 0.430±0.173，低于正常组的 0.638±0.191， P＝0.0267，还低于PHA刺激的淋巴细胞增殖 (P<0.05)。结果提示，肿瘤患者CD4+ T细胞表面抗原识别受体vβ链(即β链可变区)上的位点可能存在缺陷。
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3 讨 论
T淋巴细胞对肿瘤的细胞免疫反应包括两种亚群作用：MHC Ⅱ类限制性T细胞即CD4+辅助T细胞(Th)，分泌淋巴因子，激活其它效应细胞产生炎症反应并介导其作用；MHCⅠ类限制性T细胞即CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)，也分泌淋巴因子，可对靶细胞发生细胞介导细胞毒作用，直接杀伤带有特异性抗原的细胞或相应的靶细胞〔5〕。本文通过流式细胞术检测口腔颌面恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞表面标志发现，CD8+ T细胞在淋巴细胞中占的比例与正常人无明显差别。而恶性肿瘤组CD4+ T细胞及CD4/CD8比值均高于正常人。这与Wolf〔6〕的报道一致。然而，过量的CD4+ T细胞能否提高患者淋巴细胞免疫反应的应答力呢?我们发现在等量淋巴细胞的条件下，患者淋巴细胞对PHA和SEB的反应性均低于正常人。说明，口腔颌面部恶性肿瘤患者外周血中过量比例的CD4+ T细胞不能提高患者淋巴细胞免疫应答性。与此同时，恶性肿瘤患者淋巴细胞对SEB的反应性也低于其对PHA的反应性，而正常人淋巴细胞对SEB与PHA的反应性则并无明显差别。这一现象提示，患者淋巴细胞免疫应答性的降低可能与过量的CD4+ T细胞有关。我们知道，PHA作为有丝分裂原，不仅对T细胞(辅助T细胞和抑制T细胞)，而且对B细胞也有活化作用。其活化作用无需抗原提呈细胞的递成。PHA是通过结合T细胞表面抗原识别受体的a或b链激活T淋巴细胞的。但SEB作为超抗原，需单核巨噬细胞等抗原提呈细胞的递成，特异性地结合T细胞表面抗原识别受体的vβ链(即β链可变区)上的位点激活T淋巴细胞，并且只作用于MHCⅡ限制的CD4+ T细胞〔7，8〕。虽然患者外周血淋巴细胞中CD8+ T细胞及CD16+细胞(包括单核巨噬细胞)所占的比例无明显变化，但淋巴细胞对SEB的反应性并没有因过量的CD4+ T细胞升高。这提示口腔颌面部恶性肿瘤患者外周血中CD4+ T细胞表面抗原识别受体vβ链上的位点有缺陷。此外，观测不同时间PHA刺激后的患者淋巴细胞的变化时发现，CD8+ T细胞的变化不明显，而CD4+ T细胞则呈下降趋势，也为此提供了证据。
, 百拇医药
口腔颌面部恶性肿瘤患者免疫功能下降以细胞免疫紊乱为主。因此，探讨患者免疫缺陷的机制，对口腔颌面部恶性肿瘤患者肿瘤复发和转移的预防与治疗有重要意义。
参考文献
1 Wustrow TPU, Issing WJ. Immune defects in patients with head and neck cancer. Anticancer Res, 1993,13:1507
2 Schantz SP. Basic science advances in head and neck oncology: The past decade. Semin Surg Oncol, 1995,11:272
3 杨廷彬，尹学念，宋贻等.实用免疫学.长春：长春出版社，1994.558～563
, http://www.100md.com
4 陈钰，张云林，刘颖等.超抗原诱导人外周血T淋巴细胞的增殖.军医进修学院学报，1996，17(2)：79
5 汤钊猷，平世能，曹世龙等.现代肿瘤学.上海：上海医科大学出版社，1993：121～140
6 Wolf GT, Schmalta S, Hudson J et al. Alteration in T lymphocyte subpopulations in patients with head and neck cancer. Correlation with prognosis. Arch Otolaryngol Head Neck Surg， 1987,113:1200
7 Licastro F, Davis LJ, Morini CM. Lectins and superantigens: membrane interactions of these compounds with T lymphocytes affect immune responses. Am J Biochem, 1991,25:845
8 Pullen AM, Wade T, Marrack P et al. Identification of the region of T cell receptor β chain that interacts with selfsuperantigen Mls-La. Cell，1990,61:1365
(1999—03—14收稿，1999—04—20修回), 百拇医药
单位：解放军总医院口腔科，北京 100853 杨舸 步荣发 解放军总医院基础研究所免疫室 张磊 陈钰
关键词：口腔颌面部恶性肿瘤；T淋巴细胞亚群；超抗原；PHA
军医进修学院学报990412 摘要 目的：初步探讨口腔颌面部恶性肿瘤患者免疫抑制的原因。方法：检测患者外周血淋巴细胞亚群及体外淋巴细胞增殖水平。结果：患者的 CD4+ T细胞数量增多，但对PHA和SEB刺激的反应性均低于正常人。在PHA刺激下，恶性肿瘤患者组 CD4+ T细胞百分含量呈下降趋势。结论：患者外周血中 CD4+ T细胞表面受体的vβ部分可能存在缺陷。
中国图书资料分类法分类号 R 739.8
, 百拇医药
Study on the defects of CD4+T cell in patients with oral and maxillofacial maligant tumors
Yang Ge, Zhang Lei, Chen Yu, Bu RongFa
(Department of Stomatology, General Hospital of PLA, Beijing 100853)
Abstract Objective:To determine if there is any defect of CD4+ T lymphocyte in the peripheral blood of patients with oral and maxillofacial malignant tumors. Methods:Use MTT dying and flow cytometry assay to identify the lymphocyte stimulation response to PHA or SEB, and the percent of T subset in the peripheral blood of these patients. Results:The percent of CD4+ T cell and the ratio of CD4/CD8 in patient group were both higher than those in health group. The response of lymphocyte in patients′ peripheral blood to PHA and SEB was lower than that in health group. Conclusion:The immune response of patients with oral and maxillofacial malignant tumors is lower than that of the healthy. There may be some defects on the vβ chain of TCR on CD4+ T cell in peripheral blood of these patients.
, 百拇医药
Key words oral and maxillofacial maligant tumors; T subset; superantigen; PHA
口腔颌面部恶性肿瘤患者存在不同程度的免疫功能紊乱，尤其细胞免疫功能低下。免疫失调与肿瘤的复发及转移关系密切〔1，2〕。作者采用外周血淋巴细胞体外培养及流式细胞技术，初步探讨了与肿瘤免疫关系最密切的T细胞结构缺陷的可能原因。
1 对象和方法
1.1 对象
1.1.1 正常人组 307 医院血站献血员，男性，年龄 21～29 岁。
1.1.2 恶性肿瘤组 解放军总医院口腔科住院病人，经病理检查明确诊断，待手术。
, http://www.100md.com
1.2 淋巴细胞表面标志物的检测〔5～7〕
1.2.1 肿瘤患者外周血CD4+、CD8+ T细胞的测定 方法见参考文献〔3〕。
1.2.2 肿瘤患者外周血CD4+、CD8+ T细胞体外增殖状况的测定 常规分离人外周血淋巴细胞后，于 24 孔培养板(Nunclon)每孔中加入PHA 10 μg/ml，细胞 2×105 个。 37 ℃， 5% CO2 孵育至 4 d、 6 d，FACScalibur测定CD4+、CD8+ T细胞含量。
1.3 丝裂原、超抗原刺激淋巴细胞增殖试验〔5，6〕(MTT法) 方法见参考文献〔4〕。
, 百拇医药
1.4 统计分析 应用SAS统计软件分析数据
2 结 果
2.1 口腔颌面部恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞的免疫应答能力 献血员为正常对照组，用植物血凝素(PHA)刺激原， 5 d 后观测恶性肿瘤组淋巴细胞免疫应答能力。结果，对照组的OD值为 0.666±0.016，肿瘤组为 0.534±0.140， P<0.05，差别有显著性意义。提示颌面部恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞免疫应答力较正常人明显低下。
2.2 颌面部恶性肿瘤患者CD4+、CD8+ T细胞亚群比例失衡 与正常组比较，颌面部恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞亚群中CD4+ T细胞的含量、CD4/CD8比值明显增高(表 1)。
表1 恶性肿瘤患者外周血免疫细胞表面分子表达的测定(x±s) 分组
, 百拇医药
例数
CD4(%)
CD8(%)
CD4/CD8
CD16(%)
正常组
6
35.68±6.41
27.56±7.26
1.35±0.28
11.79±7.95
肿瘤组
, http://www.100md.com
8
50.1±7.79*
27.04±5.40
1.96±0.65*
8.61±4.21
2.3 患者CD4+、CD8+ T细胞亚群在免疫应答中的变化 在PHA刺激下，恶性肿瘤患者组CD4+ T细胞百分含量呈下降趋势，而正常人组CD4+、CD8+T细胞亚群百分含量无明显变化。该结果进一步提示CD4+ T细胞可能存在缺陷(表 2)。表2 恶性肿瘤患者淋巴细胞在PHA刺激下T细胞亚群的变化(x±s) 分组
, http://www.100md.com
正常组
肿瘤组
CD4(%)
CD8(%)
CD4(%)
CD8(%)
0d
37.62±1.82
29.37±1.8
41.09±13.15
35.14±10.92
4d
, http://www.100md.com
32.8±14.75
40.61±9.37
39.99±0.22
29.34±3.81
6d
30.13±6.43
38.16±10.01
17.17±13.34
47.63±12.91
2.4 口腔颌面部恶性肿瘤患者CD4+ T细胞缺陷的机制 经t检验分析，SEB刺激淋巴细胞增殖时，肿瘤组OD值为 0.430±0.173，低于正常组的 0.638±0.191， P＝0.0267，还低于PHA刺激的淋巴细胞增殖 (P<0.05)。结果提示，肿瘤患者CD4+ T细胞表面抗原识别受体vβ链(即β链可变区)上的位点可能存在缺陷。
, http://www.100md.com
3 讨 论
T淋巴细胞对肿瘤的细胞免疫反应包括两种亚群作用：MHC Ⅱ类限制性T细胞即CD4+辅助T细胞(Th)，分泌淋巴因子，激活其它效应细胞产生炎症反应并介导其作用；MHCⅠ类限制性T细胞即CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)，也分泌淋巴因子，可对靶细胞发生细胞介导细胞毒作用，直接杀伤带有特异性抗原的细胞或相应的靶细胞〔5〕。本文通过流式细胞术检测口腔颌面恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞表面标志发现，CD8+ T细胞在淋巴细胞中占的比例与正常人无明显差别。而恶性肿瘤组CD4+ T细胞及CD4/CD8比值均高于正常人。这与Wolf〔6〕的报道一致。然而，过量的CD4+ T细胞能否提高患者淋巴细胞免疫反应的应答力呢?我们发现在等量淋巴细胞的条件下，患者淋巴细胞对PHA和SEB的反应性均低于正常人。说明，口腔颌面部恶性肿瘤患者外周血中过量比例的CD4+ T细胞不能提高患者淋巴细胞免疫应答性。与此同时，恶性肿瘤患者淋巴细胞对SEB的反应性也低于其对PHA的反应性，而正常人淋巴细胞对SEB与PHA的反应性则并无明显差别。这一现象提示，患者淋巴细胞免疫应答性的降低可能与过量的CD4+ T细胞有关。我们知道，PHA作为有丝分裂原，不仅对T细胞(辅助T细胞和抑制T细胞)，而且对B细胞也有活化作用。其活化作用无需抗原提呈细胞的递成。PHA是通过结合T细胞表面抗原识别受体的a或b链激活T淋巴细胞的。但SEB作为超抗原，需单核巨噬细胞等抗原提呈细胞的递成，特异性地结合T细胞表面抗原识别受体的vβ链(即β链可变区)上的位点激活T淋巴细胞，并且只作用于MHCⅡ限制的CD4+ T细胞〔7，8〕。虽然患者外周血淋巴细胞中CD8+ T细胞及CD16+细胞(包括单核巨噬细胞)所占的比例无明显变化，但淋巴细胞对SEB的反应性并没有因过量的CD4+ T细胞升高。这提示口腔颌面部恶性肿瘤患者外周血中CD4+ T细胞表面抗原识别受体vβ链上的位点有缺陷。此外，观测不同时间PHA刺激后的患者淋巴细胞的变化时发现，CD8+ T细胞的变化不明显，而CD4+ T细胞则呈下降趋势，也为此提供了证据。
, 百拇医药
口腔颌面部恶性肿瘤患者免疫功能下降以细胞免疫紊乱为主。因此，探讨患者免疫缺陷的机制，对口腔颌面部恶性肿瘤患者肿瘤复发和转移的预防与治疗有重要意义。
参考文献
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3 杨廷彬，尹学念，宋贻等.实用免疫学.长春：长春出版社，1994.558～563
, http://www.100md.com
4 陈钰，张云林，刘颖等.超抗原诱导人外周血T淋巴细胞的增殖.军医进修学院学报，1996，17(2)：79
5 汤钊猷，平世能，曹世龙等.现代肿瘤学.上海：上海医科大学出版社，1993：121～140
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7 Licastro F, Davis LJ, Morini CM. Lectins and superantigens: membrane interactions of these compounds with T lymphocytes affect immune responses. Am J Biochem, 1991,25:845
8 Pullen AM, Wade T, Marrack P et al. Identification of the region of T cell receptor β chain that interacts with selfsuperantigen Mls-La. Cell，1990,61:1365
(1999—03—14收稿，1999—04—20修回), 百拇医药