抗人结肠癌单链抗体 CL-3 在大肠杆菌中的表达、复性和纯化
作者：贾宝庆 袁玫 闫锡蕴 余征 李力 费丽华 方永鑫 林星石 张晓平 蒋彦永
单位：解放军总医院普通外科，北京 100853 贾宝庆 蒋彦永 解放军总医院肿瘤生物研究室 袁玫 余征 李力 费丽华 方永鑫 林星石 张晓平 中国科学院微生物研究所，北京 100080 闫锡蕴
关键词：单链抗体；包涵体；表达；大肠杆菌
军医进修学院学报990409 摘要 目的：为得到单链抗体高效表达，我们对抗人结肠癌单链抗体 CL-3 在大肠杆菌中的表达、复性和纯化进行了研究。方法：以重组质粒表达载体 pJW2-CL-3 转化大肠杆菌DH5α，重组克隆在培基中温控诱导，以包涵体形式表达单链抗体。包涵体经溶解、复性、纯化后，以SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达蛋白，ELISA法鉴定单链抗体的免疫活性。结果：42 ℃ 诱导 5 h 蛋白表达量占菌体蛋白的 30%。 8 mol/L 尿素可将包涵体大部分溶解，稀释于复性缓冲液中静置 10 ℃ 48 h 以上可使包涵体蛋白复性。纯化峰经鉴定， 27 KD 处表达之蛋白为带有E-tag的抗人结肠癌单链抗体 CL-3，并证明其具有与抗原CEA特异性结合的功能，免疫活性与亲代抗体 CL-3 相似。结论：本研究获得的以包涵体形式在大肠杆菌中表达的抗人结肠癌单链抗体 CL-3，具有与亲代抗体相似的免疫活性，为高效表达单链抗体，用于肿瘤的诊断和治疗提供了依据。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 392
Expression, renatureation and purification of anti-human colon cancer scFv CL-3 in E.Coli
Jia Baoqing, Yuan Mei, Yan Xiyun, Yu Zheng, Li Li, Fei Lihua, Fang Yongxin, Lin Xingshi, Zhang Xiaoping, Jiang Yanyong
(Department. of General Surgery, General Hospital of Chinese PLA, Beijing, 100853)
Abstract Objective:To expect more efficient expression, we expressed scFv CL-3, which specifically targets to human colon cancer membrane antigen, as inclusion bodies in E.Coli. Methods:Recombinant plasmid pJW2-CL-3 were transformed into E.Coli DH5 α. Induced by temperature control, scFv CL-3 were expressed as inclusion bodies in the plasms of bacteria when the positive clone has been cultured in LB till OD600=0.6. After being digested and sonicated, inclusion bodies were dissolved in 8M urea and then diluted 100 fold into renaturation buffer at 10℃. The scFv were purified on ion exchange Blot. Immunoactivity of the scFv was appraised by ELISA. Results:After 5 hour-inducing, the inclusion bodies turn out to account for about 30% of total bacterial proteins. Inclusion bodies were dissolved in 8M urea and have been refolded in renaturation buffer after 48 hours at 10℃. When eluted with 0.3 mol/L NaCl/20 nmol/L TE, scFv were obtained from ion exchange column elution. SDS-PAGE and Western Blot proved that the 27KD protein expressed in E.Coli is scFv with E-tag fused to its Cterminus. The renatured scFv CL-3 has similar specificity and Immunoactivity to its parent antibody as evaluated by ELISA. Conclusion:Expressed scFv CL-3 as inclusion bodies in E.Coli. After renaturation and purification, the scFv were showed could bind specifically to human colon cancer antigen.
, 百拇医药
Key words scFv; inclusion body; expression; E.Coli
单链抗体是用基因工程的方法将抗体轻链可变区和重链可变区连接起来构成的抗体可变区片段(single chain Fv fragment, scFv)，是具有完整抗原结合位点的最小抗体功能片段〔1〕。由于scFv分子量少，对肿瘤穿透力强，而在非肿瘤组织中的清除较快，又能与酶、免疫毒素或细胞因子等连接形成融合蛋白，或与化疗药物及放射性核素偶联，因而在肿瘤的诊断和治疗方面，比完整的鼠源性单克隆抗体具有更多的优越性。
本研究对在大肠杆菌中以包涵体形式表达的单链抗体 CL-3 蛋白进行了表达、复性和纯化的研究，为进一步提高scFv的表达效率及用于肿瘤的诊断和治疗提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料 大肠杆菌DH5α细胞系及重组质粒pJW2-CL-3 由中国科学院微生物研究所闫锡蕴研究员提供。DNA限制性内切酶Bam H I和EcoR I购自promega公司，氧化型及还原型谷胱甘肽和溶菌酶购自Boehring公司，Tryptone和Yeast Extract购自Oxoid公司。FPLC蛋白质纯化系统、Q Sepharose Fast Flow离子交换层析凝胶及Mono Q离子交换层析柱为Pharmacia公司产品。中空纤维透析器为Gambro公司产品。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 单链抗体CL-3 蛋白的表达 以 0.1 mol/L 氯化钙制备DH5α感受态细胞，pJW2-CL-3 转化感受态的DH5α细胞，复苏后涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上， 37 ℃ 培养 20 h，随机挑选单菌落，接种于LB培养基中(含氨苄青霉素 100 μg/ml, Amp+，后同) 37 ℃ 培养过夜，碱法提取质粒DNA，Bam H I/EcoR I双酶切， 1.2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。重组阳性克隆接种于LB中培养过夜，次日扩大培养于 1000 ml LB中，37 ℃ 培养至OD600＝0.6，42 ℃诱导 5 h。分别于 2 h、 3 h、 4 h、 5 h 取样观察表达情况。 5000g 4 ℃ 离心 10 min，弃培养上清，收集菌体沉淀。
1.2.2 单链抗体CL-3 蛋白的复性 菌体重悬于 20ml 50 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA (pH 8.2) 中， 200 μg/ml 溶菌酶室温消化 30 min 后超声波菌， 12 000 g 4 ℃ 离心 30 min，弃上清，沉淀即为包涵体〔7〕。以含 1 mg/ml 脱氧胆酸钠(DOC)的 50 mmol/L TE 及 1% Triton X-100 洗涤包涵体后 -20 ℃ 冻存。以 8 M 尿素/0.1 mol/L TE 溶解包涵体，12 000 g 4 ℃ 离心 20 min，弃沉淀。冰浴中磁力搅拌下将包涵体蛋白溶液逐滴加入 100 倍体积的复性缓液中 (0.1 mol/L TE, 0.5 mol/L L-精氨酸， 1 mmol/L GSSG， 0.2 mmol/L GSH, pH 8.4)静置 10 ℃ 复性 48 h 以上。
, http://www.100md.com
1.2.3 单链抗体 CL-3 蛋白的纯化 复性液以中空纤维透析器浓缩，然后对 0.1 mol/L TE, 1 mol/L 尿素透析 24 h。以Mono Q及Q Sepharose FF离子交换层析纯化单链抗体。以 20 mmol/L TE (pH 7.4)平衡层析柱。分别以 0.3 mol/L， 0.5 mol/L， 1 mol/L NaCl/20 mmol/L TE盐梯度阶段洗脱，收集目的峰。
1.2.4 SDS-PAGE鉴定单链抗体CL-3 以 5% 浓缩胶、 12% 分离胶电泳，考马斯亮染色后，采用双波长薄层扫描仪扫描记录结果。
1.2.5 Western Blot 鉴定单链抗体CL-3 由于在构建单链抗体基因时在 3′ 端插入了E-tag标志肽序列，因此表达蛋白可以用抗E-tag单克隆抗体进行检测。SDS-PAGE凝胶块与硝酸纤维素膜固定于电转移夹中，在转染缓冲液(20 mmol/L Tris, 192 mmol/L 甘氨酸， 20% 甲醇)中以 100 mA 电转移 15 h。 1% NP-40/PBS 浸泡 30 min，PBS-Tween 20 洗涤硝酸纤维素膜，10% 小牛血清封闭后与 1∶2 000 稀释的抗E-tag抗体温育 1h，加Biotin标记的兔抗鼠抗体温育 1 h，加HRP-Streptavidin温育 30 min，DAB显色， 10% 氨基黑染色。
, 百拇医药
1.2.6 单链抗体 CL-3 的免疫活性鉴定(ELISA法) 以抗原CEA包被 96 孔板，1 μg/ml， 50 μL/孔。 1% BSA 封闭。 0.05% Tween-20-PBS 倍比稀释纯化后的单链抗体为第一抗体，起始浓度 100 μg/ml， CL-3 F(ab′) 2 为阳性对照，LB为阴性对照。1∶2000 稀释的抗E-tag抗体为第二抗体，然后加Biotin标记的兔抗鼠抗体和HRP-Streptavidin, OPD显色，酶联检测仪测定OD490值。
2 结 果
pJW2-CL-3 转化DH5α细胞后对随机挑选的 16 个克隆以碱法提取质粒DNA，Bam H I/EcoR I双酶切， 1.2% 琼脂糖凝胶电泳示 4.9kb 和 0.7 kb 处各出现一个DNA条带，前者为 pJW 2，后者为scFv基因条带(附图)。
, 百拇医药
附图 重组质粒pJW2 的BamHI/EcoR酶切鉴定
1.分子量标准(λDNA/Hind Ⅲ)；2. BamH I/EcoR酶切产物
重组阳性克隆接种于LB培养基中培养至OD600＝0.6，42 ℃ 诱导 5 h 包涵体表达量最高，占菌体蛋白的 30%，洗涤后包涵体纯度可达 80%。Western Blot 证明 27 kb 处表达之蛋白为带有E-tag的单链抗体。
经ELISA法鉴定，DH5α表达之抗体蛋白经体外复性及离子交换层析纯化后具有抗原CEA特异性结合的功能，与亲代抗体相似。
3 讨 论
当今用分子生物学方法构建的抗体基因能否在表达宿主中高效表达出具有抗原结合功能的抗体分子是抗体工程研究中非常重要的课题。尤其在大肠杆菌中以包涵体形式表达的基因工程抗体，最关键一点是如何复性使其成为有免疫活性的抗体分子。尿素和盐酸胍均能使包涵体溶解，加上二硫键还原剂的作用，错配的二硫键被打开，蛋白还原成为一级结构的形式，在谷胱甘肽氧化还原体系中，抗体分子可正确地形成二硫键，折叠成具有抗原结合能力的单链抗体。对于不同的抗体，GSSG和GSH的最合适浓度和二者的比例会有所不同，应具体掌握。我们经过摸索，认为对CL-3 单链抗体，采用 1 mmol/L GSSG, 0.2 mmol/L GSH复性效率较高。在包涵体变性过程中，有时需要加入二硫键还原剂如二硫苏糖醇(DTT)等，以便打开错配的二硫键，使蛋白彻底解聚。在复性过程中，则应考虑其对氧化还原体系的影响，必要时应透析去除二硫键还原剂。如不去除，则应按照GSSG/DTT＝3∶1 的比例(复性液中的终浓度)调整。复性缓冲液的pH值在 7.4～8.2 之间有利于二硫键的形成，过高或过低会降低复性效率。为防止复性中间产物再聚合，应保持复性时蛋白浓度在 100 μg/ml 以下。L-精氨酸的加入有助于增加复性中间产物的溶解度。我们发现，如果变性蛋白加入复性液中过快，容易形成絮状沉淀，可能是蛋白重新凝聚的缘故。所以我们采用在冰浴和磁力搅拌下，逐滴加入变性蛋白，使变性蛋白在复性液中始终处于低浓度状态。在纯化之前，必须透析去除L-精氨酸及氧化还原剂，以防止影响离子交换层析效率。但由于复性液体积过大，透析比较困难。文献中多报导先将复性液浓缩后再透析。但我们发现，复性液直接浓缩很容易出现絮状沉淀。如前所述，我们利用中空纤维透析器将复性液对 0.1 mol/L TE 透析，可以不用浓缩，而直接透析过的复性液上离子交换层析柱。另外在透析液中加入 1 M 尿素也可以有效地防止沉淀的发生。
, 百拇医药
在实验过程中我们发现，在 20 mmol/L TE (pH 7.4) 中保存两周以上的单链抗体免疫活性会有下降。分析其原因可能有三：① 单链抗体重新发生聚合，形成二聚体甚至多聚体，遮蔽了单链抗体的抗原结合位点；②蛋白水解酶对抗体的降解；③重链可变区与轻链可变区之间的非共价结合的解离，使单链抗体失去正确折叠的构象。可能不同的单链抗体其降解程度或发生再聚合的程度也是不同的。因此如何改善单链抗体的保存条件，减少其免疫活性的下降或丧失，也将是一个重要的课题。
国家自然科学基金资助项目，编号 39570690
参考文献
1 Bird RE, Hardman KD, Jocobson JW et al. Single-chain antigen binding proteins. Science, 1988,242:423
, 百拇医药 2 Skerra A. Bacterial expressiong of immunoglublin fragments. Opin Immunol, 1993,5:256
3 Huston JS, Levinson D, Mudgett-Hunter M et al. Protein engineering of antibody binding site: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain analog produced in E.Coli. Proc Natl Acad Sci USA, 1988,85:5879
4 袁玫，刘成贵，李力.抗结肠癌单克隆抗体CL-3，CL-4 的制备、特性及临床诊断应用.中国肛肠病杂志，1988，8：3
5 罗容城，张海鹰，张军一.瘤内注射对结肠癌及其转移灶的放射免疫导向治疗.第二届全国肿瘤和慢性肝炎生物治疗研讨会论文汇编：广州，1994：73
, http://www.100md.com
6 贾宝庆，方永鑫，蒋彦永.手持式γ探测仪对荷人结肠癌裸鼠放射免疫探测的研究.单克隆抗体通讯，1994，10(1)：23
7 Buchner J, Paston I, Brinkman U. A method for increasing the yield of properly folded recombinant fusion protiens: Single-chain immunotoxins from renaturation of bacterial inclusion bodies. Anal Biochem, 1992,205:263
8 Pluckthun A. Mono and Bivalent antibody fragmemts produced in E.Coli: engineering folding and antigen binding. Immunol Rev, 1992,13:151
(1999—03—17收稿，1999—05—04修回), http://www.100md.com
单位：解放军总医院普通外科，北京 100853 贾宝庆 蒋彦永 解放军总医院肿瘤生物研究室 袁玫 余征 李力 费丽华 方永鑫 林星石 张晓平 中国科学院微生物研究所，北京 100080 闫锡蕴
关键词：单链抗体；包涵体；表达；大肠杆菌
军医进修学院学报990409 摘要 目的：为得到单链抗体高效表达，我们对抗人结肠癌单链抗体 CL-3 在大肠杆菌中的表达、复性和纯化进行了研究。方法：以重组质粒表达载体 pJW2-CL-3 转化大肠杆菌DH5α，重组克隆在培基中温控诱导，以包涵体形式表达单链抗体。包涵体经溶解、复性、纯化后，以SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达蛋白，ELISA法鉴定单链抗体的免疫活性。结果：42 ℃ 诱导 5 h 蛋白表达量占菌体蛋白的 30%。 8 mol/L 尿素可将包涵体大部分溶解，稀释于复性缓冲液中静置 10 ℃ 48 h 以上可使包涵体蛋白复性。纯化峰经鉴定， 27 KD 处表达之蛋白为带有E-tag的抗人结肠癌单链抗体 CL-3，并证明其具有与抗原CEA特异性结合的功能，免疫活性与亲代抗体 CL-3 相似。结论：本研究获得的以包涵体形式在大肠杆菌中表达的抗人结肠癌单链抗体 CL-3，具有与亲代抗体相似的免疫活性，为高效表达单链抗体，用于肿瘤的诊断和治疗提供了依据。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 392
Expression, renatureation and purification of anti-human colon cancer scFv CL-3 in E.Coli
Jia Baoqing, Yuan Mei, Yan Xiyun, Yu Zheng, Li Li, Fei Lihua, Fang Yongxin, Lin Xingshi, Zhang Xiaoping, Jiang Yanyong
(Department. of General Surgery, General Hospital of Chinese PLA, Beijing, 100853)
Abstract Objective:To expect more efficient expression, we expressed scFv CL-3, which specifically targets to human colon cancer membrane antigen, as inclusion bodies in E.Coli. Methods:Recombinant plasmid pJW2-CL-3 were transformed into E.Coli DH5 α. Induced by temperature control, scFv CL-3 were expressed as inclusion bodies in the plasms of bacteria when the positive clone has been cultured in LB till OD600=0.6. After being digested and sonicated, inclusion bodies were dissolved in 8M urea and then diluted 100 fold into renaturation buffer at 10℃. The scFv were purified on ion exchange Blot. Immunoactivity of the scFv was appraised by ELISA. Results:After 5 hour-inducing, the inclusion bodies turn out to account for about 30% of total bacterial proteins. Inclusion bodies were dissolved in 8M urea and have been refolded in renaturation buffer after 48 hours at 10℃. When eluted with 0.3 mol/L NaCl/20 nmol/L TE, scFv were obtained from ion exchange column elution. SDS-PAGE and Western Blot proved that the 27KD protein expressed in E.Coli is scFv with E-tag fused to its Cterminus. The renatured scFv CL-3 has similar specificity and Immunoactivity to its parent antibody as evaluated by ELISA. Conclusion:Expressed scFv CL-3 as inclusion bodies in E.Coli. After renaturation and purification, the scFv were showed could bind specifically to human colon cancer antigen.
, 百拇医药
Key words scFv; inclusion body; expression; E.Coli
单链抗体是用基因工程的方法将抗体轻链可变区和重链可变区连接起来构成的抗体可变区片段(single chain Fv fragment, scFv)，是具有完整抗原结合位点的最小抗体功能片段〔1〕。由于scFv分子量少，对肿瘤穿透力强，而在非肿瘤组织中的清除较快，又能与酶、免疫毒素或细胞因子等连接形成融合蛋白，或与化疗药物及放射性核素偶联，因而在肿瘤的诊断和治疗方面，比完整的鼠源性单克隆抗体具有更多的优越性。
本研究对在大肠杆菌中以包涵体形式表达的单链抗体 CL-3 蛋白进行了表达、复性和纯化的研究，为进一步提高scFv的表达效率及用于肿瘤的诊断和治疗提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料 大肠杆菌DH5α细胞系及重组质粒pJW2-CL-3 由中国科学院微生物研究所闫锡蕴研究员提供。DNA限制性内切酶Bam H I和EcoR I购自promega公司，氧化型及还原型谷胱甘肽和溶菌酶购自Boehring公司，Tryptone和Yeast Extract购自Oxoid公司。FPLC蛋白质纯化系统、Q Sepharose Fast Flow离子交换层析凝胶及Mono Q离子交换层析柱为Pharmacia公司产品。中空纤维透析器为Gambro公司产品。
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1.2 方法
1.2.1 单链抗体CL-3 蛋白的表达 以 0.1 mol/L 氯化钙制备DH5α感受态细胞，pJW2-CL-3 转化感受态的DH5α细胞，复苏后涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上， 37 ℃ 培养 20 h，随机挑选单菌落，接种于LB培养基中(含氨苄青霉素 100 μg/ml, Amp+，后同) 37 ℃ 培养过夜，碱法提取质粒DNA，Bam H I/EcoR I双酶切， 1.2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。重组阳性克隆接种于LB中培养过夜，次日扩大培养于 1000 ml LB中，37 ℃ 培养至OD600＝0.6，42 ℃诱导 5 h。分别于 2 h、 3 h、 4 h、 5 h 取样观察表达情况。 5000g 4 ℃ 离心 10 min，弃培养上清，收集菌体沉淀。
1.2.2 单链抗体CL-3 蛋白的复性 菌体重悬于 20ml 50 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA (pH 8.2) 中， 200 μg/ml 溶菌酶室温消化 30 min 后超声波菌， 12 000 g 4 ℃ 离心 30 min，弃上清，沉淀即为包涵体〔7〕。以含 1 mg/ml 脱氧胆酸钠(DOC)的 50 mmol/L TE 及 1% Triton X-100 洗涤包涵体后 -20 ℃ 冻存。以 8 M 尿素/0.1 mol/L TE 溶解包涵体，12 000 g 4 ℃ 离心 20 min，弃沉淀。冰浴中磁力搅拌下将包涵体蛋白溶液逐滴加入 100 倍体积的复性缓液中 (0.1 mol/L TE, 0.5 mol/L L-精氨酸， 1 mmol/L GSSG， 0.2 mmol/L GSH, pH 8.4)静置 10 ℃ 复性 48 h 以上。
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1.2.3 单链抗体 CL-3 蛋白的纯化 复性液以中空纤维透析器浓缩，然后对 0.1 mol/L TE, 1 mol/L 尿素透析 24 h。以Mono Q及Q Sepharose FF离子交换层析纯化单链抗体。以 20 mmol/L TE (pH 7.4)平衡层析柱。分别以 0.3 mol/L， 0.5 mol/L， 1 mol/L NaCl/20 mmol/L TE盐梯度阶段洗脱，收集目的峰。
1.2.4 SDS-PAGE鉴定单链抗体CL-3 以 5% 浓缩胶、 12% 分离胶电泳，考马斯亮染色后，采用双波长薄层扫描仪扫描记录结果。
1.2.5 Western Blot 鉴定单链抗体CL-3 由于在构建单链抗体基因时在 3′ 端插入了E-tag标志肽序列，因此表达蛋白可以用抗E-tag单克隆抗体进行检测。SDS-PAGE凝胶块与硝酸纤维素膜固定于电转移夹中，在转染缓冲液(20 mmol/L Tris, 192 mmol/L 甘氨酸， 20% 甲醇)中以 100 mA 电转移 15 h。 1% NP-40/PBS 浸泡 30 min，PBS-Tween 20 洗涤硝酸纤维素膜，10% 小牛血清封闭后与 1∶2 000 稀释的抗E-tag抗体温育 1h，加Biotin标记的兔抗鼠抗体温育 1 h，加HRP-Streptavidin温育 30 min，DAB显色， 10% 氨基黑染色。
, 百拇医药
1.2.6 单链抗体 CL-3 的免疫活性鉴定(ELISA法) 以抗原CEA包被 96 孔板，1 μg/ml， 50 μL/孔。 1% BSA 封闭。 0.05% Tween-20-PBS 倍比稀释纯化后的单链抗体为第一抗体，起始浓度 100 μg/ml， CL-3 F(ab′) 2 为阳性对照，LB为阴性对照。1∶2000 稀释的抗E-tag抗体为第二抗体，然后加Biotin标记的兔抗鼠抗体和HRP-Streptavidin, OPD显色，酶联检测仪测定OD490值。
2 结 果
pJW2-CL-3 转化DH5α细胞后对随机挑选的 16 个克隆以碱法提取质粒DNA，Bam H I/EcoR I双酶切， 1.2% 琼脂糖凝胶电泳示 4.9kb 和 0.7 kb 处各出现一个DNA条带，前者为 pJW 2，后者为scFv基因条带(附图)。
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附图 重组质粒pJW2 的BamHI/EcoR酶切鉴定
1.分子量标准(λDNA/Hind Ⅲ)；2. BamH I/EcoR酶切产物
重组阳性克隆接种于LB培养基中培养至OD600＝0.6，42 ℃ 诱导 5 h 包涵体表达量最高，占菌体蛋白的 30%，洗涤后包涵体纯度可达 80%。Western Blot 证明 27 kb 处表达之蛋白为带有E-tag的单链抗体。
经ELISA法鉴定，DH5α表达之抗体蛋白经体外复性及离子交换层析纯化后具有抗原CEA特异性结合的功能，与亲代抗体相似。
3 讨 论
当今用分子生物学方法构建的抗体基因能否在表达宿主中高效表达出具有抗原结合功能的抗体分子是抗体工程研究中非常重要的课题。尤其在大肠杆菌中以包涵体形式表达的基因工程抗体，最关键一点是如何复性使其成为有免疫活性的抗体分子。尿素和盐酸胍均能使包涵体溶解，加上二硫键还原剂的作用，错配的二硫键被打开，蛋白还原成为一级结构的形式，在谷胱甘肽氧化还原体系中，抗体分子可正确地形成二硫键，折叠成具有抗原结合能力的单链抗体。对于不同的抗体，GSSG和GSH的最合适浓度和二者的比例会有所不同，应具体掌握。我们经过摸索，认为对CL-3 单链抗体，采用 1 mmol/L GSSG, 0.2 mmol/L GSH复性效率较高。在包涵体变性过程中，有时需要加入二硫键还原剂如二硫苏糖醇(DTT)等，以便打开错配的二硫键，使蛋白彻底解聚。在复性过程中，则应考虑其对氧化还原体系的影响，必要时应透析去除二硫键还原剂。如不去除，则应按照GSSG/DTT＝3∶1 的比例(复性液中的终浓度)调整。复性缓冲液的pH值在 7.4～8.2 之间有利于二硫键的形成，过高或过低会降低复性效率。为防止复性中间产物再聚合，应保持复性时蛋白浓度在 100 μg/ml 以下。L-精氨酸的加入有助于增加复性中间产物的溶解度。我们发现，如果变性蛋白加入复性液中过快，容易形成絮状沉淀，可能是蛋白重新凝聚的缘故。所以我们采用在冰浴和磁力搅拌下，逐滴加入变性蛋白，使变性蛋白在复性液中始终处于低浓度状态。在纯化之前，必须透析去除L-精氨酸及氧化还原剂，以防止影响离子交换层析效率。但由于复性液体积过大，透析比较困难。文献中多报导先将复性液浓缩后再透析。但我们发现，复性液直接浓缩很容易出现絮状沉淀。如前所述，我们利用中空纤维透析器将复性液对 0.1 mol/L TE 透析，可以不用浓缩，而直接透析过的复性液上离子交换层析柱。另外在透析液中加入 1 M 尿素也可以有效地防止沉淀的发生。
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在实验过程中我们发现，在 20 mmol/L TE (pH 7.4) 中保存两周以上的单链抗体免疫活性会有下降。分析其原因可能有三：① 单链抗体重新发生聚合，形成二聚体甚至多聚体，遮蔽了单链抗体的抗原结合位点；②蛋白水解酶对抗体的降解；③重链可变区与轻链可变区之间的非共价结合的解离，使单链抗体失去正确折叠的构象。可能不同的单链抗体其降解程度或发生再聚合的程度也是不同的。因此如何改善单链抗体的保存条件，减少其免疫活性的下降或丧失，也将是一个重要的课题。
国家自然科学基金资助项目，编号 39570690
参考文献
1 Bird RE, Hardman KD, Jocobson JW et al. Single-chain antigen binding proteins. Science, 1988,242:423
, 百拇医药 2 Skerra A. Bacterial expressiong of immunoglublin fragments. Opin Immunol, 1993,5:256
3 Huston JS, Levinson D, Mudgett-Hunter M et al. Protein engineering of antibody binding site: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain analog produced in E.Coli. Proc Natl Acad Sci USA, 1988,85:5879
4 袁玫，刘成贵，李力.抗结肠癌单克隆抗体CL-3，CL-4 的制备、特性及临床诊断应用.中国肛肠病杂志，1988，8：3
5 罗容城，张海鹰，张军一.瘤内注射对结肠癌及其转移灶的放射免疫导向治疗.第二届全国肿瘤和慢性肝炎生物治疗研讨会论文汇编：广州，1994：73
, http://www.100md.com
6 贾宝庆，方永鑫，蒋彦永.手持式γ探测仪对荷人结肠癌裸鼠放射免疫探测的研究.单克隆抗体通讯，1994，10(1)：23
7 Buchner J, Paston I, Brinkman U. A method for increasing the yield of properly folded recombinant fusion protiens: Single-chain immunotoxins from renaturation of bacterial inclusion bodies. Anal Biochem, 1992,205:263
8 Pluckthun A. Mono and Bivalent antibody fragmemts produced in E.Coli: engineering folding and antigen binding. Immunol Rev, 1992,13:151
(1999—03—17收稿，1999—05—04修回), http://www.100md.com