替代C-反应蛋白的脂肪乳剂凝集试验方法及其初步临床应用
作者：单小京
单位：江浦县中医院，江苏江浦211800
关键词：C-反应蛋白；脂肪乳剂；凝集试验
替代C 摘要 脂肪乳剂凝集试验可替代C-反应蛋白检测。在玻片上，将含有氯化钙的脂肪乳剂与病人血清混合，观察凝集反应。并将其结果与免疫化学法的胶乳凝集试验及速率浊度法比较。用本法与CRP胶乳凝集试验平行检测了203例临床标本，二者均呈阳性的43例，本法阳性而后者阴性的36例，速率浊度法对比试验了44份临床标本，结果速率浊度法超出正常上限的34份标本本法均阳性，阳性程度与浓度呈正相关；速率浊度法CRP<10 mg/L的10份标本，本法均呈阴性。初步结果表明，本法是一种替代检测CRP的简单、快速、敏感、可信和经济的方法，并且可半定量，适合常规实验室作过筛试验。
C-反应蛋白(CRP)是敏感的急性时相蛋白。在血清中显著增高见于细菌感染、损伤、外科手术、心肌梗塞、恶性肿瘤等。测定血清CRP，临床上常用于筛检器质性疾病，估价炎症疾病的活动性，检查治疗过程中的感染，监测肾同种移植受体排斥反应，特别是对儿科病人鉴别细菌与病毒感染更有价值(1，2)本文参考文献[1～3]，观察了替代CRP的脂肪乳剂凝集试验(FAT)。经临床应用，认为FAT简单、快速、经济，敏感性和准确性符合一般临床需要。作者参考Richtert[2]的方法，研究了最适条件，并作了某些改进，初步应用效果满意，现予报道。
, 百拇医药
原理：在钙离子存在下，CRP能与卵磷脂结合形成肉眼可见的“颗粒型”凝集反应。根据颗粒出现的时间长短和大小决定阳性程度。
1 材料与方法
1.1 检测对象 体检正常(小便、大便常规、血常规及临床检查正常)者100例。病毒性感冒初期30例；急性胰腺炎(治疗前)12例，慢性胰腺炎急性发作期12例，产后感染3例，细菌性痢疾4例，胆囊炎术后3例，上呼吸道细菌感染20例，慢性迁延性肝炎13例。
1.2 试剂
1.2.1 40 mmol/L氯化钙 准确称取444 mg无水氯化钙，加蒸馏水溶解并稀释至100 ml。
1.2.2 脂肪乳剂应用液 取脂肪乳剂注射液(无锡华瑞制药公司产品，商品名英脱利匹特，introlipid 20%)1份，加40 mmol/L氯化钙4份，混合，再加叠氮钠使其浓度达0.5 g/L，混匀，置4℃冰箱可用一年。为节省脂肪乳剂，可用临床输注后瓶中剩余部份配制。
, 百拇医药
1.3 方法
1.3.1 FAT操作步骤 在清洁干燥的载物玻片上，用精密移液器(上海求精玻璃仪器厂产)加10 μl待检血清，10 μl脂肪乳剂应用液，混匀，轻轻地水平方向摇动1 min。
结果观察与判断：1 min内出现凝集颗粒，并于2 min内逐渐形成粗大颗粒者为阳性(+++)；2 min内出现凝集颗粒，5 min内逐渐形成粗大颗粒者为阳性(++)；5 min内仅在乳浊状液体中出现细小凝集颗料者为阳性(+)；5 min内不出现凝集颗料，仍呈均一乳浊状者为阴性。
1.3.2 对比方法 CRP乳胶凝集试验(LAT)，用上海市医化所产试剂盒。速率浊度法(RN)CRP，用Beckman Array 360 System及其试剂盒(合校正品，参考值<10 mg/L)。均按说明书操作。
2 实验与结果
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2.1 FAT法最适条件的选择 CRP是与脂肪乳剂中的卵磷脂结合[3],此种现象是钙依赖性的。CaCl2浓度过高时,脂肪乳剂不稳定,易分层。将CaCl2配成20、30、40、50、60、70、80 mmol/L,分别对62例血清样品试验(其中5例为已知阳性样品)，按上法操作，阳性程度随CaCl2浓度增加而增加，40 mmol/L时阳性程度较高而乳剂又稳定。
NaN3因其防腐作用可增进乳剂的稳定性。国外文献[(2)]用0.2 g/L，我们改用0.5 g/L，具有更强的防腐稳定作用，经试验对结果无影响。
静脉脂肪乳剂与40 mmol/L CaCl2溶液按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6稀释，结果显示：稀释倍数过低，因乳剂过浓，弱阳性的凝集颗料在其中不易观察；稀释倍数过高，则反应速度太慢；结果以1∶4稀释较佳。
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2.2 FAT与LAT对比试验 203例各种样品同时用两法测定，结果见表1、表2。
表1 203例样品CRP的FAT和 LAT检测结果
方法
n
-
+
++
+++
FAT
LAT
203
203
, 百拇医药
124
160
27
41
40
2
12
0
2.3 各组标本检测结果见表2。 表2 各组CRP的FAT和LAT检测结果
分 组
n
FAT
LAT
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FAT
LAT
FAT
LAT
FAT
LAT
-
+
++
+++
健康者
100
93
, http://www.100md.com 100
7
0
0
0
0
0
病毒性感冒
30
27
30
3
0
0
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0
0
0
急性胰腺炎
18
0
0
0
16
10
2
8
0
慢性胰腺炎
, http://www.100md.com
12
0
7
3
5
6
0
3
0
产后感染
3
0
3
1
, 百拇医药
0
2
0
0
0
细菌性痢疾
4
0
3
1
1
3
0
0
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0
胆囊炎术后
3
0
1
0
2
2
0
1
0
上呼吸道细菌性感染
20
4
, 百拇医药
8
11
12
5
0
0
0
慢性迁延性肝炎
13
0
8
1
5
12
, 百拇医药
0
0
0
2.4 FAT与RN法比较结果 选取CRP RN法浓度为12～178 mg/L的样品34份，<10 mg/L的样品10份，用FAT法检，结果见图1。
图1 FAT与CRP RN法比较结果
结果表明，本法与CRP RN法的关系大致为：-：<10 mg/L，+：11～30 mg/L，++：31～50 mg/L，+++：>50 mg/L。
3 讨论
, 百拇医药
3.1 本法约有8%的假阳性，但作为过筛试验，我们认为可有较高的灵敏度，以免漏检。而LAT法虽无假阳性，但有23%的假阴性，且我们所作的203例样品中很少有+++的结果，表明该法的灵敏度较差。
3.2 FAT不仅试剂价廉、操作方便快速，且其敏感性高于LAT(见表1及其说明)。与CRP的RN的对比实验表明，CRP<10 mg/L的10例标本，FAT均呈阴性；CRP>10 mg/L的34例标本，FAT均呈阳性，且其阳性程度与CRP浓度呈正相关。可见FAT有较高的敏感性及准确性。大约11～30 mg/L为+，31～50 mg/L为++，>50 mg/L为+++。但这种关系只是大体上的估计，有条件者如有必要可对过筛试验阳性的样品再进一步作定量检测。但对大多数常规实验室，尤其是基层医院及门急诊化验室，FAT是一种可以替代LAT检测高于正常水平CRP的实用方法。
3.3 FAT是一种非特异的试验，结果受其它引起脂肪凝集的因素的影响，肝素及抗心磷脂抗体会使脂肪乳产生奶油聚集(creaming)。故不可用肝素抗凝血浆作为样品。抗心磷脂抗体一般病人达不到引起FAT阳性的浓度。肝素化治疗病人(50 U/kg/day)的血清样品也不会产生假阳性(2)。
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参考文献
[1]Burtis C A,Ashwood E R,Tietz Textbook of Chinical Chemistry 2nd ed. WB Saunders Comp，1994，713～714
[2]Richter D,Rohricht A M,Nurnberger W,et al.The fat emulision agglutination test:A reliable and cost effective alternative to the latex agglutination test for rapid bedside CRP measurement.Clin Chim Acta，1997，261：141
[3]Hulman G,Fuller M,Pearson H J,et al.An accurate,simple and rapid test for detecting elevated levels of C-reactive protein in serum by agglutination of fat emulsion.Clin Clim Acta，1986，156：337
(1998-11-16收稿，1999-03-26修回), 百拇医药
单位：江浦县中医院，江苏江浦211800
关键词：C-反应蛋白；脂肪乳剂；凝集试验
替代C 摘要 脂肪乳剂凝集试验可替代C-反应蛋白检测。在玻片上，将含有氯化钙的脂肪乳剂与病人血清混合，观察凝集反应。并将其结果与免疫化学法的胶乳凝集试验及速率浊度法比较。用本法与CRP胶乳凝集试验平行检测了203例临床标本，二者均呈阳性的43例，本法阳性而后者阴性的36例，速率浊度法对比试验了44份临床标本，结果速率浊度法超出正常上限的34份标本本法均阳性，阳性程度与浓度呈正相关；速率浊度法CRP<10 mg/L的10份标本，本法均呈阴性。初步结果表明，本法是一种替代检测CRP的简单、快速、敏感、可信和经济的方法，并且可半定量，适合常规实验室作过筛试验。
C-反应蛋白(CRP)是敏感的急性时相蛋白。在血清中显著增高见于细菌感染、损伤、外科手术、心肌梗塞、恶性肿瘤等。测定血清CRP，临床上常用于筛检器质性疾病，估价炎症疾病的活动性，检查治疗过程中的感染，监测肾同种移植受体排斥反应，特别是对儿科病人鉴别细菌与病毒感染更有价值(1，2)本文参考文献[1～3]，观察了替代CRP的脂肪乳剂凝集试验(FAT)。经临床应用，认为FAT简单、快速、经济，敏感性和准确性符合一般临床需要。作者参考Richtert[2]的方法，研究了最适条件，并作了某些改进，初步应用效果满意，现予报道。
, 百拇医药
原理：在钙离子存在下，CRP能与卵磷脂结合形成肉眼可见的“颗粒型”凝集反应。根据颗粒出现的时间长短和大小决定阳性程度。
1 材料与方法
1.1 检测对象 体检正常(小便、大便常规、血常规及临床检查正常)者100例。病毒性感冒初期30例；急性胰腺炎(治疗前)12例，慢性胰腺炎急性发作期12例，产后感染3例，细菌性痢疾4例，胆囊炎术后3例，上呼吸道细菌感染20例，慢性迁延性肝炎13例。
1.2 试剂
1.2.1 40 mmol/L氯化钙 准确称取444 mg无水氯化钙，加蒸馏水溶解并稀释至100 ml。
1.2.2 脂肪乳剂应用液 取脂肪乳剂注射液(无锡华瑞制药公司产品，商品名英脱利匹特，introlipid 20%)1份，加40 mmol/L氯化钙4份，混合，再加叠氮钠使其浓度达0.5 g/L，混匀，置4℃冰箱可用一年。为节省脂肪乳剂，可用临床输注后瓶中剩余部份配制。
, 百拇医药
1.3 方法
1.3.1 FAT操作步骤 在清洁干燥的载物玻片上，用精密移液器(上海求精玻璃仪器厂产)加10 μl待检血清，10 μl脂肪乳剂应用液，混匀，轻轻地水平方向摇动1 min。
结果观察与判断：1 min内出现凝集颗粒，并于2 min内逐渐形成粗大颗粒者为阳性(+++)；2 min内出现凝集颗粒，5 min内逐渐形成粗大颗粒者为阳性(++)；5 min内仅在乳浊状液体中出现细小凝集颗料者为阳性(+)；5 min内不出现凝集颗料，仍呈均一乳浊状者为阴性。
1.3.2 对比方法 CRP乳胶凝集试验(LAT)，用上海市医化所产试剂盒。速率浊度法(RN)CRP，用Beckman Array 360 System及其试剂盒(合校正品，参考值<10 mg/L)。均按说明书操作。
2 实验与结果
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2.1 FAT法最适条件的选择 CRP是与脂肪乳剂中的卵磷脂结合[3],此种现象是钙依赖性的。CaCl2浓度过高时,脂肪乳剂不稳定,易分层。将CaCl2配成20、30、40、50、60、70、80 mmol/L,分别对62例血清样品试验(其中5例为已知阳性样品)，按上法操作，阳性程度随CaCl2浓度增加而增加，40 mmol/L时阳性程度较高而乳剂又稳定。
NaN3因其防腐作用可增进乳剂的稳定性。国外文献[(2)]用0.2 g/L，我们改用0.5 g/L，具有更强的防腐稳定作用，经试验对结果无影响。
静脉脂肪乳剂与40 mmol/L CaCl2溶液按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6稀释，结果显示：稀释倍数过低，因乳剂过浓，弱阳性的凝集颗料在其中不易观察；稀释倍数过高，则反应速度太慢；结果以1∶4稀释较佳。
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2.2 FAT与LAT对比试验 203例各种样品同时用两法测定，结果见表1、表2。
表1 203例样品CRP的FAT和 LAT检测结果
方法
n
-
+
++
+++
FAT
LAT
203
203
, 百拇医药
124
160
27
41
40
2
12
0
2.3 各组标本检测结果见表2。 表2 各组CRP的FAT和LAT检测结果
分 组
n
FAT
LAT
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FAT
LAT
FAT
LAT
FAT
LAT
-
+
++
+++
健康者
100
93
, http://www.100md.com 100
7
0
0
0
0
0
病毒性感冒
30
27
30
3
0
0
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0
0
0
急性胰腺炎
18
0
0
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16
10
2
8
0
慢性胰腺炎
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12
0
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5
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3
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产后感染
3
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3
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0
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0
细菌性痢疾
4
0
3
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3
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0
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胆囊炎术后
3
0
1
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2
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1
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上呼吸道细菌性感染
20
4
, 百拇医药
8
11
12
5
0
0
0
慢性迁延性肝炎
13
0
8
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5
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0
0
0
2.4 FAT与RN法比较结果 选取CRP RN法浓度为12～178 mg/L的样品34份，<10 mg/L的样品10份，用FAT法检，结果见图1。
图1 FAT与CRP RN法比较结果
结果表明，本法与CRP RN法的关系大致为：-：<10 mg/L，+：11～30 mg/L，++：31～50 mg/L，+++：>50 mg/L。
3 讨论
, 百拇医药
3.1 本法约有8%的假阳性，但作为过筛试验，我们认为可有较高的灵敏度，以免漏检。而LAT法虽无假阳性，但有23%的假阴性，且我们所作的203例样品中很少有+++的结果，表明该法的灵敏度较差。
3.2 FAT不仅试剂价廉、操作方便快速，且其敏感性高于LAT(见表1及其说明)。与CRP的RN的对比实验表明，CRP<10 mg/L的10例标本，FAT均呈阴性；CRP>10 mg/L的34例标本，FAT均呈阳性，且其阳性程度与CRP浓度呈正相关。可见FAT有较高的敏感性及准确性。大约11～30 mg/L为+，31～50 mg/L为++，>50 mg/L为+++。但这种关系只是大体上的估计，有条件者如有必要可对过筛试验阳性的样品再进一步作定量检测。但对大多数常规实验室，尤其是基层医院及门急诊化验室，FAT是一种可以替代LAT检测高于正常水平CRP的实用方法。
3.3 FAT是一种非特异的试验，结果受其它引起脂肪凝集的因素的影响，肝素及抗心磷脂抗体会使脂肪乳产生奶油聚集(creaming)。故不可用肝素抗凝血浆作为样品。抗心磷脂抗体一般病人达不到引起FAT阳性的浓度。肝素化治疗病人(50 U/kg/day)的血清样品也不会产生假阳性(2)。
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参考文献
[1]Burtis C A,Ashwood E R,Tietz Textbook of Chinical Chemistry 2nd ed. WB Saunders Comp，1994，713～714
[2]Richter D,Rohricht A M,Nurnberger W,et al.The fat emulision agglutination test:A reliable and cost effective alternative to the latex agglutination test for rapid bedside CRP measurement.Clin Chim Acta，1997，261：141
[3]Hulman G,Fuller M,Pearson H J,et al.An accurate,simple and rapid test for detecting elevated levels of C-reactive protein in serum by agglutination of fat emulsion.Clin Clim Acta，1986，156：337
(1998-11-16收稿，1999-03-26修回), 百拇医药