油桐尺蠖核型多角体病毒DNA聚合酶基因的克隆和序列分析
作者：龚岷 李暐东 梁布锋
单位：中国科学院武汉病毒研究所，武汉 430071
关键词：油桐尺蠖核型多角体病毒；DNA聚合酶；PCR扩增；序列分析
中国病毒学000110 摘 要：用PCR方法从油桐尺蠖核型多角体病毒(BusuNPV)中扩增出DNA聚合酶基因片段，经pGEM-T载体克隆到大肠杆菌DH5α菌株中。经自动序列分析仪测出DNA聚合酶基因2379bp长的核苷酸序列，推导出793的氨基酸序列。氨基酸同源性比较显示，BusuNPV与HzSNPV的同源性最高，达57%；与OpMNPV的同源性最低，为39.6%。
分类号：Q78 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)01-0059-07
, http://www.100md.com
Cloning and Sequencing of the Buzura suppressaria
Nucleopolyhedrovirus DNA Polymerase Gene
GONG Min, LI Wei-dong, LIANG Bu-feng
(Wuhan Institute of Virology, Academia Sinica, Wuhan 430071, China)
Abstract：The DNA polymerase gene of Buzura suppressaria nucleopo lyhedrovirus (BusuNPV) was amplified by PCR using virus DNA template. The amplif ied fragment was cloned into E.colivia plasmid pGEM-T. The fragment of ins ert was analyzed on an automated DNA sequencer. Its sequence showed that the insert has 2 379 nucleotides in length and 793 aa was predicated. Comparing with ot her six members of Baculoviridae, amaino acid sequence of the DNA polymerase of BusuNPV has 57% similarity with HzSNPV, and 39.6% with OpMNPV.
, 百拇医药
Key words：Buzura suppressaria nucleopolyhedrovirus (BusuNP V); DNA polymerase; PCR amplification; Sequence analysis▲
油桐尺蠖是一种重要的农林作物害虫，危害遍及我国南方13个省的多种植物，包括油桐、茶 树、水杉、柑橘等。油桐尺蠖核型多角体病毒(Buzura suppressaria single nucleoc apsid NPV, BusuNPV)是其特异性病毒，在害虫的生物防治中取得了良好的社会效益和经济 效益。BusuNPV是我国特有的杆状病毒，其基因组为双链DNA，长约129kb。目前对BusuNPV 基因组进行了一系列研究，已完成了BusuNPV物理图谱的构建[1]，BusuNPV多角体 基因[2]、egt基因的测序[3]及50多种基因的定位和部分序列测定 [4]。杆状病毒DNA聚合酶基因所编码的DNA聚合酶是杆状病毒能正确和高效复制所需的 基本因子之一。BusuNPV的DNA聚合酶基因的研究，对于BusuNPV的复制机理的研究以及杆状 病毒系统分类工作有重要意义。本研究报道了BusuNPV的DNA聚合酶基因片段的克隆和序列分析，并与AcMNPV、BmNPV、CfMNPV、OpMNPV、HzSNPV、LdMNPV的氨基酸序列进行了同源性比较。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 病毒基因组DNA的制备
BusuNPV由本室提供。多角体粗悬液经差速离心、碱解、酚和氯仿抽提后，取上清加入2倍体 积的无水乙醇进行沉淀，沉淀经离心、空气干燥后，溶于TE中，-20℃保存备用。
1.2 酶类及试剂
TaqDNA聚合酶、dNTP及SalI、SphI限制性内切酶均为TaKaRa公司产品。T4DNA连接酶由Pro mega公司提供。
1.3 质粒和菌种
质粒pGEM-T为Promega公司产品。大肠杆菌DH5α由本室保存。
1.4 引物设计及PCR反应
, 百拇医药
根据已报道的AcMNPV[5]、CfMNPV[6]、LdMNPV[7]的DNA聚合 酶基因中的保守区域序列，设计出基因扩增引物。引物序列I：5′AACAGGGTGCATATGCAAA3′ ，引物序列II：5′TTTTAACCAACTAATTTT3′。
PCR反应条件：94℃ 1min、51℃ 1min、72℃ 2min，30个循环完成后72℃ 1 0min，取5μL PCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，溴化乙锭染色后在紫外灯下观察。
1.5 DNA聚合酶基因的分子克隆和序列测定
将PCR产物克隆于pGEM-T载体中，转化DH5α菌株，连接、转化和筛选重组子的工作均按文 献进行[8]。选取阳性重组子，在ABI377型全自动DNA序列分析仪上进行正、反两 个方向测序，所用的引物分别是T7引物和Sp6引物。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 BusuNPV DNA聚合酶基因的PCR扩增
对BusuNPV基因组DNA进行DNA聚合酶基因扩增后，产物经电泳检测，并与λDNA/HindⅢ标尺 进行比较，可见扩增带略大于2322bp(图1)。PCR产物经纯化、回收后，与pGEM-T载体 连接、转化，筛选获得阳性重组子，定名为pDNAP。对阳性重组子分别用SalI、SalI和SphI 进行单酶切及双酶切。双酶切后可切出一个与预期的扩增片段大小相符的片段。随后又对菌 落进行PCR筛选，在约2.4kb处可见一条明显扩增带，从而经一步确证了所克隆的片段即为 BusuNPV的DNA聚合酶基因(图2)。
图1 BusuNPV DNA聚合酶基因的 PCR扩增
, http://www.100md.com Fig.1 PCR amplification of BusuNPV DNA polymerase
1 λDNA/Hind Ⅲ Marker;
2.3 PCR product;
4 PCR negative control.
图2 重组质粒的酶切鉴定，PCR扩增
Fig.2 Restriction analysis, PCR
amplification of recombinant plasmid
1 λDNA/Hind Ⅲ Marker;
, 百拇医药
2 pDNAP SalI digest;
3 pDNAP SalI/SphI digest;
4 PCR product of pDNAP;
5 pGEM-T SalI digest.
2.2 BusuNPV DNA聚合酶基因序列测定及氨基酸同源性比较
质粒pDNAP在全自动DNA序列分析仪上进行正、反两个方向测序，测得2379bp长的核苷酸 序列(图3)。由此推导出其氨基酸序列(图4)，并与已报道的AcMNPV[5]、CfMNPV [6]、LdMNPV[7]、HzSNPV[9]、BmNPV[10]、OpMNPV [11]的氨基酸序列进行同源性比较(表1)。
, 百拇医药
图3 BusuNPV DNA聚合酶基因部分 核苷酸序列(2379bp)
Fig.3 Partial nucleotide sequence of BusuNPV DNA polymerase (2379bp)
图4 三种杆状病毒DNA聚合酶氨基 酸同源性
Fig.4 Alignment of amino acid sequence of the DNA polymerase gene of
BusuNPV, LdMNPV, AcMNPV, Black represents similarity of aa subgroup.
, 百拇医药
表1 杆状病毒DNA聚合酶氨基酸同源性比较
Table 1 Amino acid sequence similarity of baculovirus DNA polymerase
HzSNPV
LdMNPV
AcMNPV
BmNPV
CfMNPV
OpMNPV
BusuNPV
57
52.3
, 百拇医药
42.24
41.99
40.73
39.60
HzSNPV
56.38
45.96
46.09
44.27
42.97
LdMNPV
44.72
44.85
, 百拇医药
42.11
43.29
AcMNPV
96.80
64.81
66.27
BmNPV
64.72
66.18
CfMNPV
84.97
The values were derived from the GCG gap program and indicated as percen tage similarity
, 百拇医药
3 讨论
杆状病毒DNA聚合酶基因被认为是病毒复制所需要的基本因子之一，而不同的DNA聚合酶特异 性也可能与病毒的宿主范围和毒力有关[6]。该基因的结构与功能日益被人们所关 注，近年来已有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)、舞毒蛾核型多角体病毒(LdMNPV)、 家蚕核型多角体病毒(BmNPV)、云杉卷叶蛾核型多角体病毒(CfMNPV)、黄杉毒蛾核型多角体 病毒(OpMNPV)、美洲棉铃虫核型多角体病毒(HzSNPV)和中国棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV )[12]等杆状病毒的DNA聚合酶基因序列被研究。在它们的编码区内，有10个共同 的保守区域[11]。本研究所测定的编码区保守区域，与其他已报道的杆状病毒DN A聚合酶基因保守区域相吻合。这些保守区域也反映了不同杆状病毒在病毒复制时具有一些 共同的功能。
PCR技术用于克隆基因片段已显现出其独特的优越性。单条虫增殖的病毒材料就足以作为模 板，经PCR扩增后可以产生微克级的特异DNA片段，产物可以直接克隆到质粒载体上，免除了 杂交基因定位需经历的制作限制性内切酶图谱、杂交、克隆、亚克隆等一系列过程。作者选 用高保真的Taq酶，在10个保守区中，从第2至第10区，一次扩增出近2.4kb长片段，占整 个DNA聚合酶基因80%的区域，在这一区域中包含该蛋白的主要结构成分。迄今已有600多种 杆状病毒被分离，有关杆状病毒的分子分类工作日益受到关注，已有报道用多角体基因和eg t基因等非必需基因构建的分子进化树。相比较而言，DNA聚合酶基因是病毒进化中较早出现 的基因，属于病毒复制的必需基因，更能代表杆状病毒的本身属性。另外，该基因较长，为 多角体基因长度的4倍以上，在计算遗传距离时较后者更为精确，用于研究系统的分子进化 可能更为有利。■
, http://www.100md.com
基金项目：中国科学院生物区系分类资助的课题
作者简介：龚岷(1973-)，女，上海市人，硕士研究生，研究方向为基因工程及生物工程下游技术。
梁布锋(1947-)，男，广东省人，研究员，硕士，研究方向为病毒的生理生化。
参考文献：
[1]Liu MF, Hu ZH, Liang BF et al. Physical mapping of Buzuras uppressaria nuclear polyhedrosis virus genome [J]. Archives of Virology, 1993,128:357～362
[2]Hu ZH, Liu MF, Jin F et al. Nucleotide sequence of the Buzura suppr essaria single nucleocapsid nuclear polyhedrosis virus polyhedrin gene[J].Journal of General Virology, 1993,74:1617～1620
, 百拇医药
[3]Hu ZH, Broer R, Westerlaken J et al. Characterization of the ecdysteroid UDP glucosyltransferase gene of a single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus of Buzura suppressaria [J]. Virus Research 1997,47:91～97
[4]Hu ZH, Arif BM, Jin F et al. Distinct gene arrangement in the Buzur a suppressaria single-nucleocapsid nucleopolyhedrovirus genome[J].J Gen Virol, 1998, 79:2841～2851
[5]Tomalski MD, Wu JG, Miller LK et al. The location, sequence,transcription, and regulation of a baculovirus DNA polymerase gene[J].Virology, 1988 ,167:591～600
, 百拇医药
[6]Liu JJ, Carstens EB. Identificationn, location, transcription, and sequence analysis of the Choristoneura fumiferana nuclear polyhedrosis virus DNA polymerase gene[J].Virology, 1995,209:538～549
[7]Bjornson RM, Glocker B, Rohrmann GF et al. Characterization of the nucleotide sequence of the Lymantria dispar nuclear polyhedrosis virus DNA polymerase gene region [J]. J Gen Virol, 1992, 73:3177～3183
[8]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al. Molecular Cloning: alabora tory manual [M]. 2nd ed. USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.
, 百拇医药
[9]Cowan P, Bulach D, Goodge K et al. Complete sequence of Helicoverpa zea nuclear polyhedrosis virus in GenBank database. 1994(accession numbers: V 11242)
[10]Chaerchomsri S, Ikeda M, Kobayashi M et al. Nucleotide sequence and transcription analysis of the DNA polymerase gene of Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus [J].Virology, 1995,206:437～447
[11]Ahrens CH, Rohrmann GF. The DNA polymerase and helicase genes of a bacu lovirus of Orgyia pseudotsugata[J]. J Gen Virol, 1996,77:825～837
[12]王根，张传溪，季平等.中国棉铃虫核型多角体病毒DNA聚合酶基因的克隆和序列分析[J].中国病毒学，1998，13(1)：77～82
收稿日期：1999-05-04
修稿日期：1999-07-09, http://www.100md.com
单位：中国科学院武汉病毒研究所，武汉 430071
关键词：油桐尺蠖核型多角体病毒；DNA聚合酶；PCR扩增；序列分析
中国病毒学000110 摘 要：用PCR方法从油桐尺蠖核型多角体病毒(BusuNPV)中扩增出DNA聚合酶基因片段，经pGEM-T载体克隆到大肠杆菌DH5α菌株中。经自动序列分析仪测出DNA聚合酶基因2379bp长的核苷酸序列，推导出793的氨基酸序列。氨基酸同源性比较显示，BusuNPV与HzSNPV的同源性最高，达57%；与OpMNPV的同源性最低，为39.6%。
分类号：Q78 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)01-0059-07
, http://www.100md.com
Cloning and Sequencing of the Buzura suppressaria
Nucleopolyhedrovirus DNA Polymerase Gene
GONG Min, LI Wei-dong, LIANG Bu-feng
(Wuhan Institute of Virology, Academia Sinica, Wuhan 430071, China)
Abstract：The DNA polymerase gene of Buzura suppressaria nucleopo lyhedrovirus (BusuNPV) was amplified by PCR using virus DNA template. The amplif ied fragment was cloned into E.colivia plasmid pGEM-T. The fragment of ins ert was analyzed on an automated DNA sequencer. Its sequence showed that the insert has 2 379 nucleotides in length and 793 aa was predicated. Comparing with ot her six members of Baculoviridae, amaino acid sequence of the DNA polymerase of BusuNPV has 57% similarity with HzSNPV, and 39.6% with OpMNPV.
, 百拇医药
Key words：Buzura suppressaria nucleopolyhedrovirus (BusuNP V); DNA polymerase; PCR amplification; Sequence analysis▲
油桐尺蠖是一种重要的农林作物害虫，危害遍及我国南方13个省的多种植物，包括油桐、茶 树、水杉、柑橘等。油桐尺蠖核型多角体病毒(Buzura suppressaria single nucleoc apsid NPV, BusuNPV)是其特异性病毒，在害虫的生物防治中取得了良好的社会效益和经济 效益。BusuNPV是我国特有的杆状病毒，其基因组为双链DNA，长约129kb。目前对BusuNPV 基因组进行了一系列研究，已完成了BusuNPV物理图谱的构建[1]，BusuNPV多角体 基因[2]、egt基因的测序[3]及50多种基因的定位和部分序列测定 [4]。杆状病毒DNA聚合酶基因所编码的DNA聚合酶是杆状病毒能正确和高效复制所需的 基本因子之一。BusuNPV的DNA聚合酶基因的研究，对于BusuNPV的复制机理的研究以及杆状 病毒系统分类工作有重要意义。本研究报道了BusuNPV的DNA聚合酶基因片段的克隆和序列分析，并与AcMNPV、BmNPV、CfMNPV、OpMNPV、HzSNPV、LdMNPV的氨基酸序列进行了同源性比较。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 病毒基因组DNA的制备
BusuNPV由本室提供。多角体粗悬液经差速离心、碱解、酚和氯仿抽提后，取上清加入2倍体 积的无水乙醇进行沉淀，沉淀经离心、空气干燥后，溶于TE中，-20℃保存备用。
1.2 酶类及试剂
TaqDNA聚合酶、dNTP及SalI、SphI限制性内切酶均为TaKaRa公司产品。T4DNA连接酶由Pro mega公司提供。
1.3 质粒和菌种
质粒pGEM-T为Promega公司产品。大肠杆菌DH5α由本室保存。
1.4 引物设计及PCR反应
, 百拇医药
根据已报道的AcMNPV[5]、CfMNPV[6]、LdMNPV[7]的DNA聚合 酶基因中的保守区域序列，设计出基因扩增引物。引物序列I：5′AACAGGGTGCATATGCAAA3′ ，引物序列II：5′TTTTAACCAACTAATTTT3′。
PCR反应条件：94℃ 1min、51℃ 1min、72℃ 2min，30个循环完成后72℃ 1 0min，取5μL PCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，溴化乙锭染色后在紫外灯下观察。
1.5 DNA聚合酶基因的分子克隆和序列测定
将PCR产物克隆于pGEM-T载体中，转化DH5α菌株，连接、转化和筛选重组子的工作均按文 献进行[8]。选取阳性重组子，在ABI377型全自动DNA序列分析仪上进行正、反两 个方向测序，所用的引物分别是T7引物和Sp6引物。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 BusuNPV DNA聚合酶基因的PCR扩增
对BusuNPV基因组DNA进行DNA聚合酶基因扩增后，产物经电泳检测，并与λDNA/HindⅢ标尺 进行比较，可见扩增带略大于2322bp(图1)。PCR产物经纯化、回收后，与pGEM-T载体 连接、转化，筛选获得阳性重组子，定名为pDNAP。对阳性重组子分别用SalI、SalI和SphI 进行单酶切及双酶切。双酶切后可切出一个与预期的扩增片段大小相符的片段。随后又对菌 落进行PCR筛选，在约2.4kb处可见一条明显扩增带，从而经一步确证了所克隆的片段即为 BusuNPV的DNA聚合酶基因(图2)。
图1 BusuNPV DNA聚合酶基因的 PCR扩增
, http://www.100md.com Fig.1 PCR amplification of BusuNPV DNA polymerase
1 λDNA/Hind Ⅲ Marker;
2.3 PCR product;
4 PCR negative control.
图2 重组质粒的酶切鉴定，PCR扩增
Fig.2 Restriction analysis, PCR
amplification of recombinant plasmid
1 λDNA/Hind Ⅲ Marker;
, 百拇医药
2 pDNAP SalI digest;
3 pDNAP SalI/SphI digest;
4 PCR product of pDNAP;
5 pGEM-T SalI digest.
2.2 BusuNPV DNA聚合酶基因序列测定及氨基酸同源性比较
质粒pDNAP在全自动DNA序列分析仪上进行正、反两个方向测序，测得2379bp长的核苷酸 序列(图3)。由此推导出其氨基酸序列(图4)，并与已报道的AcMNPV[5]、CfMNPV [6]、LdMNPV[7]、HzSNPV[9]、BmNPV[10]、OpMNPV [11]的氨基酸序列进行同源性比较(表1)。
, 百拇医药
图3 BusuNPV DNA聚合酶基因部分 核苷酸序列(2379bp)
Fig.3 Partial nucleotide sequence of BusuNPV DNA polymerase (2379bp)
图4 三种杆状病毒DNA聚合酶氨基 酸同源性
Fig.4 Alignment of amino acid sequence of the DNA polymerase gene of
BusuNPV, LdMNPV, AcMNPV, Black represents similarity of aa subgroup.
, 百拇医药
表1 杆状病毒DNA聚合酶氨基酸同源性比较
Table 1 Amino acid sequence similarity of baculovirus DNA polymerase
HzSNPV
LdMNPV
AcMNPV
BmNPV
CfMNPV
OpMNPV
BusuNPV
57
52.3
, 百拇医药
42.24
41.99
40.73
39.60
HzSNPV
56.38
45.96
46.09
44.27
42.97
LdMNPV
44.72
44.85
, 百拇医药
42.11
43.29
AcMNPV
96.80
64.81
66.27
BmNPV
64.72
66.18
CfMNPV
84.97
The values were derived from the GCG gap program and indicated as percen tage similarity
, 百拇医药
3 讨论
杆状病毒DNA聚合酶基因被认为是病毒复制所需要的基本因子之一，而不同的DNA聚合酶特异 性也可能与病毒的宿主范围和毒力有关[6]。该基因的结构与功能日益被人们所关 注，近年来已有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)、舞毒蛾核型多角体病毒(LdMNPV)、 家蚕核型多角体病毒(BmNPV)、云杉卷叶蛾核型多角体病毒(CfMNPV)、黄杉毒蛾核型多角体 病毒(OpMNPV)、美洲棉铃虫核型多角体病毒(HzSNPV)和中国棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV )[12]等杆状病毒的DNA聚合酶基因序列被研究。在它们的编码区内，有10个共同 的保守区域[11]。本研究所测定的编码区保守区域，与其他已报道的杆状病毒DN A聚合酶基因保守区域相吻合。这些保守区域也反映了不同杆状病毒在病毒复制时具有一些 共同的功能。
PCR技术用于克隆基因片段已显现出其独特的优越性。单条虫增殖的病毒材料就足以作为模 板，经PCR扩增后可以产生微克级的特异DNA片段，产物可以直接克隆到质粒载体上，免除了 杂交基因定位需经历的制作限制性内切酶图谱、杂交、克隆、亚克隆等一系列过程。作者选 用高保真的Taq酶，在10个保守区中，从第2至第10区，一次扩增出近2.4kb长片段，占整 个DNA聚合酶基因80%的区域，在这一区域中包含该蛋白的主要结构成分。迄今已有600多种 杆状病毒被分离，有关杆状病毒的分子分类工作日益受到关注，已有报道用多角体基因和eg t基因等非必需基因构建的分子进化树。相比较而言，DNA聚合酶基因是病毒进化中较早出现 的基因，属于病毒复制的必需基因，更能代表杆状病毒的本身属性。另外，该基因较长，为 多角体基因长度的4倍以上，在计算遗传距离时较后者更为精确，用于研究系统的分子进化 可能更为有利。■
, http://www.100md.com
基金项目：中国科学院生物区系分类资助的课题
作者简介：龚岷(1973-)，女，上海市人，硕士研究生，研究方向为基因工程及生物工程下游技术。
梁布锋(1947-)，男，广东省人，研究员，硕士，研究方向为病毒的生理生化。
参考文献：
[1]Liu MF, Hu ZH, Liang BF et al. Physical mapping of Buzuras uppressaria nuclear polyhedrosis virus genome [J]. Archives of Virology, 1993,128:357～362
[2]Hu ZH, Liu MF, Jin F et al. Nucleotide sequence of the Buzura suppr essaria single nucleocapsid nuclear polyhedrosis virus polyhedrin gene[J].Journal of General Virology, 1993,74:1617～1620
, 百拇医药
[3]Hu ZH, Broer R, Westerlaken J et al. Characterization of the ecdysteroid UDP glucosyltransferase gene of a single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus of Buzura suppressaria [J]. Virus Research 1997,47:91～97
[4]Hu ZH, Arif BM, Jin F et al. Distinct gene arrangement in the Buzur a suppressaria single-nucleocapsid nucleopolyhedrovirus genome[J].J Gen Virol, 1998, 79:2841～2851
[5]Tomalski MD, Wu JG, Miller LK et al. The location, sequence,transcription, and regulation of a baculovirus DNA polymerase gene[J].Virology, 1988 ,167:591～600
, 百拇医药
[6]Liu JJ, Carstens EB. Identificationn, location, transcription, and sequence analysis of the Choristoneura fumiferana nuclear polyhedrosis virus DNA polymerase gene[J].Virology, 1995,209:538～549
[7]Bjornson RM, Glocker B, Rohrmann GF et al. Characterization of the nucleotide sequence of the Lymantria dispar nuclear polyhedrosis virus DNA polymerase gene region [J]. J Gen Virol, 1992, 73:3177～3183
[8]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al. Molecular Cloning: alabora tory manual [M]. 2nd ed. USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.
, 百拇医药
[9]Cowan P, Bulach D, Goodge K et al. Complete sequence of Helicoverpa zea nuclear polyhedrosis virus in GenBank database. 1994(accession numbers: V 11242)
[10]Chaerchomsri S, Ikeda M, Kobayashi M et al. Nucleotide sequence and transcription analysis of the DNA polymerase gene of Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus [J].Virology, 1995,206:437～447
[11]Ahrens CH, Rohrmann GF. The DNA polymerase and helicase genes of a bacu lovirus of Orgyia pseudotsugata[J]. J Gen Virol, 1996,77:825～837
[12]王根，张传溪，季平等.中国棉铃虫核型多角体病毒DNA聚合酶基因的克隆和序列分析[J].中国病毒学，1998，13(1)：77～82
收稿日期：1999-05-04
修稿日期：1999-07-09, http://www.100md.com