斜纹夜蛾核型多角体病毒p74基因的克隆和序列分析
作者：杨洁 龙綮新 吴文言 王珣章
单位：杨洁(第一军医大学南方医院传染科，广州 510515)；龙綮新 吴文言 王珣章(中山大学昆虫所，生物防治国家重点实验室，广州 510275)
关键词：斜纹夜蛾核型多角体病毒(spltNPV)；p74基因；基因克隆；序列测定
中国病毒学000108 摘 要：用AcNPV p74基因3′端的1.4kb片段，通过Southern blotting将SpltNPV的p74基因定位于XhoI(4 .9kb)、EcoRI(4.4kb)、BamHI(3.0kb)片段上。进一步用ExoⅢ和构建亚克隆测序法， 对长2545bp的p74基因进行了序列分析，其中1974bp的编码区编码658个氨基酸，蛋白分子量约75.87kD，其编码蛋白与AcMNPV和CfMNPV p74蛋白的氨基酸序列同源性分别为64%和63%。
, 百拇医药
分类号：Q7.756 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)01-0045-07
Sequencing of the p74 Gene of Spodoptera litura
Multinucleocapcid Polyhedrosis Virus
YANG Jie, LONG Qing-xin, WU Wen-yan, WANG Xun-zhang
(Institute of Entomology and State Key Laboratory for Biological Control,Zhongshan University, Guangzhou 510275, China)
, 百拇医药
Abstract：The p74 gene of SpltNPV was loc ated at EcoRI-4.4 kb，XhoI-4.9 kb and BamHI-3.0 kb fragments by Southern blot ting with AcMNP V-derived probe. After cloning of the three fragments, restriction enzyme analysis was used to construct their restriction map. A region of 2545 bp including p74 gene of SpltNPV was sequenced. The open reading frame of SpltNPV p74 gene was decided to be 1974 bp long, which codes 658 aminoacids. Comparison of the homology with other baculovirus p74 genes shows that SpltNPV p74 is 64% and 63% identical to that of AcMNPV and CfMNPV at the amino acid level.
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Key words：SpltNPV; p74 gene; Gene cloning; Sequencing▲
昆虫杆状病毒作为一种无公害生物杀虫剂越来越得到广泛的应用，但是昆虫杆状病毒的宿主专一性较强，杀虫谱较窄，已成为限制其更广泛应用的一个重要因素。如何扩大其宿主范围，提高毒力，是应用杆状病毒防治害虫所面临的重大课题。p74基因作为与昆虫杆状病毒侵染力有关的基因，其基因产物与杆状病毒在感染昆虫幼虫时与中肠的特异性吸附有关[1，2]，这种吸附可能具有种的专一性，因而p74基因可能是决定杆状病毒宿主专一性的一个重要因素。所以研究不同杆状病毒之间p74基因的结构及功能的异同，具有重要的意义。斜纹夜蛾(Spodoptera litura)是危害多种农作物的重要害虫，主要分布于中国南部、 东南亚地区和日本西南部。本研究在斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura nuc lear polyhedrosis virus, SpltNPV) p74基因定位的基础上进 行序列分析，并将所测序列与苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multinucleocapsid nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV)和枞色卷蛾核型多角体病毒( Choristoneura fumiferana multinucleocapsid nuclear polyhedrosis virus, CfMNPV) [3]的p74基因进行了核苷酸同源性和编码蛋白的氨基 酸序列同源性比较。
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1 材料与方法
1.1 病毒、菌株和质粒
斜纹夜蛾核型多角体病毒中山大学分离株(Zhongshan University isolate, ZSU)[4 ]由本室保存，苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒由美国加州大学Federici B.A.教授提供， 载体质粒用pBluescript M13(-)和pUC18，受体菌株为E.coli DH5α。
1.2 病毒基因组DNA的制备
参考Summers M.D.和Smith G.E.的方法[5]，从病毒多角体中提取病毒基因组DNA 。
1.3 核酸杂交探针的制备
由于AcMNPV的EcoRI-P片段含有大部分p74基因(2.0kb)[ 6]，遂用pBluscript M13(-)克隆该片段，并经EcoRI和HindⅢ双酶切回收含p74基因3′端的1.4kb片段。按Boeringer Mannheim Biochemica公司的‘ DIG DNA Labeling and Detection kit’说明书标记探针。
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1.4 Southern blotting及杂交片段的克隆
用上述标记的探针在宽松条件下(5×SSC,56℃，无甲酰氨)与SpltNPV基因组DNA的EcoRI、 BamHI和XhoI酶切片段杂交，按试剂盒说明进行显色。然后用pBluescipt M13(-)和pUC18克 隆阳性片段。具体方法参考文献[7]。克隆有杂交片段的质粒分别命名为pBluep74-E、pB 1up74-B、pBlueP74-X。
1.5 DNA序列分析及同源性比较
1.5.1 构建双链连续测序模板
参照Pharmacia公司Double-stranded Nested Deletion Kit说明，使用BstXI和SmaI对质粒 pBluep74-E双酶切，然后用ExoⅢ消化(75mmol/L NaCl, 30℃)每3min取样一次，S1 核酸酶去除单链DNA，终止反应，T4连接酶自连，转化筛选。
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1.5.2 双链DNA序列分析及同源性比较
参照Pharmacia公司双链T7 DNA序列分析Kit推荐的方法，进行序列分析，并应用计算机软件 DNASIS、PROSIS，将所测序列与其它两种杆状病毒的p74基因及 其推导的氨基酸序列进行同源性比较。
2 结果与讨论
2.1 SpltNPV p74基因的定位、克隆及酶切分析
以地高辛标记的AcMNPV p74基因为探针，与SpltNPV基因组酶切 片段进行杂交，结果表明，阳性带分别为SpltNPV基因组DNA EcoRI 4.4kb、XhoI 4.9kb 、BamHI 3.0kb片段。将这三个片段分别克隆后用内切酶进行酶切分析，以确定其相对位 置，结果显示，三个片段都含有0.95kb的BamHI和EcoRI片段的共同部分，提示AcMNPV的p74基因探针与这三个片段都是特异性杂交。我们先测出这0.95 kb片段的序列，以确定p74基因的精确位置及编码方向。将质粒p Bluep74-E用ExoⅢ构建双链连续测序模板，利用T7 primer从一端进行连续测序。
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2.2 SpltNPV p74基因的序列测定
根据上述结果对EcoRI 4.4kb片段进行双链DNA序列分析，所测序列长2545bp。对该序 列进行读码框分析，结果推测SpltNPV p74基因编码区为222～2195nt，编码658个氨基酸(图1)，分子量为75.87kD。比AcMNPV和CfMNPV的P74蛋白多 12个氨 基酸。分析结果显示，SpltNPV的p74基因符合Kozak规则，即ATTATGA。该基因含有杆状病毒典型晚期启动子特征序列，即DTAAG(D代表A、T或G)序列[8～10]。和AcMNPV p74基因一样[2]，SpltNPV的TTAAG距起始密码子很近，只有9个核苷酸，前者为11个 核苷酸。此外，SpltNPV的p74基因又具有早期启动子元件——TA TA和早期启动子5′加帽位点——CAGT[10，11]。在SpltNPV的p7 4基因的3′端部分，有典型的poly(A)加尾信号AATAAA。
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图1a SpltNPV p74[ WTBZ]基因的部分测序照片
Fig.1a Sequencing of partial SpltNPV p74 gene
1, 2, and 3: sequencing for the first loading;
1′, 2′, and 3′: sequencing for the second loading.
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图1b SpltNPV p74[ W TBZ]基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列，下划线的部分为可能的转录起始和终 止信号。
Fig.1b Nucleotide sequence of SpltNPV p74 gene and amin o acide sequence it coded,the underlined parts show the TATA Box, the posible initiation site and the term ination site.
2.3 SpltNPV与AcMNPV和CfMNPV的p74基因及其编码 蛋白的同源性比较
应用计算机软件PROSIS，将SpltNPV p74基因分别与AcMNPV、CfM NPV、OpMNPV和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus, BmNP V) (GenBank 133180)的p74基因及其推导的编码蛋白进行了同源性比较，结果 表明，SpltNPV p74基因推导的编码蛋白与AcMNPV、CfMNPV、OpM NPV、BmNPV p74基因编码蛋白同源性分别为64%、63%、64%和63% 。N-端及中间区域的氨基酸同源性较高，有些区域连续几十个氨基酸的同源性在90%以上， 这些区域的高保守性很可能与其结构和功能有密切关系。值得注意的是已发表的p74基因所编码蛋白的氨基酸在它们靠N-端和中间部分都有很高的同源性， 在其C-端则同源性较低[2，3]。SpltNPV p74基因 的编码蛋白也有这种现象，鉴于p74基因产物很可能与昆虫杆状 病毒在感染昆虫幼虫时对中肠的吸附有关[2，5，8]，这种吸附可能具有种的特 异性，因而可以设想p74基因的这些特异区域可能在某种程度上 决定不同杆状病毒对昆虫中肠吸附的宿主专一性。■
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基金项目：由国家自然科学基金重点项目(39730030)资助
作者简介：杨洁(1970-)，男，湖北广水人。助理研究员，硕士，1992年武汉大学病毒系 本科毕业。研究方向生物工程。曾获军队科技进步二等奖。
参考文献：
[1]Leisy D J, Rohrmann G F, Nesson M et al. Nucleotide sequence and transcriptional mapping of the Orgyia pseudotsugata multicapsid nuclear polyhed rosis virus p10 gene [J]. Virology, 1986, 153:157～167
[2]Kuzio J, Jaques R, Faulkner P. Identification of p74, agene essential for virulence of baculovirus occlusion bodies [J]. Virology, 1989,173:759～763
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[3]Hill J E, Kuzio J, Wilson J A et al. Nucleotide sequence of the p74 gene of a baculovirus pathogenic to the spruce budworm, Choristoneura fumiferana multicapsid nuclear polyhedrosis virus [J]. Bioch & Biophy Acta, 1993,1172:187～18 9
[4]中山大学昆虫专业昆虫病毒研究组.斜纹夜蛾核型多角体病毒的初步研究[J].中山大学学报(自然科学版)，1976，3：92～97
[5]Summers M D Smith G E. A manual of methods for baculovirus vectors and in sect cell culture procedures [M]. 1987.
, 百拇医药
[6]Kool M, Valk J M. The structural and functionnal organization of the Autogr apha californica polyhedrosis virus genome [J]. Arch Virol, 1993,130:1～16
[7]Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manu al [M], 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
[8]Wilsm M E,Mainprize T H, Fiesen P D et al. Location, translation and sequence of a baculovirus gene encoding a small arginine-rich polypepitide[J].J Virol, 1987,61:661～666
, 百拇医药
[9]Thiem S M, Miller L K. Identification, sequence, and transcriptional mapping of the major capsid protein gene of the baculovirus Autographa californic a nuclear polyhedrosis virus [J]. J Virol, 1989,63:2008～2018
[10]Ahrens C H, Russell R L Q, Funk C J et al. The Sequence of Orgyia pseudotsugata multinucleocapsid nuclear polyhedrosis virus genome[J].Virol, 1997,229:381～399
[11]Ayres M D, Howard S C, Kuzio J et al. The complete DNA sequence of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus[J]. Virol, 1994,202:586～605
收稿日期：1998-08-28
修稿日期：1998-11-06, 百拇医药
单位：杨洁(第一军医大学南方医院传染科，广州 510515)；龙綮新 吴文言 王珣章(中山大学昆虫所，生物防治国家重点实验室，广州 510275)
关键词：斜纹夜蛾核型多角体病毒(spltNPV)；p74基因；基因克隆；序列测定
中国病毒学000108 摘 要：用AcNPV p74基因3′端的1.4kb片段，通过Southern blotting将SpltNPV的p74基因定位于XhoI(4 .9kb)、EcoRI(4.4kb)、BamHI(3.0kb)片段上。进一步用ExoⅢ和构建亚克隆测序法， 对长2545bp的p74基因进行了序列分析，其中1974bp的编码区编码658个氨基酸，蛋白分子量约75.87kD，其编码蛋白与AcMNPV和CfMNPV p74蛋白的氨基酸序列同源性分别为64%和63%。
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分类号：Q7.756 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)01-0045-07
Sequencing of the p74 Gene of Spodoptera litura
Multinucleocapcid Polyhedrosis Virus
YANG Jie, LONG Qing-xin, WU Wen-yan, WANG Xun-zhang
(Institute of Entomology and State Key Laboratory for Biological Control,Zhongshan University, Guangzhou 510275, China)
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Abstract：The p74 gene of SpltNPV was loc ated at EcoRI-4.4 kb，XhoI-4.9 kb and BamHI-3.0 kb fragments by Southern blot ting with AcMNP V-derived probe. After cloning of the three fragments, restriction enzyme analysis was used to construct their restriction map. A region of 2545 bp including p74 gene of SpltNPV was sequenced. The open reading frame of SpltNPV p74 gene was decided to be 1974 bp long, which codes 658 aminoacids. Comparison of the homology with other baculovirus p74 genes shows that SpltNPV p74 is 64% and 63% identical to that of AcMNPV and CfMNPV at the amino acid level.
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Key words：SpltNPV; p74 gene; Gene cloning; Sequencing▲
昆虫杆状病毒作为一种无公害生物杀虫剂越来越得到广泛的应用，但是昆虫杆状病毒的宿主专一性较强，杀虫谱较窄，已成为限制其更广泛应用的一个重要因素。如何扩大其宿主范围，提高毒力，是应用杆状病毒防治害虫所面临的重大课题。p74基因作为与昆虫杆状病毒侵染力有关的基因，其基因产物与杆状病毒在感染昆虫幼虫时与中肠的特异性吸附有关[1，2]，这种吸附可能具有种的专一性，因而p74基因可能是决定杆状病毒宿主专一性的一个重要因素。所以研究不同杆状病毒之间p74基因的结构及功能的异同，具有重要的意义。斜纹夜蛾(Spodoptera litura)是危害多种农作物的重要害虫，主要分布于中国南部、 东南亚地区和日本西南部。本研究在斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura nuc lear polyhedrosis virus, SpltNPV) p74基因定位的基础上进 行序列分析，并将所测序列与苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multinucleocapsid nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV)和枞色卷蛾核型多角体病毒( Choristoneura fumiferana multinucleocapsid nuclear polyhedrosis virus, CfMNPV) [3]的p74基因进行了核苷酸同源性和编码蛋白的氨基 酸序列同源性比较。
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1 材料与方法
1.1 病毒、菌株和质粒
斜纹夜蛾核型多角体病毒中山大学分离株(Zhongshan University isolate, ZSU)[4 ]由本室保存，苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒由美国加州大学Federici B.A.教授提供， 载体质粒用pBluescript M13(-)和pUC18，受体菌株为E.coli DH5α。
1.2 病毒基因组DNA的制备
参考Summers M.D.和Smith G.E.的方法[5]，从病毒多角体中提取病毒基因组DNA 。
1.3 核酸杂交探针的制备
由于AcMNPV的EcoRI-P片段含有大部分p74基因(2.0kb)[ 6]，遂用pBluscript M13(-)克隆该片段，并经EcoRI和HindⅢ双酶切回收含p74基因3′端的1.4kb片段。按Boeringer Mannheim Biochemica公司的‘ DIG DNA Labeling and Detection kit’说明书标记探针。
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1.4 Southern blotting及杂交片段的克隆
用上述标记的探针在宽松条件下(5×SSC,56℃，无甲酰氨)与SpltNPV基因组DNA的EcoRI、 BamHI和XhoI酶切片段杂交，按试剂盒说明进行显色。然后用pBluescipt M13(-)和pUC18克 隆阳性片段。具体方法参考文献[7]。克隆有杂交片段的质粒分别命名为pBluep74-E、pB 1up74-B、pBlueP74-X。
1.5 DNA序列分析及同源性比较
1.5.1 构建双链连续测序模板
参照Pharmacia公司Double-stranded Nested Deletion Kit说明，使用BstXI和SmaI对质粒 pBluep74-E双酶切，然后用ExoⅢ消化(75mmol/L NaCl, 30℃)每3min取样一次，S1 核酸酶去除单链DNA，终止反应，T4连接酶自连，转化筛选。
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1.5.2 双链DNA序列分析及同源性比较
参照Pharmacia公司双链T7 DNA序列分析Kit推荐的方法，进行序列分析，并应用计算机软件 DNASIS、PROSIS，将所测序列与其它两种杆状病毒的p74基因及 其推导的氨基酸序列进行同源性比较。
2 结果与讨论
2.1 SpltNPV p74基因的定位、克隆及酶切分析
以地高辛标记的AcMNPV p74基因为探针，与SpltNPV基因组酶切 片段进行杂交，结果表明，阳性带分别为SpltNPV基因组DNA EcoRI 4.4kb、XhoI 4.9kb 、BamHI 3.0kb片段。将这三个片段分别克隆后用内切酶进行酶切分析，以确定其相对位 置，结果显示，三个片段都含有0.95kb的BamHI和EcoRI片段的共同部分，提示AcMNPV的p74基因探针与这三个片段都是特异性杂交。我们先测出这0.95 kb片段的序列，以确定p74基因的精确位置及编码方向。将质粒p Bluep74-E用ExoⅢ构建双链连续测序模板，利用T7 primer从一端进行连续测序。
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2.2 SpltNPV p74基因的序列测定
根据上述结果对EcoRI 4.4kb片段进行双链DNA序列分析，所测序列长2545bp。对该序 列进行读码框分析，结果推测SpltNPV p74基因编码区为222～2195nt，编码658个氨基酸(图1)，分子量为75.87kD。比AcMNPV和CfMNPV的P74蛋白多 12个氨 基酸。分析结果显示，SpltNPV的p74基因符合Kozak规则，即ATTATGA。该基因含有杆状病毒典型晚期启动子特征序列，即DTAAG(D代表A、T或G)序列[8～10]。和AcMNPV p74基因一样[2]，SpltNPV的TTAAG距起始密码子很近，只有9个核苷酸，前者为11个 核苷酸。此外，SpltNPV的p74基因又具有早期启动子元件——TA TA和早期启动子5′加帽位点——CAGT[10，11]。在SpltNPV的p7 4基因的3′端部分，有典型的poly(A)加尾信号AATAAA。
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图1a SpltNPV p74[ WTBZ]基因的部分测序照片
Fig.1a Sequencing of partial SpltNPV p74 gene
1, 2, and 3: sequencing for the first loading;
1′, 2′, and 3′: sequencing for the second loading.
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图1b SpltNPV p74[ W TBZ]基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列，下划线的部分为可能的转录起始和终 止信号。
Fig.1b Nucleotide sequence of SpltNPV p74 gene and amin o acide sequence it coded,the underlined parts show the TATA Box, the posible initiation site and the term ination site.
2.3 SpltNPV与AcMNPV和CfMNPV的p74基因及其编码 蛋白的同源性比较
应用计算机软件PROSIS，将SpltNPV p74基因分别与AcMNPV、CfM NPV、OpMNPV和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus, BmNP V) (GenBank 133180)的p74基因及其推导的编码蛋白进行了同源性比较，结果 表明，SpltNPV p74基因推导的编码蛋白与AcMNPV、CfMNPV、OpM NPV、BmNPV p74基因编码蛋白同源性分别为64%、63%、64%和63% 。N-端及中间区域的氨基酸同源性较高，有些区域连续几十个氨基酸的同源性在90%以上， 这些区域的高保守性很可能与其结构和功能有密切关系。值得注意的是已发表的p74基因所编码蛋白的氨基酸在它们靠N-端和中间部分都有很高的同源性， 在其C-端则同源性较低[2，3]。SpltNPV p74基因 的编码蛋白也有这种现象，鉴于p74基因产物很可能与昆虫杆状 病毒在感染昆虫幼虫时对中肠的吸附有关[2，5，8]，这种吸附可能具有种的特 异性，因而可以设想p74基因的这些特异区域可能在某种程度上 决定不同杆状病毒对昆虫中肠吸附的宿主专一性。■
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基金项目：由国家自然科学基金重点项目(39730030)资助
作者简介：杨洁(1970-)，男，湖北广水人。助理研究员，硕士，1992年武汉大学病毒系 本科毕业。研究方向生物工程。曾获军队科技进步二等奖。
参考文献：
[1]Leisy D J, Rohrmann G F, Nesson M et al. Nucleotide sequence and transcriptional mapping of the Orgyia pseudotsugata multicapsid nuclear polyhed rosis virus p10 gene [J]. Virology, 1986, 153:157～167
[2]Kuzio J, Jaques R, Faulkner P. Identification of p74, agene essential for virulence of baculovirus occlusion bodies [J]. Virology, 1989,173:759～763
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[3]Hill J E, Kuzio J, Wilson J A et al. Nucleotide sequence of the p74 gene of a baculovirus pathogenic to the spruce budworm, Choristoneura fumiferana multicapsid nuclear polyhedrosis virus [J]. Bioch & Biophy Acta, 1993,1172:187～18 9
[4]中山大学昆虫专业昆虫病毒研究组.斜纹夜蛾核型多角体病毒的初步研究[J].中山大学学报(自然科学版)，1976，3：92～97
[5]Summers M D Smith G E. A manual of methods for baculovirus vectors and in sect cell culture procedures [M]. 1987.
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[6]Kool M, Valk J M. The structural and functionnal organization of the Autogr apha californica polyhedrosis virus genome [J]. Arch Virol, 1993,130:1～16
[7]Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manu al [M], 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
[8]Wilsm M E,Mainprize T H, Fiesen P D et al. Location, translation and sequence of a baculovirus gene encoding a small arginine-rich polypepitide[J].J Virol, 1987,61:661～666
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[9]Thiem S M, Miller L K. Identification, sequence, and transcriptional mapping of the major capsid protein gene of the baculovirus Autographa californic a nuclear polyhedrosis virus [J]. J Virol, 1989,63:2008～2018
[10]Ahrens C H, Russell R L Q, Funk C J et al. The Sequence of Orgyia pseudotsugata multinucleocapsid nuclear polyhedrosis virus genome[J].Virol, 1997,229:381～399
[11]Ayres M D, Howard S C, Kuzio J et al. The complete DNA sequence of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus[J]. Virol, 1994,202:586～605
收稿日期：1998-08-28
修稿日期：1998-11-06, 百拇医药