慢性乙型肝炎和肝病中Fas和FasL表达的原位研究
作者：骆抗先 朱幼芙 何海棠 王新生 章廉
单位：510515 广州，第一军医大学附属南方医院
关键词：慢性乙型肝炎；慢性肝病；Fas/FasL
中华传染病杂志980302 【摘要】 目的 了解慢性乙型肝炎和肝病时介导凋亡的Fas/FasL表现。方法 以免疫组化法原位检查各种慢性肝病45例的活检肝组织。结果 肝内浸润的淋巴细胞中检出FasL，肝细胞Fas/FasL表达与炎症活动性一致，多分布在界面性炎症区。肝细胞表达FasL，可能也发挥细胞毒效应。结论 新的发现是FasL可在肝细胞结节和肝癌细胞表达，提示有细胞毒效应的FasL在HB相关慢性肝病中有发病学意义。肝癌细胞中未检出Fas而检出FasL，可能是一种肿瘤逃避免疫攻击的机制。
In situ investigation of Fas/FasL expression in chronic hepatitis B and liver diseases Luo Kangxian, Zhu Youfu, He Haitang, et al. Nanfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510515
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To elucidate the appearance of Fas/FasL-induced apoptosis in hepatitis B virus-related chronic liver diseases.Methods Forty-five biopsied liver samples from 44 corresponding cases were investigated by the technique of in situ immunohistochemistry. Results The FasL was detected in the infiltrating lymphocytes.The Fas and FasL expressions were closely correlated with the inflammatory activity.The Fas/FasL signals mostly distributed in the interface of inflammatory region.The hepatocyt expressed FasL which might induce cytotoxicity. Conclusion A new discovery was that FasL was expressed in liver nodules and hepatocellular carcinoma cells,suggesting the FasL might induce cytotoxicity and was involved in the pathogenesis of HBV-related chronic liver diseases.In carcinoma cells,Fas was not detected whereas FasL was detected,implicating a mechanism that tumor cells evaded immune attacks.
, 百拇医药
【Key words】 Chronic hepatitis B Chronic liver disease Fas/FasL
肝炎是肝内细胞毒效应的反映，可基于Fas的凋亡、或基于穿孔素的坏死。Fas是介导凋亡的细胞表面分子，肝病时肝细胞可有强表达。Fas与其效应细胞上的配体(FasL)结合，从而转导凋亡信号进入靶细胞，FasL对Fas表达细胞有很强的细胞毒活性。FasL表达主要限于激活的T细胞；最近的报告也见于免疫细胞外的少数组织[1]。正常肝无FasL表达，只发现在进行性损害的病变[2]。乙型肝炎病毒(HBV)感染时经配体-受体间的相互作用使表达病毒抗原的肝细胞凋亡。我们曾调查慢性乙型肝炎(CHB)的Fas表达和DNA损伤[3]，在此进而研究HBV相关慢性肝病患者肝内的Fas/FasL表达，试图阐明不同疾病状态时这对凋亡相关分子的表现，结果对FasL的表达有新的发现。
材料和方法
, 百拇医药
一、肝组织来源
45例为近2年本院收治患者的活检标本，慢性肝炎(CH)诊断参照1995年全国防治方案。轻度CH(有或无界面性炎症)7例，年龄29.1±7.7岁，ALT29～321U/L，HBsAg均(+)，5例HBeAg(+)；中度(有桥样坏死)和重度CH(可含早期肝硬变，LC)共12例，年龄31.8±9.3岁，ALT43～860U/L,HBsAg均(+)，8例HBeAg(+)；活动性LC(LC有炎症坏死)9例年龄33.8±7.9岁，ALT91～611U/L,均HBsAg(+)，6例HBeAg(+)；肝细胞癌(HCC)14例，年龄44.1±10.4岁，ALT18～223U/L,9例HBsAg(+)、5例抗-HBc(+)或抗-HBs(+)，对照3例。
二、肝细胞Fas表达检查
甲醛固定、石蜡包埋的活检肝切片经二甲苯脱蜡，H2O2处理，以LSAB试剂盒(DAKO)免疫组化检测，按说明书操作。依次用正常兔血清(阻断)、鼠抗人Fas抗体(Transduction Lab.KY)(反应)、生物素-兔抗鼠IgG(连接)、过氧化物酶-链亲合素反应，二氨基联苯胺(DAB)显色后以苏木素复染。
, 百拇医药
三、肝内FasL表达检查
以相同免疫组化技术，改用鼠抗人FasL单克隆抗体(Santa Cruz,CA)，以氨基乙基咔唑(AEC，华美公司)显色。
试验对照：阳性对照为一例有重度界面性炎症的肝组织；阴性对照含正常肝组织、以缓冲液分别代替Fas抗体或FasL抗体。
四、结果判定
肝组织病变按炎症坏死和纤维化程度分4级(G)和4期(S)。Fas和FasL表达强度为+：阳性细胞仅见于中央静脉周围、或少数在界面性炎症区；++：在界面炎症区有较多数，小叶或结节内散在分布；+++：界面性炎症区强表达，肝小叶或结节中也呈弥漫分布。
结 果
一、肝内Fas表达
, 百拇医药
Fas阳性肝细胞胞浆和胞膜染色，多分布在界面性炎症区(图1，见插页)，与Fas阴性的气球样细胞同在。肝组织Fas表达的程度与病变的活动性一致。正常肝组织阴性。轻度CH可无表达或仅弱表达，少数见于中央静脉周围、或界面性炎症区；中、重度CH常为中、强度表达，除界面性炎症区外，肝小叶中也有散在分布。CH合并早期LC或活动性LC常有较重炎症坏死，也常是中、强度表达；HCC多无明显炎症，仅癌旁有弱表达(见表1、表2)。肝内浸润的淋巴细胞也见阳性染色，因胞核经复染，少许胞浆免疫组化染色较难观察。
二、肝内FasL表达
FasL胞浆胞膜阳性染色，程度也与病变活动性相关(见表1、表2)，常见于界面炎症区(图2，见插页)和可无明显炎症的肝细胞结节中(图3，见插页)，已由FasL-mRNA原位杂交表明其为构成性表达(另文报告)。癌细胞有FasL表达，浸润的淋巴细胞(图4，见插页)也清楚显色。
Fas和FasL检测用连续的组织切片，结果可对比。两种细胞表面分子分布不尽相同，都可分别单独存在；FasL见于炎症坏死区，也常见于周围无明显炎症的肝癌细胞和结节中的肝细胞；而Fas表达都与炎症密切相关，见于结节中的较少。
, 百拇医药
表1 各组患者肝细胞Fas/FasL表达 组 别
例数
Fas表达
FasL表达
+
++
+++
%
+
++
+++
%
HCC*
, 百拇医药
14
6
0
1
50.0
3
0
8
78.6
LC
9
2
1
4
, 百拇医药
77.8
1
3
3
77.8
中重CH
12
4
2
3
75.0
2
4
4
, 百拇医药
83.3
轻度CH
7
1
1
0
28.6
3
1
1
71.4
肝病对照**
2
, http://www.100md.com
1
1
0
1
1
正常对照
1
0
0
*Fas均由癌旁组织表达；FasL癌组织也有表达，但较少且弱。 ** 钩端螺旋体病和心原性肝硬变各1例表2 肝组织Fas/FasL表达与炎症分级 分级
例数
, 百拇医药
Fas表达
FasL表达
+
%
+
%
1级
13
3
1
, 百拇医药
2
46.2
5
3
2
76.9
2级
10
4
1
2
58.3
1
1
, 百拇医药
6
75.0
3级
15
6
0
3
69.2
2
2
8
92.3
4级
6
, http://www.100md.com
2
1
2
83.3
1
3
1
83.3
讨 论
Fas/FasL是细胞毒性T细胞(CTL)使感染肝细胞自杀的主要途径，病毒抗原激活FasL在CTL、Fas在肝细胞的表达，而后CTL可使表达Fas的肝细胞凋亡。FasL可以是一种膜型的细胞因子，经靶细胞表面受体Fas引起凋亡。已在多种组织发现Fas，肝细胞可有强表达，提示其在肝病发生中的重要作用。原认为FasL表达仅限于有细胞毒活性的T细胞，CTL是免疫系统清除病毒感染的主要效应细胞。近来有报道FasL在其它免疫细胞、甚至免疫细胞以外的少数组织[4]，并已发现可在肝病的肝细胞中表达[2]。
, 百拇医药
虽受原位免疫组化方法学本身的限制，本试验已在多数患者的肝内浸润的淋巴细胞中检出FasL，可能表达FasL的淋巴细胞对启动肝细胞凋亡是主要的效应细胞。
HBV感染有不同的病变状态，可能程度不同的介导肝细胞凋亡。我们以原位杂交平行检测肝细胞病毒感染和Fas表达，两者的强度和分布并不一致；作为对照的钩端螺旋体病和心原性LC也都有表达，说明Fas/FasL无病原特异性、只与肝内炎症活性密切相关。已证明艾滋病患者的淋巴腺中正在凋亡的细胞未必贮存HIV病毒，故假设旁观者效应介导未感染细胞凋亡[5]，也说明凋亡分子表达未必与感染细胞一致。
本研究表明HBV感染不仅可增强Fas、且激发FasL表达。FasL表达也与炎症活动性一致，多分布在界面性炎症区。肝细胞表达FasL，可能也发挥细胞毒效应。经连续切片对比研究表明FasL和Fas的分布不尽相同，提示两者可顺式(in cis)、即在同一细胞引起细胞死亡；也可转式(trans)经释放的可溶性FasL(sFasL)导致别的表达Fas的肝细胞死亡，FasL作用的顺式或转式机制已在淋巴细胞凋亡中证实[6]。
, 百拇医药
细胞凋亡与增生有共同的发生程序，引起凋亡的分子并非总是引起凋亡，取决于当时的各种制约条件[7]。Galle等[2]也曾报告在酒精性LC，假小叶中心有极高水平的FasL-mRNA表达，但不见于HB引起的LC结节。本研究发现FasL可在HB相关肝病的肝细胞结节表达，提示细胞过度增生也能诱导这对细胞膜分子。
本研究在肝癌细胞中几未检出Fas，DNA损伤(TUNEL试验)和凋亡细胞(电镜观察)都很少，提示凋亡机制低效应使肿瘤发展。有实验报告[8]在人肝癌细胞HepG2和转染HBV的HepG2.2.15细胞系中，加入有很强细胞毒活性的Fas抗体并不介导凋亡。癌肿细胞对Fas系统耐受结果与本试验一致。
本研究在肝癌细胞中检出了FasL。有报道[9]Fas在癌肿中消失，可能从而避免凋亡；而FasL可有强表达，并发现优势表达FasL-mRNA的肝癌细胞常与淋巴细胞相邻，使浸润的淋巴细胞发生凋亡，从而使肿瘤细胞躲避免疫破坏，认为这可能是一种免疫反击机制。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Suda T,Okazaki T,Naito Y,et al.Expression of the Fas ligand in cells of T cell lineage.J Immunol,1995，154：3806-3813.
2 Galle PR,Hofmann WJ,Walczak H,et al.Involvement of the CD95 (APO-1/Fas) receptor and ligand in liver damage.J Exp Med,1995，182：1223-1230.
3 骆抗先，何海棠，朱幼芙，等.慢性乙型肝炎肝细胞Fas表达和DNA损伤.中华内科杂志，1996，35：750-752.
4 Hahne M,Renno T,Schroeter M,et al.Activated B cells express functional Fas ligand.Eur J Immunol,1996，26：721-724.
, 百拇医药
5 Badley AD,McElhinny JA,Leibson PJ,et al.Upregulation of Fas ligand expression by human immunodeficiency virus in human macrophages mediates apoptosis of uninfected T lymphocytes.J Virol,1995，70：199-206.
6 Golstein P,Marguet D,Depraetere V.Fas bridging cell death and cytotoxicity:The reaper connection.Immunol Rew,1995，146：45-56.
7 Patel T,Gores GJ.Apoptosis and hepatobiliary disease.Hepatoloty,1995，21：1725-1741.
8 Natoli G,Ianni A,Costanzo A,et al.Resistanse to Fas-mediated apoptosis in human hepatoma cells.Oncogene,1995，11：1157-1164.
9 Strand S,Hofmann WJ,Hug H,et al.Lymphocyte apoptosis induced by CD95 (APO-1/Fas) ligand-expressing tumor cell-A mechanism of immune evasion?Nature Medicine,1996，2：1361-1366., 百拇医药
单位：510515 广州，第一军医大学附属南方医院
关键词：慢性乙型肝炎；慢性肝病；Fas/FasL
中华传染病杂志980302 【摘要】 目的 了解慢性乙型肝炎和肝病时介导凋亡的Fas/FasL表现。方法 以免疫组化法原位检查各种慢性肝病45例的活检肝组织。结果 肝内浸润的淋巴细胞中检出FasL，肝细胞Fas/FasL表达与炎症活动性一致，多分布在界面性炎症区。肝细胞表达FasL，可能也发挥细胞毒效应。结论 新的发现是FasL可在肝细胞结节和肝癌细胞表达，提示有细胞毒效应的FasL在HB相关慢性肝病中有发病学意义。肝癌细胞中未检出Fas而检出FasL，可能是一种肿瘤逃避免疫攻击的机制。
In situ investigation of Fas/FasL expression in chronic hepatitis B and liver diseases Luo Kangxian, Zhu Youfu, He Haitang, et al. Nanfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510515
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To elucidate the appearance of Fas/FasL-induced apoptosis in hepatitis B virus-related chronic liver diseases.Methods Forty-five biopsied liver samples from 44 corresponding cases were investigated by the technique of in situ immunohistochemistry. Results The FasL was detected in the infiltrating lymphocytes.The Fas and FasL expressions were closely correlated with the inflammatory activity.The Fas/FasL signals mostly distributed in the interface of inflammatory region.The hepatocyt expressed FasL which might induce cytotoxicity. Conclusion A new discovery was that FasL was expressed in liver nodules and hepatocellular carcinoma cells,suggesting the FasL might induce cytotoxicity and was involved in the pathogenesis of HBV-related chronic liver diseases.In carcinoma cells,Fas was not detected whereas FasL was detected,implicating a mechanism that tumor cells evaded immune attacks.
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【Key words】 Chronic hepatitis B Chronic liver disease Fas/FasL
肝炎是肝内细胞毒效应的反映，可基于Fas的凋亡、或基于穿孔素的坏死。Fas是介导凋亡的细胞表面分子，肝病时肝细胞可有强表达。Fas与其效应细胞上的配体(FasL)结合，从而转导凋亡信号进入靶细胞，FasL对Fas表达细胞有很强的细胞毒活性。FasL表达主要限于激活的T细胞；最近的报告也见于免疫细胞外的少数组织[1]。正常肝无FasL表达，只发现在进行性损害的病变[2]。乙型肝炎病毒(HBV)感染时经配体-受体间的相互作用使表达病毒抗原的肝细胞凋亡。我们曾调查慢性乙型肝炎(CHB)的Fas表达和DNA损伤[3]，在此进而研究HBV相关慢性肝病患者肝内的Fas/FasL表达，试图阐明不同疾病状态时这对凋亡相关分子的表现，结果对FasL的表达有新的发现。
材料和方法
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一、肝组织来源
45例为近2年本院收治患者的活检标本，慢性肝炎(CH)诊断参照1995年全国防治方案。轻度CH(有或无界面性炎症)7例，年龄29.1±7.7岁，ALT29～321U/L，HBsAg均(+)，5例HBeAg(+)；中度(有桥样坏死)和重度CH(可含早期肝硬变，LC)共12例，年龄31.8±9.3岁，ALT43～860U/L,HBsAg均(+)，8例HBeAg(+)；活动性LC(LC有炎症坏死)9例年龄33.8±7.9岁，ALT91～611U/L,均HBsAg(+)，6例HBeAg(+)；肝细胞癌(HCC)14例，年龄44.1±10.4岁，ALT18～223U/L,9例HBsAg(+)、5例抗-HBc(+)或抗-HBs(+)，对照3例。
二、肝细胞Fas表达检查
甲醛固定、石蜡包埋的活检肝切片经二甲苯脱蜡，H2O2处理，以LSAB试剂盒(DAKO)免疫组化检测，按说明书操作。依次用正常兔血清(阻断)、鼠抗人Fas抗体(Transduction Lab.KY)(反应)、生物素-兔抗鼠IgG(连接)、过氧化物酶-链亲合素反应，二氨基联苯胺(DAB)显色后以苏木素复染。
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三、肝内FasL表达检查
以相同免疫组化技术，改用鼠抗人FasL单克隆抗体(Santa Cruz,CA)，以氨基乙基咔唑(AEC，华美公司)显色。
试验对照：阳性对照为一例有重度界面性炎症的肝组织；阴性对照含正常肝组织、以缓冲液分别代替Fas抗体或FasL抗体。
四、结果判定
肝组织病变按炎症坏死和纤维化程度分4级(G)和4期(S)。Fas和FasL表达强度为+：阳性细胞仅见于中央静脉周围、或少数在界面性炎症区；++：在界面炎症区有较多数，小叶或结节内散在分布；+++：界面性炎症区强表达，肝小叶或结节中也呈弥漫分布。
结 果
一、肝内Fas表达
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Fas阳性肝细胞胞浆和胞膜染色，多分布在界面性炎症区(图1，见插页)，与Fas阴性的气球样细胞同在。肝组织Fas表达的程度与病变的活动性一致。正常肝组织阴性。轻度CH可无表达或仅弱表达，少数见于中央静脉周围、或界面性炎症区；中、重度CH常为中、强度表达，除界面性炎症区外，肝小叶中也有散在分布。CH合并早期LC或活动性LC常有较重炎症坏死，也常是中、强度表达；HCC多无明显炎症，仅癌旁有弱表达(见表1、表2)。肝内浸润的淋巴细胞也见阳性染色，因胞核经复染，少许胞浆免疫组化染色较难观察。
二、肝内FasL表达
FasL胞浆胞膜阳性染色，程度也与病变活动性相关(见表1、表2)，常见于界面炎症区(图2，见插页)和可无明显炎症的肝细胞结节中(图3，见插页)，已由FasL-mRNA原位杂交表明其为构成性表达(另文报告)。癌细胞有FasL表达，浸润的淋巴细胞(图4，见插页)也清楚显色。
Fas和FasL检测用连续的组织切片，结果可对比。两种细胞表面分子分布不尽相同，都可分别单独存在；FasL见于炎症坏死区，也常见于周围无明显炎症的肝癌细胞和结节中的肝细胞；而Fas表达都与炎症密切相关，见于结节中的较少。
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表1 各组患者肝细胞Fas/FasL表达 组 别
例数
Fas表达
FasL表达
+
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+++
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HCC*
, 百拇医药
14
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50.0
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LC
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77.8
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中重CH
12
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83.3
轻度CH
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肝病对照**
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正常对照
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*Fas均由癌旁组织表达；FasL癌组织也有表达，但较少且弱。 ** 钩端螺旋体病和心原性肝硬变各1例表2 肝组织Fas/FasL表达与炎症分级 分级
例数
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Fas表达
FasL表达
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1级
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讨 论
Fas/FasL是细胞毒性T细胞(CTL)使感染肝细胞自杀的主要途径，病毒抗原激活FasL在CTL、Fas在肝细胞的表达，而后CTL可使表达Fas的肝细胞凋亡。FasL可以是一种膜型的细胞因子，经靶细胞表面受体Fas引起凋亡。已在多种组织发现Fas，肝细胞可有强表达，提示其在肝病发生中的重要作用。原认为FasL表达仅限于有细胞毒活性的T细胞，CTL是免疫系统清除病毒感染的主要效应细胞。近来有报道FasL在其它免疫细胞、甚至免疫细胞以外的少数组织[4]，并已发现可在肝病的肝细胞中表达[2]。
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虽受原位免疫组化方法学本身的限制，本试验已在多数患者的肝内浸润的淋巴细胞中检出FasL，可能表达FasL的淋巴细胞对启动肝细胞凋亡是主要的效应细胞。
HBV感染有不同的病变状态，可能程度不同的介导肝细胞凋亡。我们以原位杂交平行检测肝细胞病毒感染和Fas表达，两者的强度和分布并不一致；作为对照的钩端螺旋体病和心原性LC也都有表达，说明Fas/FasL无病原特异性、只与肝内炎症活性密切相关。已证明艾滋病患者的淋巴腺中正在凋亡的细胞未必贮存HIV病毒，故假设旁观者效应介导未感染细胞凋亡[5]，也说明凋亡分子表达未必与感染细胞一致。
本研究表明HBV感染不仅可增强Fas、且激发FasL表达。FasL表达也与炎症活动性一致，多分布在界面性炎症区。肝细胞表达FasL，可能也发挥细胞毒效应。经连续切片对比研究表明FasL和Fas的分布不尽相同，提示两者可顺式(in cis)、即在同一细胞引起细胞死亡；也可转式(trans)经释放的可溶性FasL(sFasL)导致别的表达Fas的肝细胞死亡，FasL作用的顺式或转式机制已在淋巴细胞凋亡中证实[6]。
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细胞凋亡与增生有共同的发生程序，引起凋亡的分子并非总是引起凋亡，取决于当时的各种制约条件[7]。Galle等[2]也曾报告在酒精性LC，假小叶中心有极高水平的FasL-mRNA表达，但不见于HB引起的LC结节。本研究发现FasL可在HB相关肝病的肝细胞结节表达，提示细胞过度增生也能诱导这对细胞膜分子。
本研究在肝癌细胞中几未检出Fas，DNA损伤(TUNEL试验)和凋亡细胞(电镜观察)都很少，提示凋亡机制低效应使肿瘤发展。有实验报告[8]在人肝癌细胞HepG2和转染HBV的HepG2.2.15细胞系中，加入有很强细胞毒活性的Fas抗体并不介导凋亡。癌肿细胞对Fas系统耐受结果与本试验一致。
本研究在肝癌细胞中检出了FasL。有报道[9]Fas在癌肿中消失，可能从而避免凋亡；而FasL可有强表达，并发现优势表达FasL-mRNA的肝癌细胞常与淋巴细胞相邻，使浸润的淋巴细胞发生凋亡，从而使肿瘤细胞躲避免疫破坏，认为这可能是一种免疫反击机制。
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参考文献
1 Suda T,Okazaki T,Naito Y,et al.Expression of the Fas ligand in cells of T cell lineage.J Immunol,1995，154：3806-3813.
2 Galle PR,Hofmann WJ,Walczak H,et al.Involvement of the CD95 (APO-1/Fas) receptor and ligand in liver damage.J Exp Med,1995，182：1223-1230.
3 骆抗先，何海棠，朱幼芙，等.慢性乙型肝炎肝细胞Fas表达和DNA损伤.中华内科杂志，1996，35：750-752.
4 Hahne M,Renno T,Schroeter M,et al.Activated B cells express functional Fas ligand.Eur J Immunol,1996，26：721-724.
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5 Badley AD,McElhinny JA,Leibson PJ,et al.Upregulation of Fas ligand expression by human immunodeficiency virus in human macrophages mediates apoptosis of uninfected T lymphocytes.J Virol,1995，70：199-206.
6 Golstein P,Marguet D,Depraetere V.Fas bridging cell death and cytotoxicity:The reaper connection.Immunol Rew,1995，146：45-56.
7 Patel T,Gores GJ.Apoptosis and hepatobiliary disease.Hepatoloty,1995，21：1725-1741.
8 Natoli G,Ianni A,Costanzo A,et al.Resistanse to Fas-mediated apoptosis in human hepatoma cells.Oncogene,1995，11：1157-1164.
9 Strand S,Hofmann WJ,Hug H,et al.Lymphocyte apoptosis induced by CD95 (APO-1/Fas) ligand-expressing tumor cell-A mechanism of immune evasion?Nature Medicine,1996，2：1361-1366., 百拇医药