绞股蓝皂甙及平阳霉素对口腔鳞癌颈淋巴结转移癌细胞抑制作用的研究
作者：阎军峰 李金荣 胡传真
单位：武汉市(430079)湖北医科大学口腔医学院(阎军峰现在武警湖北总队医院)
关键词：绞股蓝皂甙；细胞毒；细胞周期
口腔医学纵横990401 摘要 目的：探讨绞股蓝皂甙(gypenosides, GP)及平阳霉素(PYM)对口腔鳞癌颈淋巴结转移癌GNM细胞的体外抑制作用及作用机制。方法：采用MTT法及流式细胞仪进行分析。结果：GP与PYM对GNM细胞均有抑制作用,抑制率与药物浓度呈正相关,二者联用,抑制率增强。GP主要作用于细胞的“S”期。结论：GP与PYM对GNM细胞具有抑制作用, GP对细胞的损伤是通过干扰细胞周期实现的,GP与PYM联用抑制作用增强在于二者作用的细胞周期不同。提示用药时可根据二者各时相时间分开应用。GP具有临床应用价值。
中图分类号 R739.91
, 百拇医药
The Suppressive Effect of Gypenosides and Pinyangmycin on Neck Lymph Node Metastatic Cell Line Derived from Human Oral
Squamous Cell Carcinoma in Vitro.
Yan Junfeng, Li Jinrong, Hu Zhuanzheng.
College Stomatology, Hubei Medical University,430079
Abstract Objective： To investigate the suppressive effect and effective mechanism of gypenosides (GP) and PYM on neck lymph node metatatic GNM cell line derived from human oral squamous cell carcinoma in vitro. Methods：MTT assays and flow cytometry were used. Results：There was a synergetic effect when GP was combined with PYM. a decrease in number of cells was noticed in "S" stage when GP was used. Conclusions：There was a suppressive effect when GP and PYM were used on GNM cell, a synergetic effect was realized by different cycle stage of two drugs. The present study provided evidence for using drugs clinically.
, 百拇医药
Key words gypenosides cytotoxic effect cycle
化疗是预防和治疗恶性肿瘤局部复发无法手术或放疗不敏感或有远处转移病例的主要手段。但是化疗药物在抑制或杀伤癌细胞的同时，对机体的正常细胞尤其是造血细胞及免疫活性细胞亦有不同程度的损伤。如何降低药物毒性一直是学者们关注的重点。有研究表明,部分中草药对某些肿瘤细胞具有抑制或杀灭作用,而对正常细胞无影响,且能协同手术、放疗或化疗起到提高和巩固疗效的作用。
绞股蓝系葫芦科绞股蓝属植物，主要有效成分为绞股蓝皂甙(gypenosides, GP)。实验证明，GP可抑制多种肿瘤细胞的增殖[1]。为了更进一步了解其和化疗药物联用的效果及作用机制,本实验采用MTT法及流式细胞仪对其抑制口腔转移癌细胞的作用进行了相关研究。
材料与方法
, http://www.100md.com
1. 细胞 人口腔鳞癌颈淋巴结转移癌GNM细胞株,由湖医口腔医院中心实验室建立[2]。
2. 药物 GP, 含量大于90%,陕西省安康中药厂产品。平阳霉素(PYM),天津市河北制药厂产品,8mg/支。药物使用时用培养液稀释成各种不同浓度。
3. MTT法测定[3]
取指数生长期的培养于RPMI-1640(含10%小牛血清)培养液中的GNM细胞,制成单细胞悬液,用0.5%台盼蓝检测活细胞率。用血球计数板计数，调整细胞浓度为105/ml。然后将细胞悬液加入96孔培养板,每孔100μl。将培养板置于37℃、含5%CO2的培养箱中培养24h后,各加入100μl五种不同浓度的GP、PYM和GP+PYM的混合剂。每组每一浓度重复4孔。设不含药物的对照组,培养72h后,每孔加入20μl 0.5%MTT溶液,继续培养4h。然后,吸除孔内液体,每孔加入150μl二甲基亚砜,振荡5d后,用全自动酶标仪(516型,波长为540nm)测定每孔光吸收值(OD),以下式计算出药物对细胞的生长抑制率(IR%)。
, 百拇医药
4. GP对GNM细胞增殖周期的检测
取指数生长期的GNM细胞制成浓度为105/ml的单细胞悬液,接种于25ml培养瓶中,每瓶含培养液5ml,设实验组和对照组。24h后实验组加GP终浓度为200μg/ml。
培养72h后用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,收集于离心管中。800～1000r/min离心5d,用PBS洗涤、离心2次后，用70%冷乙醇固定。上机前用PBS进行离心沉淀去除固定液。采用溴化乙啶一步插入法，DNA定量荧光染色(染液含EB10μg/ml,RNA酶10μg/ml,1%Rritonx-100), 0～4℃染色30d后,用FACS-420型流式细胞仪上机检测,拟合出细胞周期各时相比例。
结 果
1. GP对GNM细胞生长的影响
, 百拇医药
从表1看出,不同浓度的GP对GNM细胞生长均有抑制作用,抑制作用随浓度的增加而增加,呈浓度依赖关系。2.2 PYM对GNM细胞生长的影响
表1 不同浓度GP对GNM细胞的生长抑制率(IR%)
对照组
实验组(μg/ml)
25
50
100
200
600
OD
0.530
, http://www.100md.com
0.335
0.266
0.224
0.205
0.166
IR
36.8
49.8
57.8
61.3
68.7
从表2看出,PYM对GNM细胞的抑制作用亦呈剂量相关关系。
, 百拇医药
表2 不同浓度PYM对GNM细胞的生长抑制率(IR%)
对照组
实验组(μg/ml)
0.05
0.1
0.2
0.4
0.6
OD
0.530
0.345
0.326
, 百拇医药
0.234
0.201
0.122
IR
18.5
38.5
55.8
62.1
77.0
3. GP与PYM联用对GNM细胞生长的影响
从表3看出，GP与PYM合用后,其抑制率较单用GP或PYM提高,但联合用药时剂量较各自单独用药量减少。
, http://www.100md.com
表3 GP与PYM联用对GNM细胞的生长抑制率(IR%)
对照组
实验组(μg/ml)
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅴ
OD
0.530
0.279
0.247
0.203
, 百拇医药
0.144
0.072
IR
47.4
53.4
61.6
72.8
86.4
注: Ⅰ—Ⅴ剂量分别为各取GP和PYM单用时剂量的1/2。
4. GP对GNM细胞增殖周期的影响
由表4看出,GP作用于GNM细胞后,实验组较对照组S期细胞比例下降,细胞被阻滞在G0/G1期,细胞增殖被抑制。
, http://www.100md.com
表4 GP对GNM细胞增殖的影响
组别
细胞周期分布(%)
G0/G1
S
G2/M
对照组
52.95
42.60
4.45
GP组
60.37
, 百拇医药
32.25*
7.38
* 与对照组比较卡方检验P<0.01。
讨 论
用中西医结合治疗和预防恶性肿瘤在我国已有几十年的历史，并取得了显著成绩。对抗癌中草药的研究已从宏观向微观发展，从机体整体水平向细胞水平、分子水平不断深入。
绞股蓝，又名七叶胆，具有益气健脾、清热解毒的功能。研究证实，其抗肿瘤的主要有效成份是GP。刘华等[4]发现GP的抑瘤作用因细胞株来源不同而有明显差异。作者的研究也证实，GP可抑制GNM细胞的增殖,并引起癌细胞的线粒体和粗面内质网破坏[5]。
本实验结果显示，GP作用于GNM细胞后,细胞周期中S期细胞减少,细胞被阻滞在G0/G1期。S期为DNA合成期,代表细胞增殖活力。因此，S期细胞减少,提示细胞DNA合成和细胞增殖受到抑制。已证实人参皂甙RH2有抑制黑色素瘤B16生长的作用,并发现是通过阻滞细胞由G1期进入S期来达到的[6],这说明和人参皂甙结构相同的GP与人参皂甙的抑瘤机制可能类同。
, http://www.100md.com
本研究结果显示了GP与PYM联用后抑癌作用增强。平阳霉素是口腔颌面部鳞癌治疗中的首选药物，也是预防和治疗转移癌的常选药物之一。其作用机理为平阳霉素分子与细胞DNA分子嵌合后使其断裂,从而干扰遗传物质的合成与复制。其作用主要在G1期、G2─M期[7]。GP与PYM联用抑癌作用增强的机制可能就在于二者作用于细胞的环节不同而发挥"互补"作用的结果。因此提示在临床用药时可根据GP与PYM各时相时间分开应用,让其在各自作用的环节发挥作用。
本研究利用鳞癌颈淋巴结转移癌细胞株筛选抗转移癌药物，为临床用药提供了理论依据。临床已证实以绞股蓝为主的中药方剂可预防恶性肿瘤的复发转移，经检测患者NK细胞活性及免疫功能增强,并可提高肿瘤患者淋巴细胞转化力,而对正常细胞无显著影响[1],说明GP是一个有希望预防和治疗转移癌的天然抗癌药,有临床应用价值。
参考文献
, 百拇医药 1 阎军峰,李金荣. 绞股蓝抗肿瘤作用的研究进展.中医药研究, 1998,14(3):60
2 金辉喜. 人口腔鳞癌颈淋巴结转移癌细胞系和人舌鳞癌细胞系的建立及其生物学特性分析. 湖北医科大学博士学位论文,1997
3 吴军正,司徒镇强,刘斌，等. MTT试验及其在抗癌中药筛选中的应用.中华口腔医学杂志. 1992,27(6):373
4 刘华,司履生. 绞股蓝总皂甙对体外培养肺癌细胞的抑制作用.西安医科大学学报. 1994,15(4):346
5 阎军峰,李金荣,胡传真，等. 绞股蓝总皂甙对体外培养人口腔鳞癌颈淋巴结转移癌细胞抑制作用的研究.临床口腔医学杂志.1998,14(3): 140
6 Odashima S, Ohta T, Kohno H, et al.Control of phenotypic expression of cultured B16 Melanoma cell by plant glycosides. Cancer Res, 1985, 45: 2781
7 步荣发,邱蔚六. 硒及平阳霉素对Tca8113 细胞DNA含量及细胞增殖周期的影响. 华西口腔医学杂志. 1992,10(1): 11
[收稿：1999-07-11], http://www.100md.com
单位：武汉市(430079)湖北医科大学口腔医学院(阎军峰现在武警湖北总队医院)
关键词：绞股蓝皂甙；细胞毒；细胞周期
口腔医学纵横990401 摘要 目的：探讨绞股蓝皂甙(gypenosides, GP)及平阳霉素(PYM)对口腔鳞癌颈淋巴结转移癌GNM细胞的体外抑制作用及作用机制。方法：采用MTT法及流式细胞仪进行分析。结果：GP与PYM对GNM细胞均有抑制作用,抑制率与药物浓度呈正相关,二者联用,抑制率增强。GP主要作用于细胞的“S”期。结论：GP与PYM对GNM细胞具有抑制作用, GP对细胞的损伤是通过干扰细胞周期实现的,GP与PYM联用抑制作用增强在于二者作用的细胞周期不同。提示用药时可根据二者各时相时间分开应用。GP具有临床应用价值。
中图分类号 R739.91
, 百拇医药
The Suppressive Effect of Gypenosides and Pinyangmycin on Neck Lymph Node Metastatic Cell Line Derived from Human Oral
Squamous Cell Carcinoma in Vitro.
Yan Junfeng, Li Jinrong, Hu Zhuanzheng.
College Stomatology, Hubei Medical University,430079
Abstract Objective： To investigate the suppressive effect and effective mechanism of gypenosides (GP) and PYM on neck lymph node metatatic GNM cell line derived from human oral squamous cell carcinoma in vitro. Methods：MTT assays and flow cytometry were used. Results：There was a synergetic effect when GP was combined with PYM. a decrease in number of cells was noticed in "S" stage when GP was used. Conclusions：There was a suppressive effect when GP and PYM were used on GNM cell, a synergetic effect was realized by different cycle stage of two drugs. The present study provided evidence for using drugs clinically.
, 百拇医药
Key words gypenosides cytotoxic effect cycle
化疗是预防和治疗恶性肿瘤局部复发无法手术或放疗不敏感或有远处转移病例的主要手段。但是化疗药物在抑制或杀伤癌细胞的同时，对机体的正常细胞尤其是造血细胞及免疫活性细胞亦有不同程度的损伤。如何降低药物毒性一直是学者们关注的重点。有研究表明,部分中草药对某些肿瘤细胞具有抑制或杀灭作用,而对正常细胞无影响,且能协同手术、放疗或化疗起到提高和巩固疗效的作用。
绞股蓝系葫芦科绞股蓝属植物，主要有效成分为绞股蓝皂甙(gypenosides, GP)。实验证明，GP可抑制多种肿瘤细胞的增殖[1]。为了更进一步了解其和化疗药物联用的效果及作用机制,本实验采用MTT法及流式细胞仪对其抑制口腔转移癌细胞的作用进行了相关研究。
材料与方法
, http://www.100md.com
1. 细胞 人口腔鳞癌颈淋巴结转移癌GNM细胞株,由湖医口腔医院中心实验室建立[2]。
2. 药物 GP, 含量大于90%,陕西省安康中药厂产品。平阳霉素(PYM),天津市河北制药厂产品,8mg/支。药物使用时用培养液稀释成各种不同浓度。
3. MTT法测定[3]
取指数生长期的培养于RPMI-1640(含10%小牛血清)培养液中的GNM细胞,制成单细胞悬液,用0.5%台盼蓝检测活细胞率。用血球计数板计数，调整细胞浓度为105/ml。然后将细胞悬液加入96孔培养板,每孔100μl。将培养板置于37℃、含5%CO2的培养箱中培养24h后,各加入100μl五种不同浓度的GP、PYM和GP+PYM的混合剂。每组每一浓度重复4孔。设不含药物的对照组,培养72h后,每孔加入20μl 0.5%MTT溶液,继续培养4h。然后,吸除孔内液体,每孔加入150μl二甲基亚砜,振荡5d后,用全自动酶标仪(516型,波长为540nm)测定每孔光吸收值(OD),以下式计算出药物对细胞的生长抑制率(IR%)。
, 百拇医药
4. GP对GNM细胞增殖周期的检测
取指数生长期的GNM细胞制成浓度为105/ml的单细胞悬液,接种于25ml培养瓶中,每瓶含培养液5ml,设实验组和对照组。24h后实验组加GP终浓度为200μg/ml。
培养72h后用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,收集于离心管中。800～1000r/min离心5d,用PBS洗涤、离心2次后，用70%冷乙醇固定。上机前用PBS进行离心沉淀去除固定液。采用溴化乙啶一步插入法，DNA定量荧光染色(染液含EB10μg/ml,RNA酶10μg/ml,1%Rritonx-100), 0～4℃染色30d后,用FACS-420型流式细胞仪上机检测,拟合出细胞周期各时相比例。
结 果
1. GP对GNM细胞生长的影响
, 百拇医药
从表1看出,不同浓度的GP对GNM细胞生长均有抑制作用,抑制作用随浓度的增加而增加,呈浓度依赖关系。2.2 PYM对GNM细胞生长的影响
表1 不同浓度GP对GNM细胞的生长抑制率(IR%)
对照组
实验组(μg/ml)
25
50
100
200
600
OD
0.530
, http://www.100md.com
0.335
0.266
0.224
0.205
0.166
IR
36.8
49.8
57.8
61.3
68.7
从表2看出,PYM对GNM细胞的抑制作用亦呈剂量相关关系。
, 百拇医药
表2 不同浓度PYM对GNM细胞的生长抑制率(IR%)
对照组
实验组(μg/ml)
0.05
0.1
0.2
0.4
0.6
OD
0.530
0.345
0.326
, 百拇医药
0.234
0.201
0.122
IR
18.5
38.5
55.8
62.1
77.0
3. GP与PYM联用对GNM细胞生长的影响
从表3看出，GP与PYM合用后,其抑制率较单用GP或PYM提高,但联合用药时剂量较各自单独用药量减少。
, http://www.100md.com
表3 GP与PYM联用对GNM细胞的生长抑制率(IR%)
对照组
实验组(μg/ml)
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅴ
OD
0.530
0.279
0.247
0.203
, 百拇医药
0.144
0.072
IR
47.4
53.4
61.6
72.8
86.4
注: Ⅰ—Ⅴ剂量分别为各取GP和PYM单用时剂量的1/2。
4. GP对GNM细胞增殖周期的影响
由表4看出,GP作用于GNM细胞后,实验组较对照组S期细胞比例下降,细胞被阻滞在G0/G1期,细胞增殖被抑制。
, http://www.100md.com
表4 GP对GNM细胞增殖的影响
组别
细胞周期分布(%)
G0/G1
S
G2/M
对照组
52.95
42.60
4.45
GP组
60.37
, 百拇医药
32.25*
7.38
* 与对照组比较卡方检验P<0.01。
讨 论
用中西医结合治疗和预防恶性肿瘤在我国已有几十年的历史，并取得了显著成绩。对抗癌中草药的研究已从宏观向微观发展，从机体整体水平向细胞水平、分子水平不断深入。
绞股蓝，又名七叶胆，具有益气健脾、清热解毒的功能。研究证实，其抗肿瘤的主要有效成份是GP。刘华等[4]发现GP的抑瘤作用因细胞株来源不同而有明显差异。作者的研究也证实，GP可抑制GNM细胞的增殖,并引起癌细胞的线粒体和粗面内质网破坏[5]。
本实验结果显示，GP作用于GNM细胞后,细胞周期中S期细胞减少,细胞被阻滞在G0/G1期。S期为DNA合成期,代表细胞增殖活力。因此，S期细胞减少,提示细胞DNA合成和细胞增殖受到抑制。已证实人参皂甙RH2有抑制黑色素瘤B16生长的作用,并发现是通过阻滞细胞由G1期进入S期来达到的[6],这说明和人参皂甙结构相同的GP与人参皂甙的抑瘤机制可能类同。
, http://www.100md.com
本研究结果显示了GP与PYM联用后抑癌作用增强。平阳霉素是口腔颌面部鳞癌治疗中的首选药物，也是预防和治疗转移癌的常选药物之一。其作用机理为平阳霉素分子与细胞DNA分子嵌合后使其断裂,从而干扰遗传物质的合成与复制。其作用主要在G1期、G2─M期[7]。GP与PYM联用抑癌作用增强的机制可能就在于二者作用于细胞的环节不同而发挥"互补"作用的结果。因此提示在临床用药时可根据GP与PYM各时相时间分开应用,让其在各自作用的环节发挥作用。
本研究利用鳞癌颈淋巴结转移癌细胞株筛选抗转移癌药物，为临床用药提供了理论依据。临床已证实以绞股蓝为主的中药方剂可预防恶性肿瘤的复发转移，经检测患者NK细胞活性及免疫功能增强,并可提高肿瘤患者淋巴细胞转化力,而对正常细胞无显著影响[1],说明GP是一个有希望预防和治疗转移癌的天然抗癌药,有临床应用价值。
参考文献
, 百拇医药 1 阎军峰,李金荣. 绞股蓝抗肿瘤作用的研究进展.中医药研究, 1998,14(3):60
2 金辉喜. 人口腔鳞癌颈淋巴结转移癌细胞系和人舌鳞癌细胞系的建立及其生物学特性分析. 湖北医科大学博士学位论文,1997
3 吴军正,司徒镇强,刘斌，等. MTT试验及其在抗癌中药筛选中的应用.中华口腔医学杂志. 1992,27(6):373
4 刘华,司履生. 绞股蓝总皂甙对体外培养肺癌细胞的抑制作用.西安医科大学学报. 1994,15(4):346
5 阎军峰,李金荣,胡传真，等. 绞股蓝总皂甙对体外培养人口腔鳞癌颈淋巴结转移癌细胞抑制作用的研究.临床口腔医学杂志.1998,14(3): 140
6 Odashima S, Ohta T, Kohno H, et al.Control of phenotypic expression of cultured B16 Melanoma cell by plant glycosides. Cancer Res, 1985, 45: 2781
7 步荣发,邱蔚六. 硒及平阳霉素对Tca8113 细胞DNA含量及细胞增殖周期的影响. 华西口腔医学杂志. 1992,10(1): 11
[收稿：1999-07-11], http://www.100md.com