骨髓基质细胞体外培养及其生物学特性的研究
作者：庞芳河 蒙 敏 梁自民
单位：广西医科大学附属口腔医院(530021)
关键词：骨髓；基质细胞；成骨细胞；体外培养
口腔颌面外科杂志990308 摘 要：目的：建立一种新型的体外培养成骨细胞的生物学模型。并对其生物学特性进行研究。方法：选择大耳白兔骨髓基质细胞为材料进行体外成骨细胞培养实验，在不同培养体系中进行体外培养，通过倒置显微镜观察、透射电镜、扫描电镜、组织化学染色技术、钙染色等手段对获得的细胞进行生物学特性进行研究。结果：获得的细胞呈多种形态，有长短不一、大小不均的胞浆突起，且互相连接，细胞互相重叠呈复层生长，并形成细胞结节；胞浆丰富，富含线粒体、粗面内质网、高尔基体等，具有合成分泌功能旺盛的结构，与典型成骨细胞的形态结构相似。同时，胞浆富含碱性磷酸酶活性，在条件培养基中细胞发生钙化现象，这与典型成骨细胞的生物学特性相似。且获得的细胞在体外能连续传代，形态和功能不变。结论：我们认为用骨髓基质细胞为材料进行体外培养是成骨细胞体外培养的一种新型的生物学模型，为人工骨替代材料的研制、成骨细胞移植修复骨缺损等开辟了新的途径。
, http://www.100md.com
中图分类号：R739.8
文献标识码：A
文章编号：1005-4979(1999)03-209-05
STUDY ON BIOLOGICAL CHARCACTERIZATION AND CULTRUE OF
STROMAL CELL OF BONE MARROW IN VITRO
PANG Fang-he, MENG Min, LIANG Zi-min
Hospital of Stomatology Guangxi Medical University. Guangxi Nanning 530021
Abstract: Objective： To establish a new model of osteoblasts culture in vitro and study it's biological characterization.Methods： The stromal cell of bone marrow was obtain from the trochanteric region of femur of rabbit and was cultured in the different cultural fluid dddin vitro. the cells were examined by phase-contrast microscope, transmission electron microscope, scanning electron microscope, histochemistry stains and calvaria strains. Results：The stromal cells were increased and lined up in one layer, had the same morphological feature. ALP activity, and demineralized matrix formed in vitro to those of osteoblasts. Conclusion:The cultrued stromal cells derived from the bone marrow were a new model of osteoblast culur in vitro.
, 百拇医药
Key words: Bone marrow; Stromal cell; Osteoblast; Culur in vitro.
Peck在1964年首次将胎鼠骨组织进行体外成骨细胞培养，开创了成骨细胞体外培养技术用于研究骨代谢的新纪元。多年来，成骨细胞体外培养的生物学模型大多数是采用动物或人的骨质或骨膜，不仅取材困难，来源有限，而且对机体损伤大，不利于自体回植研究，临床价值有限。近年来，随着对成骨细胞来源及骨髓成骨潜能研究的深入，已证实成骨细胞来源于骨髓基质细胞，并可在体外培养转化为成骨细胞，在条件培养液中可以人为促进成骨[1]。本研究选择大耳白兔骨髓基质细胞为材料进行体外成骨细胞培养实验，目的在于建立一种新型的体外培养成骨细胞的生物学模型，并对其生物学特性进行研究，为进一步对成骨细胞的研究和应用开辟新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料及主要试剂
, 百拇医药
体重为1.5～2.0kg的大耳白兔，雌雄不拘。常规RPMI 1640培养液(GIBCO)：内含20%新生小牛血清(杭州四季生物工程材料研究所)，50μg/ml维生素C,0.5mg/ml HEPES，100μ/ml青霉素，100μg/ml链霉素。条件RPMI 1640培养液：常规RPMI 1640培养液加入β-甘油磷酸钠(10mmol/L)、地塞米松(10-8mol/L)。D-Hank液、0.25%胰蛋白酶、骨髓穿刺手术用品、培养器皿及培养用液均无菌处理后备用。
1.2 取材
称取动物，2.5%硫喷妥钠注射液腹腔注射麻醉(30mg/kg)。无菌条件下分别自左右两侧股骨粗隆处用18号骨髓穿刺针共抽取骨髓悬液4～6ml，加入等体积的抗凝RPMI 1640培养液混均后，加至内含等体积，比重为1.077淋巴细胞分离液的离心管中，以2 000r/min×20min离心，收集界面的有核细胞层，再用D-Hank液洗涤两次，加入常规RPMI 1640培养液稀释，制成细胞悬液。
, 百拇医药
1.3 骨髓基质细胞原代培养
将上述细胞悬液调整至1×106/ml的细胞密度取3ml分别接种于25ml培养瓶(有或无盖玻片)中，加入足量常规RPMI 1640培养液，密闭后置入37°C恒温培养箱中静置培养，一周后半量换液，以后隔3～4天换液并逐日观察。
1.4 骨髓基质细胞传代培养
经过12～14天培养，细胞增殖融合成层后，用0.25%胰蛋白酶消化按1∶1一分为二传代，并在每个培养瓶内预先放入两块长形盖玻片，其中一瓶与原代细胞培养条件相同作连续传代培养，周而复始。另留数瓶不作传代，加入条件RPMI 1640培养液长期培养，隔3～4天换液，拟观察钙盐沉着情况。
1.5 观察与鉴定
1.5.1 活体细胞显微镜观察：用倒置显微镜逐日观察培养细胞的生长情况和形态特征。
, 百拇医药
1.5.2 HE染色：传代的培养细胞(第2代)接种培养4天后，把爬满细胞的盖玻片取出，用37°C生理盐水漂洗数次，经10%中性缓冲福尔马林液固定30min，进行常规HE染色。
1.5.3 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色：将原代生长成层及传代的培养细胞(第2代)接种培养4天，把爬满细胞的玻片取出，95%酒精固定10min，采用改良Gomonri钙-钴法测定细胞的ALP活性。阳性细胞计数方法为各代细胞随机计数三张染色，每张随机计数500个细胞，算出ALP阳性细胞均数及阳性率。
1.5.4 钙染色：将传代的培养细胞(第2代)接种培养28～35天，细胞呈复层生长并出现圆形或卵圆形结节，取出盖玻片，用37°C生理盐水漂洗数次，经10%中性缓冲福尔马林固定30min，作Von Kossa钙染色。
1.5.5 超薄切片透射电镜观察：将传代培养4天的细胞(第2代)，用0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，以800r/min×5min，低速离心收集细胞，经2.5%戊二醛液固定后，按常规透射电镜制片方法制成超薄切片，在TEM(H-500，HITACHI)下观察其超微结构。
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1.5.6 扫描电镜观察：将传代细胞(第2代)培养4天后，取出长满细胞的盖玻片，用37°C生理盐水漂洗2次后，经2.5%戊二醛液固定，按常规扫描电镜制片方法制成扫描电镜样本，在SEM(JSM-T300，JAPAN)下观察细胞形态。骨髓基质细胞经18～20天左右培养，细胞呈复层样生长，形成细胞结节
2 结果
2.1 倒置显微镜下细胞生长、形态的观察
原代细胞接种后48h，细胞出现纺锤形改变，即开始贴壁生长，随着培养时间延长，贴壁细胞明显增多，并分裂增殖。7～10天细胞呈多种形态外观：星形，三角形，多角形，长梭形等，胞体膨大，伸出长短不一，粗细不均的多种形态胞浆突起，胞核大，核仁1～2个，位于胞体一侧，细胞呈团簇状生长，分布不均，显示出集落生长趋势。中心细胞轮廓不清，体积变小，而周边细胞形态不变，至14天左右，细胞融合成单层。不作连续传代培养的细胞，集落成团中心细胞互相重叠形成复层，约30天后，中心细胞发生钙化，形成肉眼可见的散在白色点状物，集落外周细胞交错排列成网状(见图1)。传代细胞经0.25%胰蛋白酶消化后变形，呈圆形，经24h后恢复原来形态，并贴壁增殖，形态和原代细胞相似，4～5天后融合形成单层细胞。连续培养传了9代，均生长良好，后因细菌污染未能进一步观察。
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图1 骨髓基质细胞原代培养H-E染色(×100)
2.2 HE染色
光镜下所见，细胞形态为长梭形，三角形，多角形等，有多个树状突起，胞核圆形，呈浅兰色，胞浆呈细网状，并见较多胞浆颗粒。
2.3 ALP染色
细胞经染色后，胞浆的ALP显示为灰色，棕色，黑色沉淀，即为阳性。随着传代增加培养细胞ALP阳性率逐渐增高。均在75%以上。
2.4 钙染色
细胞经30天培养，Von Kossa染色后，可见黑色沉着物沿着胶原纤维走向分布，细胞间连接处亦见大量黑色沉着物，即Von Kossa染色阳性。
2.5 超薄切片TEM
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细胞有较多粗细长短不一的胞浆突起，胞体内胞浆丰富，有大量核糖体、线粒体，高尔基体及粗面内质网，有丰富的颗粒状电子致密物，胞核大，不规则，有1～2核仁，可见核突或核袋，染色质丰富，呈团簇样分布。
2.6 扫描电镜SEM
细胞呈多种形态，如三角形、鳞片形，星形，有较多的突起，相互连接，细胞互相重叠，呈多层样结构。(见图2)
图2 骨髓基质细胞传代培养扫描电镜观察(×200)细胞呈复层生长，互相重叠，呈多种生长形态，如三角形、多角形、星形等，并有较多的细胞突起且互相连接
3 讨论
3.1 骨髓基质细胞及其培养成骨潜能
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骨髓依其功能分为造血和基质系统。骨髓基质是指骨髓腔内为造血系统提供结构及功能支持的结缔组织，其成骨潜能来源于基质系统的基质细胞。Friedenstein等将鼠骨髓细胞上培养24h即见基质细胞贴附于管壁，3～4天后，形成数个成纤维样细胞组成的集落。这种集落是由单个细胞稳定地增生而来的，是克隆性的。随着培养时间延长，集落细胞增殖扩大，逐渐融合成层。大量的实验表明：体外培养骨髓基质细胞，可以稳定地形成成纤维样细胞组成的细胞集落，Friedenstein把形成集落的初始骨髓基质细胞称为成纤维样细胞集落形成单位(或细胞)(colony-forming unitfirbroblastie, CFU-F)。而且表明CFU-F是由基质干细胞和混合祖细胞组成，具有多种分化潜能，能进一步分化为成骨细胞系、成纤维细胞系、成脂肪细胞系[2]。同时CFU-F形成的细胞集落在大小、形态和酶活性等方面存在明显的差别，表明骨髓基质细胞CFU-F是多相细胞群体。Friedenstein等将获得的集落细胞移入微孔滤膜扩散室(millipore diffustion chamber, MDC)植入体内继续培养，观察到在扩散室内基质细胞进行了成骨活动，其成骨过程类似膜内成骨，即基质干细胞和骨祖细胞直接分化为成骨细胞并合成、分泌骨胶原，成骨细胞被埋于钙化骨胶原中而成为骨细胞。由于微孔膜滤扩散室的孔隙仅为0.45μm，只允许小分子的营养物、代谢物的自由出入，而周围组织细胞无法长入，因此证明扩散室内形成的骨组织是由骨髓基质细胞所为，而且没有骨吸收现象，表明MDC中的细胞是纯成骨性的。国内李世勇(1994年)的研究也证实这点[3]。Mamiatopoulos等[4](1988年)首次报道鼠骨髓基质细胞在体外培养能形成钙化的骨样组织，经X线衍射分析确定形成的钙化物具有羟基磷灰石结构，证明体外培养骨髓基质具有成骨能力。Benayahu等[5]将骨髓基质细胞体外培养获得具有典型的成骨细胞特性的细胞：具有较高的ALP活性，只产生Ⅰ型胶原，受PTH刺激则细胞内CAMP增加，在条件培养液中可以产生矿化的细胞外基质(Von Kossa，染色阳性)，并且装入MDC中体内培养可形成骨。Gimble等[6]在体外将骨髓基质细胞培养成功地转化为成骨细胞。现已证实：骨祖细胞有两种类型，一种为诱导性骨祖细胞(inducible osteogemic precursor cell, IOPC),是一种未分化的间叶细胞，存在于所有的结缔组织中，它们不能自发地形成骨组织，在骨形态发生蛋白(BMP)等诱导因子作用下可转化为成骨细胞系，产生异位骨质，但若诱导因素一旦去除，新形成的异位骨组织就会被吸收掉。另一种为定向性骨祖细胞(determined osteogenic precursor cell, DOPC)仅在骨髓基质、骨膜生发层及骺板软骨基质中发现，可自动向成骨细胞系转化，并有合成骨基质的能力。骨髓是唯一含有丰富的诱导性和定向性骨祖细胞的组织，且骨髓间叶细胞诱导成骨活性最强，骨髓中骨形成细胞即骨祖细胞属基质性，而且能和造血细胞分离开来，并在体外培养而获得，可转化为成骨细胞。因而用骨髓基质细胞为材料进行体外培养来建立成骨细胞体外培养模型是合乎逻辑的。本实验，用骨髓抽取物经淋巴分离液提取骨髓基质细胞进行体外培养，基质细胞在培养液中呈贴壁生长，经换液或传代，无粘附性杂细胞被清除，基质细胞得以纯化而继续培养。
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3.2 培养细胞的生物学特性：本实验培养的细胞呈贴壁生长，今对获得的细胞进行生物学多方面的研究。
3.2.1 细胞形态学特性：本实验获得的细胞在体外培养呈三角形、多角形、鳞片形、星形等多种形态，有粗细不均，长短不一的细浆突起，其形态特征和王慧明等[7]的报告相似，细胞呈集落样生长，无接触抑制，相互重叠成复层生长，并形成细胞结节。电镜下细胞可见典型蛋白质合成结构：胞浆富含线粒体、粗面内质网和高尔基体等，合成分泌功能旺盛，均符合成骨细胞的形态、长生特征。
3.2.2 酶化学特性：碱性磷酸酶是成骨细胞矿化过程中主要的功能活性酶，富含于胞浆中，它可分有机质中磷酸，增加局部无机磷酸浓度，促进矿化。本实验培养细胞，碱性磷酸酶染色呈阳性，且随传代及培养时间延长，阳性率增加。其主要原因是骨髓基质细胞是有多种分化潜能，除了有一部分自动分化成骨细胞外，其余部分在地塞米松等因素存在条件下，促进了其向成骨细胞方向转化。这是成骨细胞最具特征的生物学特性之一。
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3.2.3 体外矿化：本实验获得细胞在含有维生系C、β-甘油磷酸钠及地塞米松的培养条件下，连续培养了30天后，进行Von Kossa钙染色，呈阳性反应，表明了所获得的细胞在体外能够发生钙化现象，这和王慧明等研究结果一致，是成骨细胞最重要的生物学特征。骨髓基质细胞培养，必须在含有一定浓度的地塞米松和β-甘油磷酸钠的培养基中才能形成矿化，这是由于地塞米松不仅能促进成骨细胞分化成熟，诱导成骨，而且具有调节成骨样细胞合成胰岛素样生长因子和促进胶原合成的作用，刺激其碱性磷酸酶活性[8]；β-甘油磷酸钠提供磷离子作为ALP作用的底物，诱导和激活ALP，促进有机磷向无机磷转化，加速钙盐沉着。无地塞米松存在此现象消失[9]。
由此可见，我们用骨髓基质细胞进行外体培养获得的细胞具有以下特性：(1) 生长活跃，能体外传代，具有合成分泌功能的形态特征；(2) 具有较强的碱性磷酸酶活性；(3) 在条件培养基中可以体外钙化成骨，我们认为用骨髓基质细胞进行体外培养是成骨细胞体外培养的一种新型生物学模型。
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4 问题与展望
4.1 尽管骨髓基质细胞体外培养转化为成骨细胞已获得成功，但还存在一些问题
培养细胞间细胞污染问题：体外培养获得的骨髓基质细胞集落是由多种细胞群体组成，即基质干细胞和各种祖细胞，具有多种分化潜能，需进一步纯化。Long等[10]应用单细胞克隆技术从人骨髓中分离出纯净的骨相关细胞群，流式细胞仪显示，这群细胞由4个不同的亚群组成，分别是前成骨细胞、成骨细胞样细胞、族形成细胞和克隆形成细胞，他们是处于不断增殖之中的骨祖细胞。
骨髓基质细胞体外培养成骨的条件问题：骨髓基质细胞体外培养成骨的条件与其它来源的成骨细胞比有其特殊性，因为获得的细胞集落中只有其中的定向性骨祖细胞自发地向成骨细胞转化，故其分化成骨很大程度上依赖培养条件，刺激骨髓基质细胞成骨的条件及物质正在探索中。
4.2 应用展望
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采用骨髓为材料建立成骨细胞培养模型，不仅具有来源丰富，采集方便，安全，损伤小，供区无明显并发症，成骨能力确定等优点，而且为同源细胞，没有免疫原性，宜于自体回植应用研究，使成骨细胞移植成为可能。骨缺损即是由于具有骨形成能力的成骨细胞缺乏或不足所致，向病变处移植成骨细胞成治疗的关键。而成骨细胞的获得，必须通过体外培养大量繁殖，采用骨髓基质细胞为材料通过体外培养，建立“成骨细胞库”，向病变部位植入成骨细胞，增加局部成骨细胞数量，增强其成骨能力，为修复骨缺损找到了新途径。
近年来，随着三维多孔立体结构的合成性生物降解聚合物的研制成功，成骨细胞与该聚合物后形成具有生物活性植骨材料展现了广阔的临床应用前景。一方面，有少量供体组织在体外细胞培养大量繁殖，为缺损处组织再生提供足够的细胞来源，另一方面，可降解性生物材料具有良好的生物相容性和生物降解性，对培养细胞起支持、固定作用，且能在细胞转化、增殖过程中不断被分解吸收而起引导作用，并充当一种持续释放载体，增强其成骨能力，显示出优越的成骨性能。而同源骨髓基质细胞经体外培养后与该种聚合物聚合进行移植，无免疫反应，具有较高临床应用价值。
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作者简介：庞芳河(1966-)，男，讲师，医学硕士
参考文献：
[1] Wlodarski KH. Prperfies and origin of osteoblasts.Chin Orthop, 1990， 252(3):276.
[2] Beresford JN, Bennett JH, Devlin C, et al. Evidence for an iverse relationship between the differentiation of adipocytic and osteogenic cells in rat marrow stromal cell cultrues. J Cell Sci, 1992，102:341.
[3] 李世勇，陈瑞梅，王植三，等.骨髓基质细胞分化成骨的实验研究.现代口腔医学杂志，1994，8(3)：134.
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[4] Maniatopoulos C, Sodek J, Melcher AH. Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res, 1988, 254(3):317.
[5] Benayahu D, Kletter Y, Zipori D, et al. Bone marrow derived stromalcell line expressing osteoblastic phenotype in vitro and osteogenic capacity in vivo. J Cell siol, 1989, 140(1):1.
[6] Gimble JM, Wanker F, Wang CS, et al. Regulationof bone marrow stromal cell differentiation by cytokines whose receptors share the gp 130 protein. J Cell Biochem, 1994, 54(1):122.
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[7] 王慧明.人胚成骨细胞体外分离连续传代培养的初步研究.华西口腔医学杂志，1994，12(3)：216.
[8] Locklin RM, Williamson MC, Beresford JN, et al. In vitro effects of growth factors and dexamethasone on rat marrow stromal cells. Clin Orthop, 1995, 33:27.
[9] Notoya K, Yoshida K, Tsukuda R, et al. Effect of ipriflavone on exporession of markers characteristic of the osteoblast phenotype in rat bone marrow stromal cell cultrue. J Bone Miner Res, 1994, 9(3):395.
[10] Long MW, Robinson JA, Ashcraft EA, et al. Regulation of human bone marrow-derived osteoprogenitor cells by osteogenic growth factors. J Clin Invest, 1995, 95(2):881.
收稿日期：1998-07-15, 百拇医药
单位：广西医科大学附属口腔医院(530021)
关键词：骨髓；基质细胞；成骨细胞；体外培养
口腔颌面外科杂志990308 摘 要：目的：建立一种新型的体外培养成骨细胞的生物学模型。并对其生物学特性进行研究。方法：选择大耳白兔骨髓基质细胞为材料进行体外成骨细胞培养实验，在不同培养体系中进行体外培养，通过倒置显微镜观察、透射电镜、扫描电镜、组织化学染色技术、钙染色等手段对获得的细胞进行生物学特性进行研究。结果：获得的细胞呈多种形态，有长短不一、大小不均的胞浆突起，且互相连接，细胞互相重叠呈复层生长，并形成细胞结节；胞浆丰富，富含线粒体、粗面内质网、高尔基体等，具有合成分泌功能旺盛的结构，与典型成骨细胞的形态结构相似。同时，胞浆富含碱性磷酸酶活性，在条件培养基中细胞发生钙化现象，这与典型成骨细胞的生物学特性相似。且获得的细胞在体外能连续传代，形态和功能不变。结论：我们认为用骨髓基质细胞为材料进行体外培养是成骨细胞体外培养的一种新型的生物学模型，为人工骨替代材料的研制、成骨细胞移植修复骨缺损等开辟了新的途径。
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中图分类号：R739.8
文献标识码：A
文章编号：1005-4979(1999)03-209-05
STUDY ON BIOLOGICAL CHARCACTERIZATION AND CULTRUE OF
STROMAL CELL OF BONE MARROW IN VITRO
PANG Fang-he, MENG Min, LIANG Zi-min
Hospital of Stomatology Guangxi Medical University. Guangxi Nanning 530021
Abstract: Objective： To establish a new model of osteoblasts culture in vitro and study it's biological characterization.Methods： The stromal cell of bone marrow was obtain from the trochanteric region of femur of rabbit and was cultured in the different cultural fluid dddin vitro. the cells were examined by phase-contrast microscope, transmission electron microscope, scanning electron microscope, histochemistry stains and calvaria strains. Results：The stromal cells were increased and lined up in one layer, had the same morphological feature. ALP activity, and demineralized matrix formed in vitro to those of osteoblasts. Conclusion:The cultrued stromal cells derived from the bone marrow were a new model of osteoblast culur in vitro.
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Key words: Bone marrow; Stromal cell; Osteoblast; Culur in vitro.
Peck在1964年首次将胎鼠骨组织进行体外成骨细胞培养，开创了成骨细胞体外培养技术用于研究骨代谢的新纪元。多年来，成骨细胞体外培养的生物学模型大多数是采用动物或人的骨质或骨膜，不仅取材困难，来源有限，而且对机体损伤大，不利于自体回植研究，临床价值有限。近年来，随着对成骨细胞来源及骨髓成骨潜能研究的深入，已证实成骨细胞来源于骨髓基质细胞，并可在体外培养转化为成骨细胞，在条件培养液中可以人为促进成骨[1]。本研究选择大耳白兔骨髓基质细胞为材料进行体外成骨细胞培养实验，目的在于建立一种新型的体外培养成骨细胞的生物学模型，并对其生物学特性进行研究，为进一步对成骨细胞的研究和应用开辟新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料及主要试剂
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体重为1.5～2.0kg的大耳白兔，雌雄不拘。常规RPMI 1640培养液(GIBCO)：内含20%新生小牛血清(杭州四季生物工程材料研究所)，50μg/ml维生素C,0.5mg/ml HEPES，100μ/ml青霉素，100μg/ml链霉素。条件RPMI 1640培养液：常规RPMI 1640培养液加入β-甘油磷酸钠(10mmol/L)、地塞米松(10-8mol/L)。D-Hank液、0.25%胰蛋白酶、骨髓穿刺手术用品、培养器皿及培养用液均无菌处理后备用。
1.2 取材
称取动物，2.5%硫喷妥钠注射液腹腔注射麻醉(30mg/kg)。无菌条件下分别自左右两侧股骨粗隆处用18号骨髓穿刺针共抽取骨髓悬液4～6ml，加入等体积的抗凝RPMI 1640培养液混均后，加至内含等体积，比重为1.077淋巴细胞分离液的离心管中，以2 000r/min×20min离心，收集界面的有核细胞层，再用D-Hank液洗涤两次，加入常规RPMI 1640培养液稀释，制成细胞悬液。
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1.3 骨髓基质细胞原代培养
将上述细胞悬液调整至1×106/ml的细胞密度取3ml分别接种于25ml培养瓶(有或无盖玻片)中，加入足量常规RPMI 1640培养液，密闭后置入37°C恒温培养箱中静置培养，一周后半量换液，以后隔3～4天换液并逐日观察。
1.4 骨髓基质细胞传代培养
经过12～14天培养，细胞增殖融合成层后，用0.25%胰蛋白酶消化按1∶1一分为二传代，并在每个培养瓶内预先放入两块长形盖玻片，其中一瓶与原代细胞培养条件相同作连续传代培养，周而复始。另留数瓶不作传代，加入条件RPMI 1640培养液长期培养，隔3～4天换液，拟观察钙盐沉着情况。
1.5 观察与鉴定
1.5.1 活体细胞显微镜观察：用倒置显微镜逐日观察培养细胞的生长情况和形态特征。
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1.5.2 HE染色：传代的培养细胞(第2代)接种培养4天后，把爬满细胞的盖玻片取出，用37°C生理盐水漂洗数次，经10%中性缓冲福尔马林液固定30min，进行常规HE染色。
1.5.3 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色：将原代生长成层及传代的培养细胞(第2代)接种培养4天，把爬满细胞的玻片取出，95%酒精固定10min，采用改良Gomonri钙-钴法测定细胞的ALP活性。阳性细胞计数方法为各代细胞随机计数三张染色，每张随机计数500个细胞，算出ALP阳性细胞均数及阳性率。
1.5.4 钙染色：将传代的培养细胞(第2代)接种培养28～35天，细胞呈复层生长并出现圆形或卵圆形结节，取出盖玻片，用37°C生理盐水漂洗数次，经10%中性缓冲福尔马林固定30min，作Von Kossa钙染色。
1.5.5 超薄切片透射电镜观察：将传代培养4天的细胞(第2代)，用0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，以800r/min×5min，低速离心收集细胞，经2.5%戊二醛液固定后，按常规透射电镜制片方法制成超薄切片，在TEM(H-500，HITACHI)下观察其超微结构。
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1.5.6 扫描电镜观察：将传代细胞(第2代)培养4天后，取出长满细胞的盖玻片，用37°C生理盐水漂洗2次后，经2.5%戊二醛液固定，按常规扫描电镜制片方法制成扫描电镜样本，在SEM(JSM-T300，JAPAN)下观察细胞形态。骨髓基质细胞经18～20天左右培养，细胞呈复层样生长，形成细胞结节
2 结果
2.1 倒置显微镜下细胞生长、形态的观察
原代细胞接种后48h，细胞出现纺锤形改变，即开始贴壁生长，随着培养时间延长，贴壁细胞明显增多，并分裂增殖。7～10天细胞呈多种形态外观：星形，三角形，多角形，长梭形等，胞体膨大，伸出长短不一，粗细不均的多种形态胞浆突起，胞核大，核仁1～2个，位于胞体一侧，细胞呈团簇状生长，分布不均，显示出集落生长趋势。中心细胞轮廓不清，体积变小，而周边细胞形态不变，至14天左右，细胞融合成单层。不作连续传代培养的细胞，集落成团中心细胞互相重叠形成复层，约30天后，中心细胞发生钙化，形成肉眼可见的散在白色点状物，集落外周细胞交错排列成网状(见图1)。传代细胞经0.25%胰蛋白酶消化后变形，呈圆形，经24h后恢复原来形态，并贴壁增殖，形态和原代细胞相似，4～5天后融合形成单层细胞。连续培养传了9代，均生长良好，后因细菌污染未能进一步观察。
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图1 骨髓基质细胞原代培养H-E染色(×100)
2.2 HE染色
光镜下所见，细胞形态为长梭形，三角形，多角形等，有多个树状突起，胞核圆形，呈浅兰色，胞浆呈细网状，并见较多胞浆颗粒。
2.3 ALP染色
细胞经染色后，胞浆的ALP显示为灰色，棕色，黑色沉淀，即为阳性。随着传代增加培养细胞ALP阳性率逐渐增高。均在75%以上。
2.4 钙染色
细胞经30天培养，Von Kossa染色后，可见黑色沉着物沿着胶原纤维走向分布，细胞间连接处亦见大量黑色沉着物，即Von Kossa染色阳性。
2.5 超薄切片TEM
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细胞有较多粗细长短不一的胞浆突起，胞体内胞浆丰富，有大量核糖体、线粒体，高尔基体及粗面内质网，有丰富的颗粒状电子致密物，胞核大，不规则，有1～2核仁，可见核突或核袋，染色质丰富，呈团簇样分布。
2.6 扫描电镜SEM
细胞呈多种形态，如三角形、鳞片形，星形，有较多的突起，相互连接，细胞互相重叠，呈多层样结构。(见图2)
图2 骨髓基质细胞传代培养扫描电镜观察(×200)细胞呈复层生长，互相重叠，呈多种生长形态，如三角形、多角形、星形等，并有较多的细胞突起且互相连接
3 讨论
3.1 骨髓基质细胞及其培养成骨潜能
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骨髓依其功能分为造血和基质系统。骨髓基质是指骨髓腔内为造血系统提供结构及功能支持的结缔组织，其成骨潜能来源于基质系统的基质细胞。Friedenstein等将鼠骨髓细胞上培养24h即见基质细胞贴附于管壁，3～4天后，形成数个成纤维样细胞组成的集落。这种集落是由单个细胞稳定地增生而来的，是克隆性的。随着培养时间延长，集落细胞增殖扩大，逐渐融合成层。大量的实验表明：体外培养骨髓基质细胞，可以稳定地形成成纤维样细胞组成的细胞集落，Friedenstein把形成集落的初始骨髓基质细胞称为成纤维样细胞集落形成单位(或细胞)(colony-forming unitfirbroblastie, CFU-F)。而且表明CFU-F是由基质干细胞和混合祖细胞组成，具有多种分化潜能，能进一步分化为成骨细胞系、成纤维细胞系、成脂肪细胞系[2]。同时CFU-F形成的细胞集落在大小、形态和酶活性等方面存在明显的差别，表明骨髓基质细胞CFU-F是多相细胞群体。Friedenstein等将获得的集落细胞移入微孔滤膜扩散室(millipore diffustion chamber, MDC)植入体内继续培养，观察到在扩散室内基质细胞进行了成骨活动，其成骨过程类似膜内成骨，即基质干细胞和骨祖细胞直接分化为成骨细胞并合成、分泌骨胶原，成骨细胞被埋于钙化骨胶原中而成为骨细胞。由于微孔膜滤扩散室的孔隙仅为0.45μm，只允许小分子的营养物、代谢物的自由出入，而周围组织细胞无法长入，因此证明扩散室内形成的骨组织是由骨髓基质细胞所为，而且没有骨吸收现象，表明MDC中的细胞是纯成骨性的。国内李世勇(1994年)的研究也证实这点[3]。Mamiatopoulos等[4](1988年)首次报道鼠骨髓基质细胞在体外培养能形成钙化的骨样组织，经X线衍射分析确定形成的钙化物具有羟基磷灰石结构，证明体外培养骨髓基质具有成骨能力。Benayahu等[5]将骨髓基质细胞体外培养获得具有典型的成骨细胞特性的细胞：具有较高的ALP活性，只产生Ⅰ型胶原，受PTH刺激则细胞内CAMP增加，在条件培养液中可以产生矿化的细胞外基质(Von Kossa，染色阳性)，并且装入MDC中体内培养可形成骨。Gimble等[6]在体外将骨髓基质细胞培养成功地转化为成骨细胞。现已证实：骨祖细胞有两种类型，一种为诱导性骨祖细胞(inducible osteogemic precursor cell, IOPC),是一种未分化的间叶细胞，存在于所有的结缔组织中，它们不能自发地形成骨组织，在骨形态发生蛋白(BMP)等诱导因子作用下可转化为成骨细胞系，产生异位骨质，但若诱导因素一旦去除，新形成的异位骨组织就会被吸收掉。另一种为定向性骨祖细胞(determined osteogenic precursor cell, DOPC)仅在骨髓基质、骨膜生发层及骺板软骨基质中发现，可自动向成骨细胞系转化，并有合成骨基质的能力。骨髓是唯一含有丰富的诱导性和定向性骨祖细胞的组织，且骨髓间叶细胞诱导成骨活性最强，骨髓中骨形成细胞即骨祖细胞属基质性，而且能和造血细胞分离开来，并在体外培养而获得，可转化为成骨细胞。因而用骨髓基质细胞为材料进行体外培养来建立成骨细胞体外培养模型是合乎逻辑的。本实验，用骨髓抽取物经淋巴分离液提取骨髓基质细胞进行体外培养，基质细胞在培养液中呈贴壁生长，经换液或传代，无粘附性杂细胞被清除，基质细胞得以纯化而继续培养。
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3.2 培养细胞的生物学特性：本实验培养的细胞呈贴壁生长，今对获得的细胞进行生物学多方面的研究。
3.2.1 细胞形态学特性：本实验获得的细胞在体外培养呈三角形、多角形、鳞片形、星形等多种形态，有粗细不均，长短不一的细浆突起，其形态特征和王慧明等[7]的报告相似，细胞呈集落样生长，无接触抑制，相互重叠成复层生长，并形成细胞结节。电镜下细胞可见典型蛋白质合成结构：胞浆富含线粒体、粗面内质网和高尔基体等，合成分泌功能旺盛，均符合成骨细胞的形态、长生特征。
3.2.2 酶化学特性：碱性磷酸酶是成骨细胞矿化过程中主要的功能活性酶，富含于胞浆中，它可分有机质中磷酸，增加局部无机磷酸浓度，促进矿化。本实验培养细胞，碱性磷酸酶染色呈阳性，且随传代及培养时间延长，阳性率增加。其主要原因是骨髓基质细胞是有多种分化潜能，除了有一部分自动分化成骨细胞外，其余部分在地塞米松等因素存在条件下，促进了其向成骨细胞方向转化。这是成骨细胞最具特征的生物学特性之一。
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3.2.3 体外矿化：本实验获得细胞在含有维生系C、β-甘油磷酸钠及地塞米松的培养条件下，连续培养了30天后，进行Von Kossa钙染色，呈阳性反应，表明了所获得的细胞在体外能够发生钙化现象，这和王慧明等研究结果一致，是成骨细胞最重要的生物学特征。骨髓基质细胞培养，必须在含有一定浓度的地塞米松和β-甘油磷酸钠的培养基中才能形成矿化，这是由于地塞米松不仅能促进成骨细胞分化成熟，诱导成骨，而且具有调节成骨样细胞合成胰岛素样生长因子和促进胶原合成的作用，刺激其碱性磷酸酶活性[8]；β-甘油磷酸钠提供磷离子作为ALP作用的底物，诱导和激活ALP，促进有机磷向无机磷转化，加速钙盐沉着。无地塞米松存在此现象消失[9]。
由此可见，我们用骨髓基质细胞进行外体培养获得的细胞具有以下特性：(1) 生长活跃，能体外传代，具有合成分泌功能的形态特征；(2) 具有较强的碱性磷酸酶活性；(3) 在条件培养基中可以体外钙化成骨，我们认为用骨髓基质细胞进行体外培养是成骨细胞体外培养的一种新型生物学模型。
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4 问题与展望
4.1 尽管骨髓基质细胞体外培养转化为成骨细胞已获得成功，但还存在一些问题
培养细胞间细胞污染问题：体外培养获得的骨髓基质细胞集落是由多种细胞群体组成，即基质干细胞和各种祖细胞，具有多种分化潜能，需进一步纯化。Long等[10]应用单细胞克隆技术从人骨髓中分离出纯净的骨相关细胞群，流式细胞仪显示，这群细胞由4个不同的亚群组成，分别是前成骨细胞、成骨细胞样细胞、族形成细胞和克隆形成细胞，他们是处于不断增殖之中的骨祖细胞。
骨髓基质细胞体外培养成骨的条件问题：骨髓基质细胞体外培养成骨的条件与其它来源的成骨细胞比有其特殊性，因为获得的细胞集落中只有其中的定向性骨祖细胞自发地向成骨细胞转化，故其分化成骨很大程度上依赖培养条件，刺激骨髓基质细胞成骨的条件及物质正在探索中。
4.2 应用展望
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采用骨髓为材料建立成骨细胞培养模型，不仅具有来源丰富，采集方便，安全，损伤小，供区无明显并发症，成骨能力确定等优点，而且为同源细胞，没有免疫原性，宜于自体回植应用研究，使成骨细胞移植成为可能。骨缺损即是由于具有骨形成能力的成骨细胞缺乏或不足所致，向病变处移植成骨细胞成治疗的关键。而成骨细胞的获得，必须通过体外培养大量繁殖，采用骨髓基质细胞为材料通过体外培养，建立“成骨细胞库”，向病变部位植入成骨细胞，增加局部成骨细胞数量，增强其成骨能力，为修复骨缺损找到了新途径。
近年来，随着三维多孔立体结构的合成性生物降解聚合物的研制成功，成骨细胞与该聚合物后形成具有生物活性植骨材料展现了广阔的临床应用前景。一方面，有少量供体组织在体外细胞培养大量繁殖，为缺损处组织再生提供足够的细胞来源，另一方面，可降解性生物材料具有良好的生物相容性和生物降解性，对培养细胞起支持、固定作用，且能在细胞转化、增殖过程中不断被分解吸收而起引导作用，并充当一种持续释放载体，增强其成骨能力，显示出优越的成骨性能。而同源骨髓基质细胞经体外培养后与该种聚合物聚合进行移植，无免疫反应，具有较高临床应用价值。
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作者简介：庞芳河(1966-)，男，讲师，医学硕士
参考文献：
[1] Wlodarski KH. Prperfies and origin of osteoblasts.Chin Orthop, 1990， 252(3):276.
[2] Beresford JN, Bennett JH, Devlin C, et al. Evidence for an iverse relationship between the differentiation of adipocytic and osteogenic cells in rat marrow stromal cell cultrues. J Cell Sci, 1992，102:341.
[3] 李世勇，陈瑞梅，王植三，等.骨髓基质细胞分化成骨的实验研究.现代口腔医学杂志，1994，8(3)：134.
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[4] Maniatopoulos C, Sodek J, Melcher AH. Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res, 1988, 254(3):317.
[5] Benayahu D, Kletter Y, Zipori D, et al. Bone marrow derived stromalcell line expressing osteoblastic phenotype in vitro and osteogenic capacity in vivo. J Cell siol, 1989, 140(1):1.
[6] Gimble JM, Wanker F, Wang CS, et al. Regulationof bone marrow stromal cell differentiation by cytokines whose receptors share the gp 130 protein. J Cell Biochem, 1994, 54(1):122.
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[7] 王慧明.人胚成骨细胞体外分离连续传代培养的初步研究.华西口腔医学杂志，1994，12(3)：216.
[8] Locklin RM, Williamson MC, Beresford JN, et al. In vitro effects of growth factors and dexamethasone on rat marrow stromal cells. Clin Orthop, 1995, 33:27.
[9] Notoya K, Yoshida K, Tsukuda R, et al. Effect of ipriflavone on exporession of markers characteristic of the osteoblast phenotype in rat bone marrow stromal cell cultrue. J Bone Miner Res, 1994, 9(3):395.
[10] Long MW, Robinson JA, Ashcraft EA, et al. Regulation of human bone marrow-derived osteoprogenitor cells by osteogenic growth factors. J Clin Invest, 1995, 95(2):881.
收稿日期：1998-07-15, 百拇医药