细胞培养在牙科材料生物相溶性试验中的运用
作者：刘 峰 综述 吴军正 审校
单位：第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032
关键词：细胞培养；牙科材料；生物相容性
牙体牙髓牙周病学杂志990259 中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)02-0177-03
在目前使用的材料生物相溶性试验方法中，每种试验方法都基本上由三个部分组成，即生物系统、细胞-材料接触及生物学终点和相应的记录系统。 体外细胞培养试验作为一种初级快速毒性筛选程序，在牙科和其他医用材料的生物安全性评价中具有十分重要的地位[1]。与动物实验和人类临床研究相比较， 离体毒性试验的优点为：可控制的实验条件、较低的花费、快速完成和无伦理问题。牙科材料细胞毒性试验的局限主要是对于活体刺激的模拟不足，以及对于患者实际数据推测的困难。
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潜在生物危害的分析表明：牙科充填材料接触活性组织(如牙髓、牙本质和牙龈)一段较长的时期，材料中的渗出物或小颗粒可能被患者吞下。在国际的规定[2，3]中，关于这种危害检验，推荐了几种试验方法，包括关于局部反应的细胞毒性试验及基因毒性试验。这样，评价试验的选择首先应建立在对于潜在生物危害的分析上，第二步则必须决定采用哪种试验方法。
1 细胞毒性试验
1.1 生物系统——细胞选择
患者口腔充填材料所接触的从牙髓或牙龈来的不同靶细胞，其全部都有特定的功能。在充填材料的离体试验中采用永久细胞系：如L929或3T3鼠成纤维细胞或原代细胞(主要是牙龈、口腔粘膜和牙髓成纤维细胞是最常用的)[4]。
永久细胞系可以说是相当简单的复制系统，但是它没有靶细胞在活体的特定新陈代谢势能。相反，原代细胞可以具有几乎完全象靶细胞的新陈代谢能力，因而，它们能较好的与活体状况相匹配[4]。然而， 永久细胞系和原代细胞(如牙龈细胞，牙周纤维细胞)在琼脂覆盖试验中， 有些原代细胞与永久细胞系相比有稍弱的敏感性趋势。但是，无论是永久细胞系还是原代细胞，琼脂覆盖试验所证明的主要影响是一样的[5]。因而，对于琼脂覆盖试验， 使用原代细胞并没有提供决定性的优势。这与Eiskjaer和Arenholt-Bindslev 试验甲醛的报告结果相吻合。永久细胞系应该在口腔充填材料毒性检测的标准检验中作为首选的生物系统。这也是ISO 10993(part 5)关于细胞培养标准的规定[3]。
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1.2 细胞-材料接触试验
在患者体内，口腔充填材料可以与龈缘、牙髓或牙本质接触，其接触方式可以是直接接触，也可以通过玷污层间接接触。在离体试验中，直接细胞-材料接触方法在一定的条件下与活体状况近似，如牙髓暴露时。但在实验过程中还存在技术问题，如试验材料培养过程中的细菌污染，在大多数试验中无法既做到消毒又不使材料发生决定性变化或细胞机械损伤。在间接细胞-材料接触方法中使用琼脂、琼脂胶糖或醋酸纤维素滤纸，细胞层可以得到保护而不受细菌污染和机械损伤。但是，这些屏障对于活体状况的模拟并不能完全与活体状况一样[6]。
Tyas首先用牙本质作为细胞与实验材料间的屏障(barries)[7]，即将取材于人第三磨牙的牙本质切成薄片或使用经压制而成的牙本质片。但是，这些方法涉及到一些难题，因为可以利用的合适的人牙本质的数量是很有限的，牙本质薄片间存在的液体传导的差异很大，另外，压制形成的牙本质薄片，如Tyas所用的和自然人的解剖结构并不一致。使用牛牙本质圆片，其可利用的数量几乎是无限的。细胞可以在这些圆片上生长，而且牛牙本质液体传导力与人的基本一样[8]。
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另一可选择作为细胞-材料接触的物质为洗出液。这些液体很容易控制，它们可以被离心或消毒过滤，且可与细胞直接接触。如MTT 比色法和细胞增殖度法等[9]。
125I-UdR释放法则是将材料直接加入靶细胞悬液中， 使二者接触一定时间后，测定受损细胞中释放的125I-UdR脉冲数进行定量分析。此法可以弥补其他方法的一些不足之处(如材料与细胞不能直接接触，依靠肉眼观察评价细胞损伤情况，采用人工计数，缺少定时分析和客观的仪器测定等)。 该方法已被广泛应用于肿瘤免疫和基础免疫学研究，是评价牙科材料和生物材料细胞毒性的新方法[1]。
1.3 生物学终点及其配套的记录系统
在患者的体内，局部毒性反应可以从形态上加以记录。如显著的解剖学、组织学或生理学反应，血液流动、疼痛等临床试验反应。在离体试验中，细胞反应也可以从形态学来描述，如琼脂覆盖试验中记录细胞溶解指数。无论如何，这种方法被认为是唯一定性的或在实际中至多是半定量分析。此外，有些牙科充填材料含有或可以释放出相当数量的甲醛——一种细胞固定剂[10]。如果在细胞培养中使用甲醛，在镜下细胞的形态将显示正常的形态，似乎细胞并未遭到损害，而实际上细胞已经死亡[11]。
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使用增殖率记录细胞损失是一种最古老又最常用的方法。直接的细胞计数很容易进行，通过活细胞可以结合某种染色剂而死细胞不能的方法，以排除死细胞。胞膜作用可以被中性红所证明，中性红存在于活细胞中，胞膜破碎后释放于周围介质中[12]。
细胞活力试验是建立在一定物质的反转率基础上的，通过它可以测试一种酶或一组酶或其它物质的活性。一种常用的方法为MTT试验， 它是建立在琥铂酸脱氢酶——一种线粒体中酶的活性基础上的。这种方法是近年来被推荐的检测口腔材料细胞毒性作用的有效方法之一，该方法快速、简便、价廉，便于推广[9]。
2 基因毒性试验
2.1 生物测试系统
关于药品和牙科材料安全试验的国际标准[2，3]中收录了已完好建立的细胞菌株或适当的哺乳动物细胞系的指标。大约300种不同类型的药品由 Salmonella微粒体(microsome)试验评定，证明了基因突变性与致癌性之间有较高的相关性[11]。约90%的致癌剂包括已知的人致癌剂在测试中诱变，大约13%的非致癌剂表现出不同程度的诱变活性。实验已经表明未固化的根管充填材料(AH26)是以环氧树脂为基质对Salmonella typhimurium菌株有遗传诱变性。环氧树脂已被公认为在未固化状态下是一种遗传诱变物质[13]。
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细菌有异于人类的遗传器官，因而，哺乳动物细胞仍用来作基因毒性试验。常用的细胞系遗传器官V79中国仓鼠肺成纤维细胞有22对染色体。 尽管这样，用这些细胞系进行实验的经验却很少。国际标准(ISO) 推荐同时使用细菌和细胞系作为生物试验系统[2，3]。
2.2 细胞-材料接触
组织培养琼脂覆盖试验是为了直接检验固体材料中可浸出的有毒生物物质的存在而设计的。它对于各种各样的固体材料或装置的固体成分都是合适的试验项目。液体化学试剂、溶剂和提取物都可以作此试验[3]。在含菌的琼脂表面放置材料样本是一简捷的手段。
2.3 生物学终点
离体基因毒性试验的生物学终点在DNA或染色体(染色体畸变) 中发生变化。终点诱变由在一定条件下几种计划使用的细菌或细胞的主要结构所决定[11]。染色体结构的改变由细胞系中染色体形态的改变而控制。对于口腔材料有一些检测点诱变的报告, 但是在记录中关于染色体畸变的报告却很少。国际标准推荐包括点诱变和染色体畸变的试验作为生物学终点[2]。
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3 实验数据的正确分析
对于口腔充填材料毒性试验的实验分析表明，大多数实验对活体状况的模拟与活体实际状况差异很大。实验结果在很大程度上依赖于所使用的试验系统的性质(生物学试验系统，细胞-材料接触和生物学终点)。因此，这些实验主要应用于急性毒性反应。离体毒性试验的结果只能理解为一系列紧密相关的材料，用于材料的相关毒性分析。这一点适用于所有牙科材料。从细胞培养到患者不可能存在一种直接而简单的数据推断。
在这些局限下，从离体实验得到的数据被建议用于甄别，即用于排除一系列新的和有效的治疗物质中最有毒性的物质的甄别，从而确定它们是否值得进一步的发展。尽管这样，使用细胞毒性试验，可以发生有效使用的材料被从进一步的发展中排除掉，如氧化锌-丁子香酚(eugend)。因此，依赖这些试验作为简单的甄别手段会造成误入歧途(misleading)[12]。
离体数据仍可以用于具有特殊性能的新材料的生物活性的检测，如同一种新材料可以通过几种物理试验以确定其性质。这种确定性质的方法建立在物理的、化学的和生物数据的基础上， 由专家用来评估新材料在患者体内的行为， 由ISO 10993[3]推荐。从这点上看， 从生物离体试验中得出的数据与从物理试验中得到的数据一样有价值。
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生物离体数据较重要的应用是对一反应产生的生物学机理的阐明。活体动物实验和临床研究主要证明一种现象，而不是其后的机理。离体系统能够解释这些机理，因为复杂的活体系统的不同方面可以在离体分别被研究。关于牙科材料的生物学作用机理的报道，仍支持着材料的进一步发展。
4 结论
如果考虑了以上这些方法的局限性，特别是对于实验结果的正确理解，用于口腔材料的毒性甄别的细胞培养试验是一种简明的评价材料生物学行为的有价值的手段。由于以上提及的有关细胞培养试验的局限性，因而，细胞培养方法不能代替动物实验。尽管如此，使用细胞培养可以减少动物实验。如果已知材料的生物作用机理(例如某组份造成了它的毒性)，通过细胞毒性实验明确材料的发展是可能的。这样可以只需要很少量的动物实验，新材料就可以确定下来。材料生物相溶性的进一步研究应该集中在细胞培养中对活体状态更好的模拟上。
参考文献
, 百拇医药
1 吕小迎,薛淼,徐淑卿.一种评价牙科和生物材料细胞毒性的有效方法125I-UdR-释放法. 口腔材料器械杂志, 1997,6(1):5
2 International Organization for Standardization. Technical Report No.7405:Biological Testing for Dental Materials. London:ISO,1984
3 International Organization for Standardization.ISO 10993:Biological Evaluation of Meedical Devices.London:ISO,1992
4 Arenholt-Bindslev D, Bleeg H. Characterization of two types of human oral fibroblasts with a potential application to cellular toxicity studies:tooth pulp fibroblasts and buccal mucosa fibroblasts. Int Endod J, 1990,23:84
, 百拇医药
5 Schmalz G. A reproducibility study on the agar diffusion test. J Dent Res, 1982,61:577
6 Schmalz G, Hiller KA, Dorter-Aslan F. New developments in the filler test system for cytotoxicity testing. J Mat Sci Mater Med, 1994,5:43
7 Tyas MJ. A method for in vitro toxicity testing of dental restorative materials. J Dent Res，1977,56:D119
8 Weis K,Schmalz G,Hiller KA.Perfusion through bovine dentine.J Dent Res,1992,71:599
, 百拇医药
9 郝建军. 牙科材料细胞毒性试验. 牙体牙髓牙周病学杂志, 1997,7(2):135
10 Oysaed H,Ruyter JE,Sjovik Kleven IJ.Release of formaldehyde from dental composites.J Dent Res,1988,67:1278
11 Schmalz G, Netuschil L. A modification of the cell culture agar diffusion test using fluorescein diacetate. J Biomed Mater Res，1985,19:653
12 McCann J, Choi E, Yamasaki E et al. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. PartⅠ Proc Nartl Acad Sci, 1975,72:5135
13 Schmalz G，Schweikl H. A semi-automated cell culture evaluationsystem for cytotoxicity testing of dental materials. J Mat Sci Mater Med，1990,4:228
收稿日期：1997-10-08, 百拇医药
单位：第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032
关键词：细胞培养；牙科材料；生物相容性
牙体牙髓牙周病学杂志990259 中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)02-0177-03
在目前使用的材料生物相溶性试验方法中，每种试验方法都基本上由三个部分组成，即生物系统、细胞-材料接触及生物学终点和相应的记录系统。 体外细胞培养试验作为一种初级快速毒性筛选程序，在牙科和其他医用材料的生物安全性评价中具有十分重要的地位[1]。与动物实验和人类临床研究相比较， 离体毒性试验的优点为：可控制的实验条件、较低的花费、快速完成和无伦理问题。牙科材料细胞毒性试验的局限主要是对于活体刺激的模拟不足，以及对于患者实际数据推测的困难。
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潜在生物危害的分析表明：牙科充填材料接触活性组织(如牙髓、牙本质和牙龈)一段较长的时期，材料中的渗出物或小颗粒可能被患者吞下。在国际的规定[2，3]中，关于这种危害检验，推荐了几种试验方法，包括关于局部反应的细胞毒性试验及基因毒性试验。这样，评价试验的选择首先应建立在对于潜在生物危害的分析上，第二步则必须决定采用哪种试验方法。
1 细胞毒性试验
1.1 生物系统——细胞选择
患者口腔充填材料所接触的从牙髓或牙龈来的不同靶细胞，其全部都有特定的功能。在充填材料的离体试验中采用永久细胞系：如L929或3T3鼠成纤维细胞或原代细胞(主要是牙龈、口腔粘膜和牙髓成纤维细胞是最常用的)[4]。
永久细胞系可以说是相当简单的复制系统，但是它没有靶细胞在活体的特定新陈代谢势能。相反，原代细胞可以具有几乎完全象靶细胞的新陈代谢能力，因而，它们能较好的与活体状况相匹配[4]。然而， 永久细胞系和原代细胞(如牙龈细胞，牙周纤维细胞)在琼脂覆盖试验中， 有些原代细胞与永久细胞系相比有稍弱的敏感性趋势。但是，无论是永久细胞系还是原代细胞，琼脂覆盖试验所证明的主要影响是一样的[5]。因而，对于琼脂覆盖试验， 使用原代细胞并没有提供决定性的优势。这与Eiskjaer和Arenholt-Bindslev 试验甲醛的报告结果相吻合。永久细胞系应该在口腔充填材料毒性检测的标准检验中作为首选的生物系统。这也是ISO 10993(part 5)关于细胞培养标准的规定[3]。
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1.2 细胞-材料接触试验
在患者体内，口腔充填材料可以与龈缘、牙髓或牙本质接触，其接触方式可以是直接接触，也可以通过玷污层间接接触。在离体试验中，直接细胞-材料接触方法在一定的条件下与活体状况近似，如牙髓暴露时。但在实验过程中还存在技术问题，如试验材料培养过程中的细菌污染，在大多数试验中无法既做到消毒又不使材料发生决定性变化或细胞机械损伤。在间接细胞-材料接触方法中使用琼脂、琼脂胶糖或醋酸纤维素滤纸，细胞层可以得到保护而不受细菌污染和机械损伤。但是，这些屏障对于活体状况的模拟并不能完全与活体状况一样[6]。
Tyas首先用牙本质作为细胞与实验材料间的屏障(barries)[7]，即将取材于人第三磨牙的牙本质切成薄片或使用经压制而成的牙本质片。但是，这些方法涉及到一些难题，因为可以利用的合适的人牙本质的数量是很有限的，牙本质薄片间存在的液体传导的差异很大，另外，压制形成的牙本质薄片，如Tyas所用的和自然人的解剖结构并不一致。使用牛牙本质圆片，其可利用的数量几乎是无限的。细胞可以在这些圆片上生长，而且牛牙本质液体传导力与人的基本一样[8]。
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另一可选择作为细胞-材料接触的物质为洗出液。这些液体很容易控制，它们可以被离心或消毒过滤，且可与细胞直接接触。如MTT 比色法和细胞增殖度法等[9]。
125I-UdR释放法则是将材料直接加入靶细胞悬液中， 使二者接触一定时间后，测定受损细胞中释放的125I-UdR脉冲数进行定量分析。此法可以弥补其他方法的一些不足之处(如材料与细胞不能直接接触，依靠肉眼观察评价细胞损伤情况，采用人工计数，缺少定时分析和客观的仪器测定等)。 该方法已被广泛应用于肿瘤免疫和基础免疫学研究，是评价牙科材料和生物材料细胞毒性的新方法[1]。
1.3 生物学终点及其配套的记录系统
在患者的体内，局部毒性反应可以从形态上加以记录。如显著的解剖学、组织学或生理学反应，血液流动、疼痛等临床试验反应。在离体试验中，细胞反应也可以从形态学来描述，如琼脂覆盖试验中记录细胞溶解指数。无论如何，这种方法被认为是唯一定性的或在实际中至多是半定量分析。此外，有些牙科充填材料含有或可以释放出相当数量的甲醛——一种细胞固定剂[10]。如果在细胞培养中使用甲醛，在镜下细胞的形态将显示正常的形态，似乎细胞并未遭到损害，而实际上细胞已经死亡[11]。
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使用增殖率记录细胞损失是一种最古老又最常用的方法。直接的细胞计数很容易进行，通过活细胞可以结合某种染色剂而死细胞不能的方法，以排除死细胞。胞膜作用可以被中性红所证明，中性红存在于活细胞中，胞膜破碎后释放于周围介质中[12]。
细胞活力试验是建立在一定物质的反转率基础上的，通过它可以测试一种酶或一组酶或其它物质的活性。一种常用的方法为MTT试验， 它是建立在琥铂酸脱氢酶——一种线粒体中酶的活性基础上的。这种方法是近年来被推荐的检测口腔材料细胞毒性作用的有效方法之一，该方法快速、简便、价廉，便于推广[9]。
2 基因毒性试验
2.1 生物测试系统
关于药品和牙科材料安全试验的国际标准[2，3]中收录了已完好建立的细胞菌株或适当的哺乳动物细胞系的指标。大约300种不同类型的药品由 Salmonella微粒体(microsome)试验评定，证明了基因突变性与致癌性之间有较高的相关性[11]。约90%的致癌剂包括已知的人致癌剂在测试中诱变，大约13%的非致癌剂表现出不同程度的诱变活性。实验已经表明未固化的根管充填材料(AH26)是以环氧树脂为基质对Salmonella typhimurium菌株有遗传诱变性。环氧树脂已被公认为在未固化状态下是一种遗传诱变物质[13]。
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细菌有异于人类的遗传器官，因而，哺乳动物细胞仍用来作基因毒性试验。常用的细胞系遗传器官V79中国仓鼠肺成纤维细胞有22对染色体。 尽管这样，用这些细胞系进行实验的经验却很少。国际标准(ISO) 推荐同时使用细菌和细胞系作为生物试验系统[2，3]。
2.2 细胞-材料接触
组织培养琼脂覆盖试验是为了直接检验固体材料中可浸出的有毒生物物质的存在而设计的。它对于各种各样的固体材料或装置的固体成分都是合适的试验项目。液体化学试剂、溶剂和提取物都可以作此试验[3]。在含菌的琼脂表面放置材料样本是一简捷的手段。
2.3 生物学终点
离体基因毒性试验的生物学终点在DNA或染色体(染色体畸变) 中发生变化。终点诱变由在一定条件下几种计划使用的细菌或细胞的主要结构所决定[11]。染色体结构的改变由细胞系中染色体形态的改变而控制。对于口腔材料有一些检测点诱变的报告, 但是在记录中关于染色体畸变的报告却很少。国际标准推荐包括点诱变和染色体畸变的试验作为生物学终点[2]。
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3 实验数据的正确分析
对于口腔充填材料毒性试验的实验分析表明，大多数实验对活体状况的模拟与活体实际状况差异很大。实验结果在很大程度上依赖于所使用的试验系统的性质(生物学试验系统，细胞-材料接触和生物学终点)。因此，这些实验主要应用于急性毒性反应。离体毒性试验的结果只能理解为一系列紧密相关的材料，用于材料的相关毒性分析。这一点适用于所有牙科材料。从细胞培养到患者不可能存在一种直接而简单的数据推断。
在这些局限下，从离体实验得到的数据被建议用于甄别，即用于排除一系列新的和有效的治疗物质中最有毒性的物质的甄别，从而确定它们是否值得进一步的发展。尽管这样，使用细胞毒性试验，可以发生有效使用的材料被从进一步的发展中排除掉，如氧化锌-丁子香酚(eugend)。因此，依赖这些试验作为简单的甄别手段会造成误入歧途(misleading)[12]。
离体数据仍可以用于具有特殊性能的新材料的生物活性的检测，如同一种新材料可以通过几种物理试验以确定其性质。这种确定性质的方法建立在物理的、化学的和生物数据的基础上， 由专家用来评估新材料在患者体内的行为， 由ISO 10993[3]推荐。从这点上看， 从生物离体试验中得出的数据与从物理试验中得到的数据一样有价值。
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生物离体数据较重要的应用是对一反应产生的生物学机理的阐明。活体动物实验和临床研究主要证明一种现象，而不是其后的机理。离体系统能够解释这些机理，因为复杂的活体系统的不同方面可以在离体分别被研究。关于牙科材料的生物学作用机理的报道，仍支持着材料的进一步发展。
4 结论
如果考虑了以上这些方法的局限性，特别是对于实验结果的正确理解，用于口腔材料的毒性甄别的细胞培养试验是一种简明的评价材料生物学行为的有价值的手段。由于以上提及的有关细胞培养试验的局限性，因而，细胞培养方法不能代替动物实验。尽管如此，使用细胞培养可以减少动物实验。如果已知材料的生物作用机理(例如某组份造成了它的毒性)，通过细胞毒性实验明确材料的发展是可能的。这样可以只需要很少量的动物实验，新材料就可以确定下来。材料生物相溶性的进一步研究应该集中在细胞培养中对活体状态更好的模拟上。
参考文献
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1 吕小迎,薛淼,徐淑卿.一种评价牙科和生物材料细胞毒性的有效方法125I-UdR-释放法. 口腔材料器械杂志, 1997,6(1):5
2 International Organization for Standardization. Technical Report No.7405:Biological Testing for Dental Materials. London:ISO,1984
3 International Organization for Standardization.ISO 10993:Biological Evaluation of Meedical Devices.London:ISO,1992
4 Arenholt-Bindslev D, Bleeg H. Characterization of two types of human oral fibroblasts with a potential application to cellular toxicity studies:tooth pulp fibroblasts and buccal mucosa fibroblasts. Int Endod J, 1990,23:84
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5 Schmalz G. A reproducibility study on the agar diffusion test. J Dent Res, 1982,61:577
6 Schmalz G, Hiller KA, Dorter-Aslan F. New developments in the filler test system for cytotoxicity testing. J Mat Sci Mater Med, 1994,5:43
7 Tyas MJ. A method for in vitro toxicity testing of dental restorative materials. J Dent Res，1977,56:D119
8 Weis K,Schmalz G,Hiller KA.Perfusion through bovine dentine.J Dent Res,1992,71:599
, 百拇医药
9 郝建军. 牙科材料细胞毒性试验. 牙体牙髓牙周病学杂志, 1997,7(2):135
10 Oysaed H,Ruyter JE,Sjovik Kleven IJ.Release of formaldehyde from dental composites.J Dent Res,1988,67:1278
11 Schmalz G, Netuschil L. A modification of the cell culture agar diffusion test using fluorescein diacetate. J Biomed Mater Res，1985,19:653
12 McCann J, Choi E, Yamasaki E et al. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. PartⅠ Proc Nartl Acad Sci, 1975,72:5135
13 Schmalz G，Schweikl H. A semi-automated cell culture evaluationsystem for cytotoxicity testing of dental materials. J Mat Sci Mater Med，1990,4:228
收稿日期：1997-10-08, 百拇医药