反转录PCR检测胶质源性神经营养因子在牙髓炎症尾侧亚核的表达
作者：陆 群1 郭敬俊1 肖明振1 吴补领1 宋俊峰2
单位：第四军医大学：1.口腔医学院；2.神经生物教研室，陕西 西安 710032
关键词：胶质源性神经营养因子；RT-PCR；尾侧亚核；炎症；牙髓
牙体牙髓牙周病学杂志990204 摘要 目的：探讨牙齿正常状态和炎症过程早、中、晚期胶质源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)的基因表达变化。方法：在大鼠牙髓炎模型上，分别摘提取正常鼠及炎症鼠早、中、晚期的尾侧亚核,提取总RNA,用RT-PCR一步法扩增GDNF mRNA,琼脂糖凝胶电泳照像。结果：正常鼠尾侧亚核GDNF mRNA有一定水平的基础量表达；炎症急性期GDNF mRNA表达量略有下降；炎症修复期GDNF mRNA表达量上升至高峰后回落至高于基础表达量的水平。结论：牙髓炎修复期GDNF在尾侧亚核F的表达增高，提示GDNF可能参与炎症牙髓神经修复再生过程，对神经末稍再生发芽有促生长作用。
, 百拇医药
中图号：R781.31 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)02-0102-03
Expression of GDNF mRNA of caudate subnucleus
in rat inflammation denatal pulp by RT-PCR
Lu Qun，Guo Jingjun，Xiao Mingzhen et al
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aim: Investigation of the expression of GDNF mRNA of caudat subnucleus in different stages of rat inflammation dental pulp. Methods: Model of rat inflammation dental pulp was established and total RNA was extracted from caudat subnucleus in different stages of rat inflammation tooth. The desired DNA product was obtained from total RNA by RT-PCR. cDNA was amplified and showed on 2% agarose. Results: A 337 bp band was showed on 2% agarose. The extension of light was strong in middle stages of rat inflammation dental pulp,while it was weak in earlier stage and later stage. Conclusion: The results suggest that GDNF may take part in regulating nerve-sprouting reactions during dental restorative process.
, 百拇医药
key words GDNF；RT-PCR；caudate subnucleus；dental pulp;inflammation
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(2):102]
胶质源性神经营养因子 (glial cell line-derived neurotrophic factor ，GDNF)是新近发现的神经营养因子家族成员之一，其较NGF具有更强的促神经再生能力[1,2]。GDNF除存在于神经系统外，还存在于感觉神经丰富的器官如：牙齿、眼、鼻。牙髓神经快速生长期GDNF在牙胚组织表达较强，可诱导三叉神经向髓腔伸长，并对牙髓神经的发育起重要促进作用[3]。有关在炎症状态时GDNF表达是否改变及其与牙髓神经再生修复的关系目前尚未见研究报道。本实验利用RT-PCR技术研究正常鼠和牙髓炎症鼠的不同时期GDNF在牙髓神经中枢尾侧亚核表达量变化，探讨GDNF是否参与炎症修复期牙髓神经再生，及其在牙髓炎症反应中的作用。
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1 材料和方法
1.1 材料
高速低温离心机(Sigma 2MK)；eppendorf PCR仪(Germany)；烤箱(101-2型，上海实验仪器厂)；水平电泳仪(上海实验仪器厂)；紫外灯显像及照像系统(MODEL 2F-3，上海实验仪器厂)。
Trizol总RNA提取试剂盒(Gibco USA)；一步法RT-PCR试剂盒(Gibco USA)；PCR Marker(华美生物工程公司)；DEPC水，(Gibco USA)。
1.2 方法
1.2.1 鼠牙炎症模型建立和分组
运用5g/L的α-内毒素(Sigma公司，USA)作用在鼠牙右侧的穿髓点15min，然后用玻璃离子水门汀封闭制做炎症牙髓模型[14]。按封药后观察时间的长短分3d组、6d组、9d组、12d组，以及正常鼠牙组共5组。 此模型特点为牙髓存活时间长，牙髓组织有足够时间参与免疫应答及免疫防御过程，机体有足够时间展示修复再生功能[4]。
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1.2.2 尾侧亚核总RNA的抽提
不同时间点处死动物，心脏灌注后开颅取双侧尾侧亚核。将各组的尾侧亚核放入2ml的匀浆器，加入1ml Trizol变性液中充分匀浆，异丙醇沉淀，氯仿抽提，750ml/L乙醇洗去盐份，所得的沉淀物用30μl DEPC处理过水溶解，取其中5μl释液100倍后测A260、 A280 、 A230 ，A260/A280>1.7, A260/A230>1.5，若低于1.7、1.5的标准线，表示有蛋白质污染和盐分残存。
1.2.3 引物设计(第四军医大学神经生物研究所，宋俊峰博士惠赠)
由军科院八所合成，其序列5'端引物5'-TCA CCA AAA CAA ATG GCA GTG-3',3'端引物5'-GGA CGA CTC AGA TAC CAC ACC TTT TAG-3'5'端引物3'端引物浓度为25pmol.
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1.2.4 一步法RT-PCR
在50μl反应体积中含引物P1引物P2各1μl，MgSO43μl,2×反应缓冲液25μl(内包括四种NTP各0.4mMol)，加模板1ng 根据A260=1 的 RNA 溶液每豪升约含40μgRNA，计算出各组模板量1ng所需的体积数，加DEPC处理过水至49μl，后94℃，5min，放冰浴骤冷从而可减少DNA的二级结构形成，然后加RT/Tag混合酶1μl， 后加石蜡油20μl覆盖，以避免反复升温所致的水分的散失。各样品在55℃孵育，30min，反转录cDNA链后,进入PCR程序(94℃，3min，杀灭不耐高温的反转录RT酶的活性后，按94℃，40s，55℃，1min，72℃，1min顺序循环30次，72℃延伸5min，温度降至4℃)。待PCR完成， 样品移至-20℃冰箱保存。
样品制备完成后取样10μl,20g/L琼脂糖凝胶电泳检测正常组，炎症3d组，炎症6d组，炎症9d组，炎症12d组PCR产物量
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1.2.5 20g/L琼脂糖电泳观察
琼脂糖0.6g加1×TAE电泳缓冲液至30ml在三角锥瓶加热至琼脂糖全部溶解，冷却到60℃，加入0.5g/L溴化乙锭，充分混匀，灌入水平电泳槽，1×TAE电泳缓冲液浸没，取10μL PCR扩增产物，加1μ l 上样缓冲液， 与 PCR Marker一道电泳，电泳电压5V/cm，待指示剂移至适当的距离，紫外灯下观察结果，照像。
2 结果 (图1)
图1 GDNF在大鼠牙髓炎尾侧亚核的表达变化
凝胶电泳带位于PCR Marker的377bp片段，与预期结果一致。
正常组，尾侧亚核有一基础表达量，PCR产物电泳带亮度相对比较弱
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炎症3d组，GDNF PCR电泳带亮度较正常组低。
6d组，GDNFPCR电泳带亮度比3d组明显增加。
9d组，GDNF表达量为最多，表现在凝胶电泳上PCR电泳带亮度最强。
12d组，GDNF较9d组PCR电泳带亮度。但较正常组PCR的亮度强。
穿髓侧(右侧)与非穿髓侧的尾侧亚核的GDNF表达无明显差异。
3 讨论
胶质源性神经营养因子(Glial Cell line-derived neurotropic factor，GDNF)是在胶质细胞瘤中发现并克隆成功的。最初发现其有促脊髓运动神经元和中脑多巴胺神经元神经营养活性。随后研究表明GDNF对感觉神经元有广谱且强大的促神经营养活性。GDNF不仅存在于中枢神经系统，而且也存在于外周神经系统靶器官如正在发育的感觉器官牙齿、内耳、眼、舌乳头等。
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GDNF的mRNA表达量在牙齿发育不同时期含量有明显差异，有明显的阶段性的表达特点。采用原位杂交技术研究表明GDNF在牙胚神经发育高峰期即出生前一周和出生后一周(E15-P7)高表达[5]。而出生二周后GDNF表达明显减弱，可见GDNF在神经快速生长期表达量一过性增高，并对神经生长，发育、分化有重要促生长作用。
牙髓神经对外界刺激反应根据牙髓损伤程度和炎症的不同时期划分为即时反应，早期修复反应和晚期反应三阶段。即时反应多发生于损伤后几分钟内，在靠近受损部位的牙髓神经纤维出现变性坏死。 随后残存的纤维异常敏感，并释放神经肽到周围组织中，神经末稍对神经肽及神经营养因子积极应答，CGRP阳性神经纤维向受损处成牙本质细胞和牙髓组织方向延伸。即有大量SP、CGRP阳性纤维的增生发芽。随后几周，肉芽组织逐渐替代炎性组织，神经发芽再生逐渐减弱消失。而调节神经轴突、发芽再生的重要因素可能是受损处牙髓纤维细胞分泌[7，8]大量的NGF。
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牙髓神经纤维的胞体在三叉神经节，后投射到尾侧亚核，换元后上行投射至丘脑，在丘脑再次换元，最终投射到大脑皮层[6]。本实验利用RT-PCR 技术检测到牙齿的上极神经元尾侧亚核区域内GDNF表达变化，结果示GDNF在炎症3d时表达减弱，这与机体对外界刺激的应激反应，和大量牙髓神经坏死有关。也可能是α-内毒素本身对GDNF有短暂抑制作用。
炎症6d组表达量开始增多，九天组达到高峰， 12d组维持在一定水平，此种表达曲线变化反应了牙髓炎症动态变化的特点，并说明了炎症修复期除有NGF外，还有GDNF等神经营养因子同时参与神经再生发芽过程，并对牙髓神经修复再生起重要的促生长作用。正常鼠GDNF有一较弱水平基础表达量。这一基础表达量，可能在维持牙髓神经生理性凋亡与再生的动态平衡中起调节作用。
穿髓侧(右侧)与非穿髓侧的尾侧亚核的GDNF表达无明显差异，提示一侧牙神经损伤可引起双侧尾侧亚核的神经营养因子表达增多，而正常牙齿可能因有较完善神经末稍增生抑制系统，不会导致炎症牙髓神经末稍的增生发芽的现象出现。
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参考文献
1 Nosrat CA, Tomac A, Hoffer BJ. Cellular and developmental patterns of expression of Ret and glial cell line-derived neurotrophic factor receptor alpha mRNAs. Exp Brain Res, 1997，115:410
2 宋俊峰. GDNF在大鼠神经系统发育分化中的基因表达分布与变化及人GDNF基因克隆与表达：学位论文. 西安：第四军医大学，1997.6
3 Luukko K,Suvanto P,Saarma M. Expression of GDNF and it receptor in developing tooth is developmentally regulated and suggests multiple roles in innervation and organogenesis.Dev Dyn,1997，210:463
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4 侯本祥，史俊南，丰泽浯等. 内毒素脂多糖刺激大鼠牙髓的组织病理学反应. 牙体牙髓牙周病学杂志， 1997，7(1)：12
5 Buj Bello A,Buchnan-VL. GDNF in an age-specific survival factor for sensory and autonomic neurons. Neuron. 1995，15:821
6 Aghabei B.The pathophysiology of Pain. British Dental Journey,1992，173:9
7 Byer MR, Swift ML,Wheeler EF.Reactions of sensory nerves to dental restorative procedures. Pro Finn Dent Soc. 1992，88suppl:73
8 Nosrat CA,Fried K,Ebendal T. NGF, BDNF,NT3,NT4 and GDNF in tooth development.Eur J Oral Sci，1998，106:94
收稿日期：1998-12-08
修回日期：1999-03-20, 百拇医药(陆 群1 郭敬俊1 肖明振1 吴补领1 宋俊峰2)
单位：第四军医大学：1.口腔医学院；2.神经生物教研室，陕西 西安 710032
关键词：胶质源性神经营养因子；RT-PCR；尾侧亚核；炎症；牙髓
牙体牙髓牙周病学杂志990204 摘要 目的：探讨牙齿正常状态和炎症过程早、中、晚期胶质源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)的基因表达变化。方法：在大鼠牙髓炎模型上，分别摘提取正常鼠及炎症鼠早、中、晚期的尾侧亚核,提取总RNA,用RT-PCR一步法扩增GDNF mRNA,琼脂糖凝胶电泳照像。结果：正常鼠尾侧亚核GDNF mRNA有一定水平的基础量表达；炎症急性期GDNF mRNA表达量略有下降；炎症修复期GDNF mRNA表达量上升至高峰后回落至高于基础表达量的水平。结论：牙髓炎修复期GDNF在尾侧亚核F的表达增高，提示GDNF可能参与炎症牙髓神经修复再生过程，对神经末稍再生发芽有促生长作用。
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中图号：R781.31 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)02-0102-03
Expression of GDNF mRNA of caudate subnucleus
in rat inflammation denatal pulp by RT-PCR
Lu Qun，Guo Jingjun，Xiao Mingzhen et al
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aim: Investigation of the expression of GDNF mRNA of caudat subnucleus in different stages of rat inflammation dental pulp. Methods: Model of rat inflammation dental pulp was established and total RNA was extracted from caudat subnucleus in different stages of rat inflammation tooth. The desired DNA product was obtained from total RNA by RT-PCR. cDNA was amplified and showed on 2% agarose. Results: A 337 bp band was showed on 2% agarose. The extension of light was strong in middle stages of rat inflammation dental pulp,while it was weak in earlier stage and later stage. Conclusion: The results suggest that GDNF may take part in regulating nerve-sprouting reactions during dental restorative process.
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key words GDNF；RT-PCR；caudate subnucleus；dental pulp;inflammation
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(2):102]
胶质源性神经营养因子 (glial cell line-derived neurotrophic factor ，GDNF)是新近发现的神经营养因子家族成员之一，其较NGF具有更强的促神经再生能力[1,2]。GDNF除存在于神经系统外，还存在于感觉神经丰富的器官如：牙齿、眼、鼻。牙髓神经快速生长期GDNF在牙胚组织表达较强，可诱导三叉神经向髓腔伸长，并对牙髓神经的发育起重要促进作用[3]。有关在炎症状态时GDNF表达是否改变及其与牙髓神经再生修复的关系目前尚未见研究报道。本实验利用RT-PCR技术研究正常鼠和牙髓炎症鼠的不同时期GDNF在牙髓神经中枢尾侧亚核表达量变化，探讨GDNF是否参与炎症修复期牙髓神经再生，及其在牙髓炎症反应中的作用。
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1 材料和方法
1.1 材料
高速低温离心机(Sigma 2MK)；eppendorf PCR仪(Germany)；烤箱(101-2型，上海实验仪器厂)；水平电泳仪(上海实验仪器厂)；紫外灯显像及照像系统(MODEL 2F-3，上海实验仪器厂)。
Trizol总RNA提取试剂盒(Gibco USA)；一步法RT-PCR试剂盒(Gibco USA)；PCR Marker(华美生物工程公司)；DEPC水，(Gibco USA)。
1.2 方法
1.2.1 鼠牙炎症模型建立和分组
运用5g/L的α-内毒素(Sigma公司，USA)作用在鼠牙右侧的穿髓点15min，然后用玻璃离子水门汀封闭制做炎症牙髓模型[14]。按封药后观察时间的长短分3d组、6d组、9d组、12d组，以及正常鼠牙组共5组。 此模型特点为牙髓存活时间长，牙髓组织有足够时间参与免疫应答及免疫防御过程，机体有足够时间展示修复再生功能[4]。
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1.2.2 尾侧亚核总RNA的抽提
不同时间点处死动物，心脏灌注后开颅取双侧尾侧亚核。将各组的尾侧亚核放入2ml的匀浆器，加入1ml Trizol变性液中充分匀浆，异丙醇沉淀，氯仿抽提，750ml/L乙醇洗去盐份，所得的沉淀物用30μl DEPC处理过水溶解，取其中5μl释液100倍后测A260、 A280 、 A230 ，A260/A280>1.7, A260/A230>1.5，若低于1.7、1.5的标准线，表示有蛋白质污染和盐分残存。
1.2.3 引物设计(第四军医大学神经生物研究所，宋俊峰博士惠赠)
由军科院八所合成，其序列5'端引物5'-TCA CCA AAA CAA ATG GCA GTG-3',3'端引物5'-GGA CGA CTC AGA TAC CAC ACC TTT TAG-3'5'端引物3'端引物浓度为25pmol.
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1.2.4 一步法RT-PCR
在50μl反应体积中含引物P1引物P2各1μl，MgSO43μl,2×反应缓冲液25μl(内包括四种NTP各0.4mMol)，加模板1ng 根据A260=1 的 RNA 溶液每豪升约含40μgRNA，计算出各组模板量1ng所需的体积数，加DEPC处理过水至49μl，后94℃，5min，放冰浴骤冷从而可减少DNA的二级结构形成，然后加RT/Tag混合酶1μl， 后加石蜡油20μl覆盖，以避免反复升温所致的水分的散失。各样品在55℃孵育，30min，反转录cDNA链后,进入PCR程序(94℃，3min，杀灭不耐高温的反转录RT酶的活性后，按94℃，40s，55℃，1min，72℃，1min顺序循环30次，72℃延伸5min，温度降至4℃)。待PCR完成， 样品移至-20℃冰箱保存。
样品制备完成后取样10μl,20g/L琼脂糖凝胶电泳检测正常组，炎症3d组，炎症6d组，炎症9d组，炎症12d组PCR产物量
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1.2.5 20g/L琼脂糖电泳观察
琼脂糖0.6g加1×TAE电泳缓冲液至30ml在三角锥瓶加热至琼脂糖全部溶解，冷却到60℃，加入0.5g/L溴化乙锭，充分混匀，灌入水平电泳槽，1×TAE电泳缓冲液浸没，取10μL PCR扩增产物，加1μ l 上样缓冲液， 与 PCR Marker一道电泳，电泳电压5V/cm，待指示剂移至适当的距离，紫外灯下观察结果，照像。
2 结果 (图1)
图1 GDNF在大鼠牙髓炎尾侧亚核的表达变化
凝胶电泳带位于PCR Marker的377bp片段，与预期结果一致。
正常组，尾侧亚核有一基础表达量，PCR产物电泳带亮度相对比较弱
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炎症3d组，GDNF PCR电泳带亮度较正常组低。
6d组，GDNFPCR电泳带亮度比3d组明显增加。
9d组，GDNF表达量为最多，表现在凝胶电泳上PCR电泳带亮度最强。
12d组，GDNF较9d组PCR电泳带亮度。但较正常组PCR的亮度强。
穿髓侧(右侧)与非穿髓侧的尾侧亚核的GDNF表达无明显差异。
3 讨论
胶质源性神经营养因子(Glial Cell line-derived neurotropic factor，GDNF)是在胶质细胞瘤中发现并克隆成功的。最初发现其有促脊髓运动神经元和中脑多巴胺神经元神经营养活性。随后研究表明GDNF对感觉神经元有广谱且强大的促神经营养活性。GDNF不仅存在于中枢神经系统，而且也存在于外周神经系统靶器官如正在发育的感觉器官牙齿、内耳、眼、舌乳头等。
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GDNF的mRNA表达量在牙齿发育不同时期含量有明显差异，有明显的阶段性的表达特点。采用原位杂交技术研究表明GDNF在牙胚神经发育高峰期即出生前一周和出生后一周(E15-P7)高表达[5]。而出生二周后GDNF表达明显减弱，可见GDNF在神经快速生长期表达量一过性增高，并对神经生长，发育、分化有重要促生长作用。
牙髓神经对外界刺激反应根据牙髓损伤程度和炎症的不同时期划分为即时反应，早期修复反应和晚期反应三阶段。即时反应多发生于损伤后几分钟内，在靠近受损部位的牙髓神经纤维出现变性坏死。 随后残存的纤维异常敏感，并释放神经肽到周围组织中，神经末稍对神经肽及神经营养因子积极应答，CGRP阳性神经纤维向受损处成牙本质细胞和牙髓组织方向延伸。即有大量SP、CGRP阳性纤维的增生发芽。随后几周，肉芽组织逐渐替代炎性组织，神经发芽再生逐渐减弱消失。而调节神经轴突、发芽再生的重要因素可能是受损处牙髓纤维细胞分泌[7，8]大量的NGF。
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牙髓神经纤维的胞体在三叉神经节，后投射到尾侧亚核，换元后上行投射至丘脑，在丘脑再次换元，最终投射到大脑皮层[6]。本实验利用RT-PCR 技术检测到牙齿的上极神经元尾侧亚核区域内GDNF表达变化，结果示GDNF在炎症3d时表达减弱，这与机体对外界刺激的应激反应，和大量牙髓神经坏死有关。也可能是α-内毒素本身对GDNF有短暂抑制作用。
炎症6d组表达量开始增多，九天组达到高峰， 12d组维持在一定水平，此种表达曲线变化反应了牙髓炎症动态变化的特点，并说明了炎症修复期除有NGF外，还有GDNF等神经营养因子同时参与神经再生发芽过程，并对牙髓神经修复再生起重要的促生长作用。正常鼠GDNF有一较弱水平基础表达量。这一基础表达量，可能在维持牙髓神经生理性凋亡与再生的动态平衡中起调节作用。
穿髓侧(右侧)与非穿髓侧的尾侧亚核的GDNF表达无明显差异，提示一侧牙神经损伤可引起双侧尾侧亚核的神经营养因子表达增多，而正常牙齿可能因有较完善神经末稍增生抑制系统，不会导致炎症牙髓神经末稍的增生发芽的现象出现。
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参考文献
1 Nosrat CA, Tomac A, Hoffer BJ. Cellular and developmental patterns of expression of Ret and glial cell line-derived neurotrophic factor receptor alpha mRNAs. Exp Brain Res, 1997，115:410
2 宋俊峰. GDNF在大鼠神经系统发育分化中的基因表达分布与变化及人GDNF基因克隆与表达：学位论文. 西安：第四军医大学，1997.6
3 Luukko K,Suvanto P,Saarma M. Expression of GDNF and it receptor in developing tooth is developmentally regulated and suggests multiple roles in innervation and organogenesis.Dev Dyn,1997，210:463
, http://www.100md.com
4 侯本祥，史俊南，丰泽浯等. 内毒素脂多糖刺激大鼠牙髓的组织病理学反应. 牙体牙髓牙周病学杂志， 1997，7(1)：12
5 Buj Bello A,Buchnan-VL. GDNF in an age-specific survival factor for sensory and autonomic neurons. Neuron. 1995，15:821
6 Aghabei B.The pathophysiology of Pain. British Dental Journey,1992，173:9
7 Byer MR, Swift ML,Wheeler EF.Reactions of sensory nerves to dental restorative procedures. Pro Finn Dent Soc. 1992，88suppl:73
8 Nosrat CA,Fried K,Ebendal T. NGF, BDNF,NT3,NT4 and GDNF in tooth development.Eur J Oral Sci，1998，106:94
收稿日期：1998-12-08
修回日期：1999-03-20, 百拇医药(陆 群1 郭敬俊1 肖明振1 吴补领1 宋俊峰2)