体外培养的晶状体上皮细胞株的确定及生长、分化规律
作者：吴 强 陆道炎 王丽天 陈才根
单位：200092 上海第二医科大学附属新华医院眼科
关键词：晶状体上皮细胞；细胞培养；细胞分化
眼科新进展990402 摘要 目的 建立牛、兔、人晶状体上皮细胞的体外培养，进一步认识晶状体上皮细胞生长、分化规律。方法 应用组织块培养方法进行3种晶状体上皮细胞的体外培养，经Gimsa染色，在倒置显微镜下对培养的晶状体上皮细胞的生长、分化规律进行观察。结果 培养至6wk的人胎儿晶状体上皮细胞中有特征性的“晶状体小体”形成；牛、兔晶状体上皮细胞去分化是发生在第3代，而人晶状体上皮细胞在第4代开始出现去分化；它们传代至第8代时生长都趋于停止，出现老化表现；来自人的晶状体上皮细胞生长增殖率与年龄呈负相关关系(r=-0.996)。结论 “晶状体小体”的形成可作为确定晶状体上皮细胞株的一项特征性依据，而体外培养的人、牛、兔晶状体上皮细胞具有相同的有限生长潜能，在相同的条件下，牛、兔晶状体上皮细胞的生长增殖速度比人晶状体上皮细胞快，但易于发生去分化；此外，人晶状体上皮细胞的生长增殖率与年龄密切相关，年龄越小，晶状体上皮细胞的生长增殖速度越快。
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Study on identification and differentiation of lens epithelial cells lines in vitro
WU Qiang LU Dao-Yan WANG Li-Tian CHEN Cai-Gen
Key words lens epithelial cell;cell culture;cell differentiation
Abstract Objective To establish bovine,rabbit and human lens epithelial cells(LEC)culture and further understand the differentiation of LEC.Methods LEC from bovine,rabbit and human were cultured using tissue explant technique in vitro;The differentiation of LEC cultured from the three species was observed by Gimsa staining and a inverted microscope.Results LEC from fetus maintained in culture longer than 6 weeks spontaneously formed lens-like spherules.Under identical conditions,a average doubling time of LEC from bovine,rabbit and fetus during the logarithmic phase was 24h,24.5h and 26h respectively;Dedifferentiation of cultured LEC from bovine and rabbit began after the third passage;and dedifferentiation of LEC from human occurred after the fourth passage;Cultued LEC from the three species exhibited apperant senescence at the eighth passage.The proliferative capacity of LEC from human had directly relevance to the age of donor(r=-0.996).Conclusions The formation of lens-like spherules is characteristics of LEC lines in the cultured cells.Under identical conditions,the proliferative rate of LEC from bovine and rabbit is fast than that of LEC from human,but dedifferentiation of LEC from bovine and rabbit is easier than that of LEC from human;LEC from the three species exhibit similar limited growth potential.The proliferative rate of LEC from human has a inversely proportion with age.
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眼晶状体组织中，晶状体上皮细胞是一群代谢活跃，具有生长、分化和创伤刺激后发生愈合反应能力的细胞结构。晶状体上皮细胞的体外培养是观察晶状体上皮细胞生长的形态、功能变化的基础，也是为进一步从分子水平研究晶状体上皮细胞的生物学特性提供实验对象的重要实验方法。本研究在建立牛、兔、人晶状体上皮细胞体外培养的基础上，观察3种不同种属来源的晶状体上皮细胞在体外的生长、分化规律，同时也为相关实验研究所采用的实验对象的科学性、合理性提供可靠的理论依据。
1 材料和方法
1.1 试剂和仪器 主要试剂：美国GIBco BRL公司生产的DMEM培养液、胎牛血清。美国DIFco公司生产的胰蛋白酶。Gimsa染液：实验室内自行配制。主要仪器：日本产Olympus倒置显微镜、Olympus-PM6照相机、CO2培养箱。
1.2 LEC的体外培养
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1.2.1 标本来源 新生小牛眼和1mo的新西兰白兔分别由牧场和本院动物房提供；胎儿晶状体取自水囊引产死亡时间不超过6～8h的胎儿；而成人晶状体则取自角膜移植术后的供眼，供眼均来自男性，年龄分别为18a、42a、56a。
1.2.2 原代培养 用750mL.L-1的酒精和无菌生理盐水分别对所取眼标本消毒及冲洗3次，在无菌操作条件下，剪去角膜和虹膜；用截囊针将前囊膜取下，剪成1mm×1mm大小的碎片，加入1mL胎牛血清，用吸管将其混悬液移至培养瓶中，让细小的囊膜组织片弥散铺于瓶底，静置于37℃的CO2培养箱内孵育，12～24h时，当囊膜片及散落的晶状体上皮细胞贴壁后，加入含有100mL*L-1牛血清的DMEM培养液，随后视细胞的生长速度可3～4d换液1次。当细胞长满瓶底时可进行传代培养，其中用一瓶已长满胎儿晶状体上皮细胞培养瓶进行长期培养观察。
1.2.3 传代培养 当原代培养细胞长满瓶底时，用D-Hanks液洗涤1次，加入自配的2.5g.L-1胰蛋白酶2mL。室温下晃动培养瓶3～5min，倒去大部分培养液，当见细胞呈碎屑样从瓶底脱离，倒置显微镜下见大部分细胞收缩、分离、脱壁后，加入含100mL.L-1小牛血清的DMEM培养液，用吸管吹打后，按1∶2的比例进行传代培养。
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1.3 细胞生长的检测 将3种不同种属4种来源培养的第2代晶状体上皮细胞，按30×103细胞/孔的数量接种到24孔的培养板上，每组10孔，分别于接种后24、48、96、120h取2孔生长的细胞计数，每孔细胞计数3次，取均值，绘制生长曲线，求出倍增时间。
1.4 细胞形态和结构的观察 用倒置显微镜在×100、×200、×400的倍率下动态观察原代和传代培养的LEC生长、形态、以及胞内结构的变化。Gimsa染色法[5]用于观察培养的各种细胞的形态、晶状体小体结构、细胞内的结构。
2 结果
2.1 原代和传代培养 将4种不同来源3种不同种属的晶状体囊膜片置入培养瓶中培养，观察发现新生小牛、兔和胎儿的囊膜片在24～48h就有上皮细胞自囊膜片生长移出，而成人囊膜片在40～72h才可见有细胞自囊膜片生长移出，外观呈芽胞状(见图1)，近囊膜片处细胞生长密集，呈多角形。远离囊膜片处细胞生长稀疏，胞体延伸，培养的小牛、兔晶状体上皮细胞约需6～10d细胞发生融合长满瓶底，胎儿约需9～12d，成人约需11～14d；经消化后按1∶2传代的小牛、兔晶状体上皮细胞生长迅速，约3～4d细胞可达融合，融合后的细胞呈多角形、椭圆形，大小基本一致；胎儿晶状体上皮细胞生长稍有所缓慢，约6～8d细胞发生融合，经Gimsa染色见细胞呈上皮细胞样外观，胞体边界清，胞浆呈均匀的粉红色，以及呈紫红色的单或双核(图2)；而不同年龄的人晶状体上皮细胞生长更加缓慢，但形态一致，约需7～14d细胞才达到融合；传代至第3代，小牛、兔晶状体上皮细胞虽生长迅速，但部分细胞形态已呈现出梭形的成纤维细胞的外观(图3)，至第5代大部分细胞形态都发生了如此改变，胞内可见网状结构，第6～7代时，细胞生长缓慢，胞内网状结构增多，出现空泡样改变(图4)。第8代时，生长特别缓慢，胞内网状结构及空泡样改变明显增多；而胎儿和不同年龄人晶状体上皮细胞传代至第4代才可见细胞梭形样改变，在第6～7代时胞内也可见有网状结构及空泡样改变，第8代时，细胞也发生衰老。
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Figure 1 The growth status of cultured primary human lens epithelial cells displayed at 40～72h，×200LM 原代培养的人晶状体上皮细胞(40～72h)生长情况，×200LM
Figure 2 The configuration of cultured primary fetus lens epithelial cells displayed，×200LM 原代培养的胎儿晶状体上皮细胞形态，×200LM
Figure 3 The growth status of bovine lens epithelial cells displayed at the third passage，×200LM 第3代牛晶状体上皮细胞生长情况，×200LM
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Figure 4 The growth status of bovine lens epithelial cells displayed at the seventh passage，×400LM 第7代牛晶状体上皮细胞生长情况，×400LM
2.2 胎儿LEC原代长期培养观察 原代胎儿晶状体上皮细胞约经10d培养后细胞发生融合，不给予消化传代，每隔2～3d换液1次继续培养，细胞生长逐渐密集，呈现复层样生长，培养至6wk时可见有细胞呈同心圆环绕的小球状体结构的形成，小球体内无细胞成分，Gimsa染色呈粉红色外观(图5)。
Figure 5 The growth status of cultured primary fetus lens epithelial cells for long than 6 weeks displayed,×200LM 原代胎儿晶状体上皮细胞培养至6wk的观察,×200LM
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2.3 细胞生长曲线的测绘 根据对小牛、兔、胎儿第2代不同培养时间的细胞计数，绘制出各自的生长曲线，并求出各自的细胞倍增时间，分别为24、24.5和26h；同时也绘制了第2代3种不同年龄人晶状体上皮细胞的生长曲线，求出各自的细胞倍增时间，分别为29、32和33.5h。而人晶状体上皮细胞供体的年龄与细胞倍增时间二者之间呈负相关，其相关系数为r=-0.996。
3 讨论
细胞培养是细胞生物学研究中最常用的方法之一。由于在体外培养中或在机体内，细胞的生物学行为基本规律是一致的，因此可以在体外对培养的细胞结构和功能进行诸多研究，特别是可以有目的、有选择地控制细胞的生长环境，研究在某种特殊条件下的细胞生物学行为。早在1958年Mamo首先用鸡胚晶状体上皮细胞进行了体外培养，研究其生长特点；随后Mager、Redden等又介绍了牛、兔、人晶状体上皮细胞的培养方法和特点[1，2]。
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正常生理状态下，晶状体上皮细胞是被包裹在一封闭受限的基底膜囊内，选用晶状体囊膜组织片进行晶状体上皮细胞培养，可望获得一单纯不受其它细胞相混杂的纯细胞株；但是根据晶状体上皮细胞体外培养所确定的生长特性是属于贴壁生长的有限生长的细胞系，每开展一项研究都需进行原代培养，作为对实验研究对象的可靠性、科学性的论证，细胞株的确定需有客观的依据。根据晶状体上皮细胞具有特异高丰度的晶状体蛋白的表达，国内秦红等[3]应用分子生物学技术，对培养的晶状体上皮细胞所转录出的α-、β-晶状体蛋白的mRNA进行检测，以确定晶状体上皮细胞株。该方法具有较高的特异性，但实验操作复杂，必需具备一定的实验条件。Arita等[4]在对人晶状体上皮细胞体外培养中观察发现：人晶状体上皮细胞经长期培养(40～50d)后，在培养的单层晶状体上皮细胞中有“透镜小体”的形成；该“透镜小体”是属于哺乳类晶状体纤维分化所呈现的特有表现，是晶状体上皮细胞表达的γ-晶状体蛋白和MP26蛋白产物。随后的观察还发现：在长期培养的晶状体上皮细胞中，除有“透镜小体”的存在外，还有由细胞环绕的“晶状体小体”的存在，其成分是属于构成基底膜的物质，它也是体外培养的晶状体上皮细胞所表现的另一特征[5]。本实验中，胎儿晶状体上皮细胞原代经6wk的长期培养，在培养的晶状体上皮细胞中发现有“晶状体小体”的形成；并且该“晶状体小体”经Gimsa染色后是一无细胞成分，呈粉红色外观的结构。因此可根据形成的“晶状体小体”特征性表现作为确定晶状体上皮细胞株的可靠性依据。
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对不同种属来源的晶状体上皮细胞生长潜能的了解，是进行深入研究晶状体上皮细胞生物学行为的先决条件。在本研究中，同时期对牛、兔、胎儿和不同年龄人的晶状体上皮细胞进行了体外培养，观察各自在体外的生长、分化规律。在同样的培养条件下，当囊膜组织贴壁后，来自牛、兔晶状体上皮细胞的生长增殖速度明显比来自人的晶状体上皮细胞快，该增殖速度可保持到第4代，但它们的细胞形态在传代至第3代后就开始发生改变，出现向成纤维细胞的转化；而人晶状体上皮细胞传代至第4代时细胞的表型也开始发生改变。牛、兔和人晶状体上皮细胞传代至第6～7代后，生长增殖速度均减慢，细胞体增大，至第8代时，细胞体内网状结构及空泡样改变增多，晶状体上皮细胞老化，生长基本停滞，说明体外培养的牛、兔、人晶状体上皮细胞具有相类似的有限生长特性，但牛、兔晶状体上皮细胞的生长增殖速度比人晶状体上皮细胞的快；同时，牛、兔晶状体上皮细胞也比人晶状体上皮细胞易于发生去分化向成纤维细胞转化，为确保实验结果的可靠性、准确性，尽量不宜用已发生转化的晶状体上皮细胞作为研究的实验对象。
此外，晶状体上皮细胞所具有的多种生理活性是通过它生长繁殖后才表现出来，研究晶状体上皮细胞生长增殖能力有助于更多的了解晶状体上皮细胞所固有的各种特性。Redden等[6]对体外培养的兔晶状体上皮细胞观察发现：晶状体上皮细胞的增殖能力与动物的年龄呈负相关。来自临床回顾性的调查发现：白内障术后后囊膜混浊的发生也与年龄密切相关，年龄越小，发生率越高。本实验通过对体外培养不同年龄的人晶状体上皮细胞生长情况的观测结果发现：体外培养的人晶状体上皮细胞的生长增殖能力同样与供体的年龄呈负相关关系，年龄越大，晶状体上皮细胞的生长增殖能力越低；这与临床上所观察到的结果相一致。
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本文通过对同等条件下培养的来自3种不同种属的晶状体上皮细胞进行研究，观察它们各自在体外生长、分化规律，这有助于我们对晶状体上皮细胞各种生物学行为的进一步认识；随着对晶状体上皮细胞结构和功能研究的深入，将更增进人们对晶状体上皮细胞在白内障囊外摘出术后后囊膜混浊形成过程中作用的了解，同时对寻找有效措施防治该并发症的发生具有重要的意义。
注释：吴 强，现在上海市第六人民医院眼科
基金项目：国家自然科学基金资助(NO.39270707)
作者简介 吴 强，男，1964年7月出生，江苏人，汉族，1985年毕业于昆明医学院医疗系，获医学学士学位；1991年在曾令柏教授的指导下进行了青光眼视野损害的临床基础研究，1994年获医学硕士学位，同年又进入上海第二医科大学眼科专业继续深造，师从陆道炎、王丽天、陈才根、王康孙等国内著名的眼科专家，致力于白内障囊外摘出术后后囊膜混浊发生的病理机制及防治的研究，于1997年获医学博士学位。现已发表学术论文9篇；曾先后获得西南地区大学生科技成果二等奖1项，省科技进步成果三等奖2项，省卫生厅科技进步成果三等奖1项，第二届全国中青年眼科学术研讨会优秀论文一等奖，全国“科林”杯眼科学学术论文特等奖，同时也获得了全额资助参加第17届亚太地区眼科学术会议。
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参考文献
1 Bermbach G.Human lens epithelial cell in tissue culture.Exp Eye Res 1991;52∶113-121.
2 Reddan JR,McGee SJ,Goldenberg EM.Both human and newborn rabbit lens epithelial cells exhibit similar limited growth properties in tissue culture.Cur Eye Res 1983；2(6)∶399-404.
3 秦 红，赵光喜，吴惠群.Wistar大鼠、乳鼠晶状体上皮细胞的原代培养与鉴定.眼科新进展 1995；15(3)∶2-3.
4 Arita T,Murata Y,Lin LR,et al.Synthesis of lens capsule in long-term culture of human lens epithelial cells.Invest Ophthalmol Vis Sci 1993;34(2)∶355-362.
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5 Olivero DK,Furcht LT.Type IV collagen,laminin,and fibronectin promote the adhesion and migration of rabbit lens epithelial cells in vitro.Invest Ophthalmol Vis Sci 1993;34(10)∶2825-2834.
6 Redden JR,Dziedzic DC,Mostafapour MK,et al.Establishment and characterization of a lens epithelial cell line from and eight year old rabbit.Cur Eye Res 1983;2(9)∶633-639.
收稿日期：1998-08-10；修回日期：1999-02-23, 百拇医药
单位：200092 上海第二医科大学附属新华医院眼科
关键词：晶状体上皮细胞；细胞培养；细胞分化
眼科新进展990402 摘要 目的 建立牛、兔、人晶状体上皮细胞的体外培养，进一步认识晶状体上皮细胞生长、分化规律。方法 应用组织块培养方法进行3种晶状体上皮细胞的体外培养，经Gimsa染色，在倒置显微镜下对培养的晶状体上皮细胞的生长、分化规律进行观察。结果 培养至6wk的人胎儿晶状体上皮细胞中有特征性的“晶状体小体”形成；牛、兔晶状体上皮细胞去分化是发生在第3代，而人晶状体上皮细胞在第4代开始出现去分化；它们传代至第8代时生长都趋于停止，出现老化表现；来自人的晶状体上皮细胞生长增殖率与年龄呈负相关关系(r=-0.996)。结论 “晶状体小体”的形成可作为确定晶状体上皮细胞株的一项特征性依据，而体外培养的人、牛、兔晶状体上皮细胞具有相同的有限生长潜能，在相同的条件下，牛、兔晶状体上皮细胞的生长增殖速度比人晶状体上皮细胞快，但易于发生去分化；此外，人晶状体上皮细胞的生长增殖率与年龄密切相关，年龄越小，晶状体上皮细胞的生长增殖速度越快。
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Study on identification and differentiation of lens epithelial cells lines in vitro
WU Qiang LU Dao-Yan WANG Li-Tian CHEN Cai-Gen
Key words lens epithelial cell;cell culture;cell differentiation
Abstract Objective To establish bovine,rabbit and human lens epithelial cells(LEC)culture and further understand the differentiation of LEC.Methods LEC from bovine,rabbit and human were cultured using tissue explant technique in vitro;The differentiation of LEC cultured from the three species was observed by Gimsa staining and a inverted microscope.Results LEC from fetus maintained in culture longer than 6 weeks spontaneously formed lens-like spherules.Under identical conditions,a average doubling time of LEC from bovine,rabbit and fetus during the logarithmic phase was 24h,24.5h and 26h respectively;Dedifferentiation of cultured LEC from bovine and rabbit began after the third passage;and dedifferentiation of LEC from human occurred after the fourth passage;Cultued LEC from the three species exhibited apperant senescence at the eighth passage.The proliferative capacity of LEC from human had directly relevance to the age of donor(r=-0.996).Conclusions The formation of lens-like spherules is characteristics of LEC lines in the cultured cells.Under identical conditions,the proliferative rate of LEC from bovine and rabbit is fast than that of LEC from human,but dedifferentiation of LEC from bovine and rabbit is easier than that of LEC from human;LEC from the three species exhibit similar limited growth potential.The proliferative rate of LEC from human has a inversely proportion with age.
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眼晶状体组织中，晶状体上皮细胞是一群代谢活跃，具有生长、分化和创伤刺激后发生愈合反应能力的细胞结构。晶状体上皮细胞的体外培养是观察晶状体上皮细胞生长的形态、功能变化的基础，也是为进一步从分子水平研究晶状体上皮细胞的生物学特性提供实验对象的重要实验方法。本研究在建立牛、兔、人晶状体上皮细胞体外培养的基础上，观察3种不同种属来源的晶状体上皮细胞在体外的生长、分化规律，同时也为相关实验研究所采用的实验对象的科学性、合理性提供可靠的理论依据。
1 材料和方法
1.1 试剂和仪器 主要试剂：美国GIBco BRL公司生产的DMEM培养液、胎牛血清。美国DIFco公司生产的胰蛋白酶。Gimsa染液：实验室内自行配制。主要仪器：日本产Olympus倒置显微镜、Olympus-PM6照相机、CO2培养箱。
1.2 LEC的体外培养
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1.2.1 标本来源 新生小牛眼和1mo的新西兰白兔分别由牧场和本院动物房提供；胎儿晶状体取自水囊引产死亡时间不超过6～8h的胎儿；而成人晶状体则取自角膜移植术后的供眼，供眼均来自男性，年龄分别为18a、42a、56a。
1.2.2 原代培养 用750mL.L-1的酒精和无菌生理盐水分别对所取眼标本消毒及冲洗3次，在无菌操作条件下，剪去角膜和虹膜；用截囊针将前囊膜取下，剪成1mm×1mm大小的碎片，加入1mL胎牛血清，用吸管将其混悬液移至培养瓶中，让细小的囊膜组织片弥散铺于瓶底，静置于37℃的CO2培养箱内孵育，12～24h时，当囊膜片及散落的晶状体上皮细胞贴壁后，加入含有100mL*L-1牛血清的DMEM培养液，随后视细胞的生长速度可3～4d换液1次。当细胞长满瓶底时可进行传代培养，其中用一瓶已长满胎儿晶状体上皮细胞培养瓶进行长期培养观察。
1.2.3 传代培养 当原代培养细胞长满瓶底时，用D-Hanks液洗涤1次，加入自配的2.5g.L-1胰蛋白酶2mL。室温下晃动培养瓶3～5min，倒去大部分培养液，当见细胞呈碎屑样从瓶底脱离，倒置显微镜下见大部分细胞收缩、分离、脱壁后，加入含100mL.L-1小牛血清的DMEM培养液，用吸管吹打后，按1∶2的比例进行传代培养。
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1.3 细胞生长的检测 将3种不同种属4种来源培养的第2代晶状体上皮细胞，按30×103细胞/孔的数量接种到24孔的培养板上，每组10孔，分别于接种后24、48、96、120h取2孔生长的细胞计数，每孔细胞计数3次，取均值，绘制生长曲线，求出倍增时间。
1.4 细胞形态和结构的观察 用倒置显微镜在×100、×200、×400的倍率下动态观察原代和传代培养的LEC生长、形态、以及胞内结构的变化。Gimsa染色法[5]用于观察培养的各种细胞的形态、晶状体小体结构、细胞内的结构。
2 结果
2.1 原代和传代培养 将4种不同来源3种不同种属的晶状体囊膜片置入培养瓶中培养，观察发现新生小牛、兔和胎儿的囊膜片在24～48h就有上皮细胞自囊膜片生长移出，而成人囊膜片在40～72h才可见有细胞自囊膜片生长移出，外观呈芽胞状(见图1)，近囊膜片处细胞生长密集，呈多角形。远离囊膜片处细胞生长稀疏，胞体延伸，培养的小牛、兔晶状体上皮细胞约需6～10d细胞发生融合长满瓶底，胎儿约需9～12d，成人约需11～14d；经消化后按1∶2传代的小牛、兔晶状体上皮细胞生长迅速，约3～4d细胞可达融合，融合后的细胞呈多角形、椭圆形，大小基本一致；胎儿晶状体上皮细胞生长稍有所缓慢，约6～8d细胞发生融合，经Gimsa染色见细胞呈上皮细胞样外观，胞体边界清，胞浆呈均匀的粉红色，以及呈紫红色的单或双核(图2)；而不同年龄的人晶状体上皮细胞生长更加缓慢，但形态一致，约需7～14d细胞才达到融合；传代至第3代，小牛、兔晶状体上皮细胞虽生长迅速，但部分细胞形态已呈现出梭形的成纤维细胞的外观(图3)，至第5代大部分细胞形态都发生了如此改变，胞内可见网状结构，第6～7代时，细胞生长缓慢，胞内网状结构增多，出现空泡样改变(图4)。第8代时，生长特别缓慢，胞内网状结构及空泡样改变明显增多；而胎儿和不同年龄人晶状体上皮细胞传代至第4代才可见细胞梭形样改变，在第6～7代时胞内也可见有网状结构及空泡样改变，第8代时，细胞也发生衰老。
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Figure 1 The growth status of cultured primary human lens epithelial cells displayed at 40～72h，×200LM 原代培养的人晶状体上皮细胞(40～72h)生长情况，×200LM
Figure 2 The configuration of cultured primary fetus lens epithelial cells displayed，×200LM 原代培养的胎儿晶状体上皮细胞形态，×200LM
Figure 3 The growth status of bovine lens epithelial cells displayed at the third passage，×200LM 第3代牛晶状体上皮细胞生长情况，×200LM
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Figure 4 The growth status of bovine lens epithelial cells displayed at the seventh passage，×400LM 第7代牛晶状体上皮细胞生长情况，×400LM
2.2 胎儿LEC原代长期培养观察 原代胎儿晶状体上皮细胞约经10d培养后细胞发生融合，不给予消化传代，每隔2～3d换液1次继续培养，细胞生长逐渐密集，呈现复层样生长，培养至6wk时可见有细胞呈同心圆环绕的小球状体结构的形成，小球体内无细胞成分，Gimsa染色呈粉红色外观(图5)。
Figure 5 The growth status of cultured primary fetus lens epithelial cells for long than 6 weeks displayed,×200LM 原代胎儿晶状体上皮细胞培养至6wk的观察,×200LM
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2.3 细胞生长曲线的测绘 根据对小牛、兔、胎儿第2代不同培养时间的细胞计数，绘制出各自的生长曲线，并求出各自的细胞倍增时间，分别为24、24.5和26h；同时也绘制了第2代3种不同年龄人晶状体上皮细胞的生长曲线，求出各自的细胞倍增时间，分别为29、32和33.5h。而人晶状体上皮细胞供体的年龄与细胞倍增时间二者之间呈负相关，其相关系数为r=-0.996。
3 讨论
细胞培养是细胞生物学研究中最常用的方法之一。由于在体外培养中或在机体内，细胞的生物学行为基本规律是一致的，因此可以在体外对培养的细胞结构和功能进行诸多研究，特别是可以有目的、有选择地控制细胞的生长环境，研究在某种特殊条件下的细胞生物学行为。早在1958年Mamo首先用鸡胚晶状体上皮细胞进行了体外培养，研究其生长特点；随后Mager、Redden等又介绍了牛、兔、人晶状体上皮细胞的培养方法和特点[1，2]。
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正常生理状态下，晶状体上皮细胞是被包裹在一封闭受限的基底膜囊内，选用晶状体囊膜组织片进行晶状体上皮细胞培养，可望获得一单纯不受其它细胞相混杂的纯细胞株；但是根据晶状体上皮细胞体外培养所确定的生长特性是属于贴壁生长的有限生长的细胞系，每开展一项研究都需进行原代培养，作为对实验研究对象的可靠性、科学性的论证，细胞株的确定需有客观的依据。根据晶状体上皮细胞具有特异高丰度的晶状体蛋白的表达，国内秦红等[3]应用分子生物学技术，对培养的晶状体上皮细胞所转录出的α-、β-晶状体蛋白的mRNA进行检测，以确定晶状体上皮细胞株。该方法具有较高的特异性，但实验操作复杂，必需具备一定的实验条件。Arita等[4]在对人晶状体上皮细胞体外培养中观察发现：人晶状体上皮细胞经长期培养(40～50d)后，在培养的单层晶状体上皮细胞中有“透镜小体”的形成；该“透镜小体”是属于哺乳类晶状体纤维分化所呈现的特有表现，是晶状体上皮细胞表达的γ-晶状体蛋白和MP26蛋白产物。随后的观察还发现：在长期培养的晶状体上皮细胞中，除有“透镜小体”的存在外，还有由细胞环绕的“晶状体小体”的存在，其成分是属于构成基底膜的物质，它也是体外培养的晶状体上皮细胞所表现的另一特征[5]。本实验中，胎儿晶状体上皮细胞原代经6wk的长期培养，在培养的晶状体上皮细胞中发现有“晶状体小体”的形成；并且该“晶状体小体”经Gimsa染色后是一无细胞成分，呈粉红色外观的结构。因此可根据形成的“晶状体小体”特征性表现作为确定晶状体上皮细胞株的可靠性依据。
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对不同种属来源的晶状体上皮细胞生长潜能的了解，是进行深入研究晶状体上皮细胞生物学行为的先决条件。在本研究中，同时期对牛、兔、胎儿和不同年龄人的晶状体上皮细胞进行了体外培养，观察各自在体外的生长、分化规律。在同样的培养条件下，当囊膜组织贴壁后，来自牛、兔晶状体上皮细胞的生长增殖速度明显比来自人的晶状体上皮细胞快，该增殖速度可保持到第4代，但它们的细胞形态在传代至第3代后就开始发生改变，出现向成纤维细胞的转化；而人晶状体上皮细胞传代至第4代时细胞的表型也开始发生改变。牛、兔和人晶状体上皮细胞传代至第6～7代后，生长增殖速度均减慢，细胞体增大，至第8代时，细胞体内网状结构及空泡样改变增多，晶状体上皮细胞老化，生长基本停滞，说明体外培养的牛、兔、人晶状体上皮细胞具有相类似的有限生长特性，但牛、兔晶状体上皮细胞的生长增殖速度比人晶状体上皮细胞的快；同时，牛、兔晶状体上皮细胞也比人晶状体上皮细胞易于发生去分化向成纤维细胞转化，为确保实验结果的可靠性、准确性，尽量不宜用已发生转化的晶状体上皮细胞作为研究的实验对象。
此外，晶状体上皮细胞所具有的多种生理活性是通过它生长繁殖后才表现出来，研究晶状体上皮细胞生长增殖能力有助于更多的了解晶状体上皮细胞所固有的各种特性。Redden等[6]对体外培养的兔晶状体上皮细胞观察发现：晶状体上皮细胞的增殖能力与动物的年龄呈负相关。来自临床回顾性的调查发现：白内障术后后囊膜混浊的发生也与年龄密切相关，年龄越小，发生率越高。本实验通过对体外培养不同年龄的人晶状体上皮细胞生长情况的观测结果发现：体外培养的人晶状体上皮细胞的生长增殖能力同样与供体的年龄呈负相关关系，年龄越大，晶状体上皮细胞的生长增殖能力越低；这与临床上所观察到的结果相一致。
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本文通过对同等条件下培养的来自3种不同种属的晶状体上皮细胞进行研究，观察它们各自在体外生长、分化规律，这有助于我们对晶状体上皮细胞各种生物学行为的进一步认识；随着对晶状体上皮细胞结构和功能研究的深入，将更增进人们对晶状体上皮细胞在白内障囊外摘出术后后囊膜混浊形成过程中作用的了解，同时对寻找有效措施防治该并发症的发生具有重要的意义。
注释：吴 强，现在上海市第六人民医院眼科
基金项目：国家自然科学基金资助(NO.39270707)
作者简介 吴 强，男，1964年7月出生，江苏人，汉族，1985年毕业于昆明医学院医疗系，获医学学士学位；1991年在曾令柏教授的指导下进行了青光眼视野损害的临床基础研究，1994年获医学硕士学位，同年又进入上海第二医科大学眼科专业继续深造，师从陆道炎、王丽天、陈才根、王康孙等国内著名的眼科专家，致力于白内障囊外摘出术后后囊膜混浊发生的病理机制及防治的研究，于1997年获医学博士学位。现已发表学术论文9篇；曾先后获得西南地区大学生科技成果二等奖1项，省科技进步成果三等奖2项，省卫生厅科技进步成果三等奖1项，第二届全国中青年眼科学术研讨会优秀论文一等奖，全国“科林”杯眼科学学术论文特等奖，同时也获得了全额资助参加第17届亚太地区眼科学术会议。
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参考文献
1 Bermbach G.Human lens epithelial cell in tissue culture.Exp Eye Res 1991;52∶113-121.
2 Reddan JR,McGee SJ,Goldenberg EM.Both human and newborn rabbit lens epithelial cells exhibit similar limited growth properties in tissue culture.Cur Eye Res 1983；2(6)∶399-404.
3 秦 红，赵光喜，吴惠群.Wistar大鼠、乳鼠晶状体上皮细胞的原代培养与鉴定.眼科新进展 1995；15(3)∶2-3.
4 Arita T,Murata Y,Lin LR,et al.Synthesis of lens capsule in long-term culture of human lens epithelial cells.Invest Ophthalmol Vis Sci 1993;34(2)∶355-362.
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5 Olivero DK,Furcht LT.Type IV collagen,laminin,and fibronectin promote the adhesion and migration of rabbit lens epithelial cells in vitro.Invest Ophthalmol Vis Sci 1993;34(10)∶2825-2834.
6 Redden JR,Dziedzic DC,Mostafapour MK,et al.Establishment and characterization of a lens epithelial cell line from and eight year old rabbit.Cur Eye Res 1983;2(9)∶633-639.
收稿日期：1998-08-10；修回日期：1999-02-23, 百拇医药