急性应激诱导即时反应基因c-fos和c-jun的表达II：不同应激方式诱导c-fos/c-jun表达的差异性
作者：陆 林 黄明生 Mednick SA 李 毅
单位：陆 林 黄明生(610041 华西医科大学附一院心理卫生研究所)；Mednick SA(美国南加利福尼亚大学)；李 毅(四川大学图形图象研究所)
关键词：应激；c-fos；c-jun；强迫游泳；束缚；大鼠
中国行为医学科学990301 【摘要】 目的 研究不同脑区内c-fos和 c-jun蛋白的表达与不同方式应激之间的关系。方法 采用特异性抗体的原位免疫细胞化学方法，对强迫游泳和束缚应激后大鼠脑皮层、海马、下丘脑及小脑内fos和 jun蛋白阳性神经元的分布进行观察，用图像分析技术对大鼠额皮层(FC)、海马齿状核(DG)、下丘脑室旁核(PVN)及小脑颗粒细胞层(GCL)内的fos和 jun阳性细胞的相对切面面积比和平均目标灰度进行分析。结果 两种方式应激结束后3h，脑皮层的额叶和颞叶、海马的CA1和DG及下丘脑的PVN、视上核、背内侧核均有较强的c-fos和 c-jun表达。图像分析结果发现，在 FC、DG及PVN区域，两种应激后c-fos和 c-jun阳性胞体相对切面面积比相似，均高于正常大鼠(P<0.05)，而平均目标灰度，则显著降低(P<0.05)，而在GCL，强迫游泳应激组的FOS阳性胞体面积比高于束缚应激组，亦有显著性差异。结论 不同的应激方式诱导相关脑区c-fos和 c-jun的表达基本一致，强迫游泳可能具有更多躯体方面的效应。
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The acute stress induces expression of immediate early gene c-fos and c-jun in rat brain Ⅱ: the relationship between the stress of different style and the expression of c-fos and c-jun
Lu Lin, Huang Mingsheng,Mednick SA，et al.
Institute of Mental Health, the First Hospital Affiliated to West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
【Abstract】 Objective To explore the relationship between the stress of different style and the expression of c-fos and c-jun in rat brain. Methods The immunohistochemistry was performed to observe the distribution of c-fos and c-jun neurons with neocortex, hippcampus, hypothalamus and cerebellum, and the computerized image technique was used to analyze the change in grey degree and relative sectional area of fos and jun positive neurons in the frontal cortex (FC), hippocampal dentate gyrus(DG), hypothalamic paraventricular nucleus(PVN) and cerebellum granule cell layer(GCL). Results A dense accumulation of fos and jun positive neurons exhibited in the FC, temporal cortex, CA1, DG, PVN, the supraoptic nucleus (SON) and the dorsomedial nucleus(DMN). With using computerized image analysis, the relative sectional area and grey degree of Fos and Jun positive neurons in FC, DG and PVN in the two style stress rats were longer and lower than those of normal group (P<0.05) respectively, and there were significant different in the relative sectional area and grey degree of GCL c-fos positive neurons between the forced swimming rats and immobilization stress rats (P<0.05). Conclusion The results of the present investigation suggest similarities in the pattern of IEG expression between swim and restraint stress, and the swimming stress may be reflective of the greater physical component.
, 百拇医药
【Key words】 Stress c-fos c-jun Forced swimming Restraint Rat
应激可以引起下丘脑一垂体一肾上腺轴(HPA)功能活跃，机体感受应激后，使下丘脑视上核小细胞部(pPVN)促肾上腺皮质激素释放因子(CRH)的合成和分泌增加，CRH再继发性诱导垂体释放促肾上腺皮质激素和肾上腺皮质释放糖皮质激素，后者参与机体的各种生理效应，如提供机体应付应激时的能量和代谢需要，但机体感受应激后，又怎样引起pPVN释放激素，其中间的神经通路目前尚不清楚。虽然近年来即时反应基因(IEG)中的c-fos和c-jun作为神经元的活动和示踪标志[1，3]，被广泛地应用于应激的神经通路研究之中，但不同的应激方式引起的神经元功能改变是否存在着差异，很少有文献报道。本文通过采用特异性抗体的原位免疫细胞化学方法检测c-fos和 c-jun蛋白，来探索不同应激方式诱导c-fos和 c-jun的表达规律及大脑感受应激的可能神经元通路。
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材料和方法
一、实验动物
采用成年雄性Wistar大鼠(由华西医科大学动物中心提供)24只，体重200～250mg, 随机分为对照组、强迫游泳和束缚应激组，每组8只，实验前均在安静的室温下适应性饲养1周，自由进食，饮水，自然昼夜节律光照。
二、应激模型的建立
强迫游泳组动物于15:00～17:00之间于水深30cm,水温怛定在36℃的玻璃水缸中接受强迫游泳20 min[2]，束缚应激组动物于同一时间内仰卧于木板上，用胶布将四肢粘贴固定，束缚时间持续60min，实验组动物于应激结束后3h处死 。在实验操作过程中，动作轻柔，避免对动物用力挤、捏、抓、压等。
三、灌注和切片
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实验组和对照组大鼠均给于戊巴比妥钠深麻醉(60mg/kg)，剖开胸腔后，经升主动脉快速灌注37℃生理盐水300ml，继之灌注4℃ 4%多聚甲醛(用PBS配制，PH=7.4)200～300ml，持续0.5～1h，然后剥离鼠脑修块，置同样浓度的多聚甲醛固定液中24h以上，经石腊包埋后，连续冠状切片，片厚约5um,用除有APES胶的载玻片捞片。
四、c-fos和 c-jun蛋白免疫组化法
①上述石腊切片常规脱蜡至水，用3%H2O2甲醇溶液37℃孵育30min，0.1%胰酶(滴加)37℃孵育15min，2%BSA(小牛血清蛋白)37℃孵育2h。②滴加免抗多克隆fos抗体(sigma)(稀释度1:200)或免抗多克隆jun抗体(sigma)(稀释度1:200)，37℃孵育2h或4℃过夜。③滴加生物素标记的单抗兔IgG (Zymed公司)，稀释度为 1:100，37℃孵育 30 min，④滴加辣根酶标记的链霉卵白素(Zymed公司)，稀释度为1:100，37℃孵育15min。⑤DAB显色，显微镜下控制显色时间3-5min，自来水冲洗，终止显色反应，最后脱水透明和封片，上述各步骤之间均用0.01mol/L PBS 冲洗3×5min。
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五 、图像分析
对正常对照组和应激组的每只动物各取具有额叶皮层(FC)、海马齿状回(DG)、下丘脑室旁核(PVN)及小脑颗粒细胞层(GCL)切片 10±1张在计算机图像分析系统(MIAS-2000)上分别测量c-fos和 c-jun阳性细胞相对切面面积比(阳性细胞面积和占视场面积的百分比)和平均目标灰度值(所测阳性细胞平均灰度)，灰度单位分为256个等级，免疫反应的强弱与灰度值呈反比关系，对每只动物所测量的切片得出的数据取平均值，结果采用两样本均数比较的t检验。
结果
一、c-fos和 c-jun阳性神经元的分布
1. 大脑皮层 强迫游泳应激后，c-fos和 c-jun的 表达主要集中于额叶、颞顶皮层，顶叶和枕叶皮层也有一定程度的表达，束缚应激后大脑皮层c-fos和 c-jun阳性神经元的分布类似于强迫游泳，但细胞染色深度稍弱。
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2. 海马 两组应激动物在齿状区和CA1区可见中等着色的c-fos和 c-jun阳性神经元，在CA2和 CA3-CA4几乎未见阳性着色，强迫游泳组可见海马脚有中等程度c-fos阳性染色，而束缚应激组未见类似阳性细胞。
3. 下丘脑 两组应激动物在PVN、视上核(SON)、外侧区(LH)及背内侧核(DMN)均有较强的c-fos阳性染色，在乳头体及后内侧区偶见有较小阳性细胞。两组仅在PVN及内侧乳头体可见较强 c-jun 阳性神经元，其它区域只有较少的小型阳性细胞。
4. 小脑 强迫游泳组在浦肯野氏细胞层(PCL)和GCL均有较大c-fos神经元，而束缚应激组无类似发现；两组在PCL和GCL区域均可见中等着色的c-jun阳性细胞。
二、两种应激方式诱导c-fos和 c-jun表达的图像分析
应激组动物不同脑区相关核团内c-fos和 c-jun阳性细胞密度和染色强度均高于正常对照组，经计算机图像分析后，见表1、2。 两种应激方式在大脑额皮层(FC)、海马齿状回(DG)、下丘脑室旁核(PVN)及小脑颗粒细胞层(GCL)诱导的c-jun表达基本一致 ，两组c-fos表达仅在GCL区域存在有显著性差异(P<0.05)。
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表1 两种应激后不同脑区内c-fos阳性细胞相对切面面积比和平均灰度值 分 组
FC
DG
PVN
GCL
面积比
灰度值
面积比
灰度值
面积比
灰度值
面积比
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灰度值
正常组
0.82±0.03
178.41±3.75
0.71±0.02
174.21±4.16
0.56±0.11
180.5±7.81
0.92±0.13
168.17±9.30
束缚应激
2.95±0.23*
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138.7±3.98*
2.45±0.30*
148.73±3.92
3.23±0.48*
128±6.20*
1.21±0.10
166.21±8.50
强迫游泳
3.10±0.41*
124.22±3.12*
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2.49±0.31*
146.23±3.45
3.28±0.45*
130±7.20*
1.28±0.17*△
135.12±6.4*△
注：与正常组相比*P<0.05；与束缚应激组相比△P<0.05表2 两种应激后不同脑区内c-jun阳性细胞相对切面面积比和平均灰度值 分 组
FC
DG
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PVN
GCL
面积比
灰度值
面积比
灰度值
面积比
灰度值
面积比
灰度值
正常组
0.96±0.04
178.12±7.65
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1.14±0.81
182.10±9.1
0.88±0.03
192.225±8.80
1.24±0.06
174.1±7.50
束缚应激
3.21±0.13*
131.01±5.81*
2.49±0.82*
135.91±6.25*
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3.24±0.12*
129.65±5.15*
2.34±0.13*
145.51±7.18
强迫游泳
3.87±0.14*
128.5±5.01*
2.68±0.71*
147.21±5.85
3.50±0.12*
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126.75±5.01*
2.48±0.14*
146.7±6.90
注：与正常组相比*P<0.05讨论
IEG由于在很多脑区可以快速地诱导表达，近年来已被视为神经元活动的标志，在应激反应中，第一级神经元的兴奋引起神经递质(或激素)的分泌，并作为第一信使，作用于靶细胞的细胞膜，再由跨膜转导机制将信号传入细胞内，激活胞内的第二信使，如cAMP、cGMP、甘油二脂(DG)及Ca2+等，从而引起靶细胞特定的生理反应(如神经元的兴奋或抑制，肌细胞的收缩，腺细胞的分泌等)，同时还会激活IEG基因(如c-fos、c-jun)的转录，该转录生成的mRNA逸出胞核到胞浆被翻译成FOS和JUN蛋白，二者形成同源或异源二聚体，并作为转录因子，作用于靶基因上的AP-1结合位点，从而调控其它多种基因的表达和靶蛋白的合成[4，5]。一般认为c-fos mRNA的表达在应激后几分钟开始，而c-fos蛋白的表达需要一个较长的转录过程，本研究中c-fos和 c-jun蛋白于应激后3h左右已有较强表达，并广泛分布于大脑皮层、海马、下丘脑及小脑等多个脑区，说明应激后的生理和行为反应涉及到了上述多个脑区的神经元活动。
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在本研究中，c-fos的 表达除在下丘脑PVN外，在视上核，背内侧核、外侧区、弓状核和后内侧核亦有较强的表达，PVN可以合成和释放CRH，是HPA轴功能活跃的直接起始点，背内侧核和外侧区分布有较多促黑素能神经元，促黑素激素能调节HAP轴的功能[6]；而在弓状核，c-fos的表达与POMC及神经肽Y神经元分布紧密相联，POMC和神经肽Y被认为是介导冲动至PVN的重要结构[7]，这说明c-fos通过调节这些区域的激素(或递质)的合成，而参与HPA轴功能的改变。另外，前脑亦有较多的c-fos和 c-jun阳性细胞，在前脑分布有GABA能神经元投射到PVN的CRH神经细胞，在背内侧核也有GABA能神经元投射到PVN的内侧小细胞部，而GABA能系统被认为广泛地参与了应激时的情绪和行为反应[8，9]。在本研究中还发现下丘脑重要核团PVN的大细胞部(mPVN)c-fos和 c-jun阳性染色较弱，明显低于小细胞部(pPVN)，但并不能否认mPVN在应激反应中的重要作用，因为在急性应激后，还有一个较长时间的继发效应，如集中涣散的注意力，平静唤起的情绪等，mPVN的IEG 是否是在其它脑区IEG表达下降后再起动表达，从而介导应激的继发性生理和心理效应，目前还不清楚，需要进一步研究证实。
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探索不同的应激方式诱导的大脑的不同区域IEG神经元活动及HPA轴功能改变，对了解应激的神经生物学机制有着重要意义[10]。在本实验中，小脑部分区域c-fos的表达在强迫游泳组明显高于束缚应激组，提示在强迫游泳应激过程中，动物为了避免浸没水中，而需不停地游动，此种应激可能存在更多地生理性效应。但在其它脑区，两种应激诱导的c-fos和c-jun的表达分布基本一致，染色强度亦相近，无显著性差异，说明不同的应激方式，其生理和心理效应是类似的[11]。
总之，通过本研究可以发现不同方式的应激均可在大脑的相关区域诱导c-fos和 c-jun的表达，多个脑区c-fos和c-jun阳性神经元的活动均可能参与了激发HPA轴功能改变，不同脑区在参与应激反应和影响HPA轴功能中的作用机制并不相同，关于应激的急性效应和继发效应与相关脑区IEG的即时反应和继发性反应之间的关系，还没有肯定的结论，值得进一步深入研究。
* 国家自然科学基金会启动基金题(960179)及美国南加利福尼亚大学合作项目。
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参考文献
1 Cullinan WE, Herman JP, Batraglia DF, et al Pattern and time course of immediate early gene expression in rat brain following acute stress. Neuroscience, 1995, 64:477～505.
2 陆林，黄明生，孙学礼，等.应激诱导大鼠下丘脑和海马内一氧化氮合酶的改变.中国行为医学科学，1998，7(suppl)：1～3.
3 Morgan JI, Curran T, Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate early genes. Trends Neurosci, 1998, 12：459～462.
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4 Sheng M, Greenberg ME. The regulation and function of c-fos and other immediate early genes in the nervous system. Neuron, 1990, 4：477～485.
5 Smith MA, Banerjee S, Gold PW, et al. Induction of c-fos mRNA in rat brain by conditioned and unconditioned stressors. Brain Res, 1992, 578：135～141.
6 Bittencourt JC, Press F, Arias C, et al. The melanin-concentrating hormone system of the rat brain: an immuno-and hybridization histochemical characterization. J Comp Neurol ,1992, 319：218～245.
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7 Baker RA, Herkenham M. Neurotransmitter specific neurons that project from the arcuate nucleus to the paraventricular hypothalamic nucleus: effect of adrenalectomy. Soc Neurosci Abstr, 1993, 19：762～768.
8 Cullinan WE, Herman TP, Watson ST. Ventral subicular interaction with hypothalamic paraventricular nucleus: evidence for a relay in the bed nucleus of the stria terminalis. J Comp Nearol, 1993, 332：1～20.
9 Roland BL, Sawchenko PE. Local origins of some GABAergic projections to the paraventricular and supraotic nucleus of the hypothalamus in the rat. J comp Neurol, 1993, 332：123～143.
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10 Pezzone MA, Lee WS, Hoffman GE, et al. Activation of brainstem catecholaminergic neurons by conditioned and unconditioned aversive stimuli as revealed by c-fos immunoreactivity. Brain Res, 1993, 608：310～318.
11 Pezzone MA, Lee WS, Hoffman GE, et al, Induction of c-fos immunoreactivity in the rat forebrain by conditioned and unconditioned aversive stimuli. Brain Res, 1992, 597：41～50.
收稿日期：1998—12—27, 百拇医药
单位：陆 林 黄明生(610041 华西医科大学附一院心理卫生研究所)；Mednick SA(美国南加利福尼亚大学)；李 毅(四川大学图形图象研究所)
关键词：应激；c-fos；c-jun；强迫游泳；束缚；大鼠
中国行为医学科学990301 【摘要】 目的 研究不同脑区内c-fos和 c-jun蛋白的表达与不同方式应激之间的关系。方法 采用特异性抗体的原位免疫细胞化学方法，对强迫游泳和束缚应激后大鼠脑皮层、海马、下丘脑及小脑内fos和 jun蛋白阳性神经元的分布进行观察，用图像分析技术对大鼠额皮层(FC)、海马齿状核(DG)、下丘脑室旁核(PVN)及小脑颗粒细胞层(GCL)内的fos和 jun阳性细胞的相对切面面积比和平均目标灰度进行分析。结果 两种方式应激结束后3h，脑皮层的额叶和颞叶、海马的CA1和DG及下丘脑的PVN、视上核、背内侧核均有较强的c-fos和 c-jun表达。图像分析结果发现，在 FC、DG及PVN区域，两种应激后c-fos和 c-jun阳性胞体相对切面面积比相似，均高于正常大鼠(P<0.05)，而平均目标灰度，则显著降低(P<0.05)，而在GCL，强迫游泳应激组的FOS阳性胞体面积比高于束缚应激组，亦有显著性差异。结论 不同的应激方式诱导相关脑区c-fos和 c-jun的表达基本一致，强迫游泳可能具有更多躯体方面的效应。
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The acute stress induces expression of immediate early gene c-fos and c-jun in rat brain Ⅱ: the relationship between the stress of different style and the expression of c-fos and c-jun
Lu Lin, Huang Mingsheng,Mednick SA，et al.
Institute of Mental Health, the First Hospital Affiliated to West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
【Abstract】 Objective To explore the relationship between the stress of different style and the expression of c-fos and c-jun in rat brain. Methods The immunohistochemistry was performed to observe the distribution of c-fos and c-jun neurons with neocortex, hippcampus, hypothalamus and cerebellum, and the computerized image technique was used to analyze the change in grey degree and relative sectional area of fos and jun positive neurons in the frontal cortex (FC), hippocampal dentate gyrus(DG), hypothalamic paraventricular nucleus(PVN) and cerebellum granule cell layer(GCL). Results A dense accumulation of fos and jun positive neurons exhibited in the FC, temporal cortex, CA1, DG, PVN, the supraoptic nucleus (SON) and the dorsomedial nucleus(DMN). With using computerized image analysis, the relative sectional area and grey degree of Fos and Jun positive neurons in FC, DG and PVN in the two style stress rats were longer and lower than those of normal group (P<0.05) respectively, and there were significant different in the relative sectional area and grey degree of GCL c-fos positive neurons between the forced swimming rats and immobilization stress rats (P<0.05). Conclusion The results of the present investigation suggest similarities in the pattern of IEG expression between swim and restraint stress, and the swimming stress may be reflective of the greater physical component.
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【Key words】 Stress c-fos c-jun Forced swimming Restraint Rat
应激可以引起下丘脑一垂体一肾上腺轴(HPA)功能活跃，机体感受应激后，使下丘脑视上核小细胞部(pPVN)促肾上腺皮质激素释放因子(CRH)的合成和分泌增加，CRH再继发性诱导垂体释放促肾上腺皮质激素和肾上腺皮质释放糖皮质激素，后者参与机体的各种生理效应，如提供机体应付应激时的能量和代谢需要，但机体感受应激后，又怎样引起pPVN释放激素，其中间的神经通路目前尚不清楚。虽然近年来即时反应基因(IEG)中的c-fos和c-jun作为神经元的活动和示踪标志[1，3]，被广泛地应用于应激的神经通路研究之中，但不同的应激方式引起的神经元功能改变是否存在着差异，很少有文献报道。本文通过采用特异性抗体的原位免疫细胞化学方法检测c-fos和 c-jun蛋白，来探索不同应激方式诱导c-fos和 c-jun的表达规律及大脑感受应激的可能神经元通路。
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材料和方法
一、实验动物
采用成年雄性Wistar大鼠(由华西医科大学动物中心提供)24只，体重200～250mg, 随机分为对照组、强迫游泳和束缚应激组，每组8只，实验前均在安静的室温下适应性饲养1周，自由进食，饮水，自然昼夜节律光照。
二、应激模型的建立
强迫游泳组动物于15:00～17:00之间于水深30cm,水温怛定在36℃的玻璃水缸中接受强迫游泳20 min[2]，束缚应激组动物于同一时间内仰卧于木板上，用胶布将四肢粘贴固定，束缚时间持续60min，实验组动物于应激结束后3h处死 。在实验操作过程中，动作轻柔，避免对动物用力挤、捏、抓、压等。
三、灌注和切片
, 百拇医药
实验组和对照组大鼠均给于戊巴比妥钠深麻醉(60mg/kg)，剖开胸腔后，经升主动脉快速灌注37℃生理盐水300ml，继之灌注4℃ 4%多聚甲醛(用PBS配制，PH=7.4)200～300ml，持续0.5～1h，然后剥离鼠脑修块，置同样浓度的多聚甲醛固定液中24h以上，经石腊包埋后，连续冠状切片，片厚约5um,用除有APES胶的载玻片捞片。
四、c-fos和 c-jun蛋白免疫组化法
①上述石腊切片常规脱蜡至水，用3%H2O2甲醇溶液37℃孵育30min，0.1%胰酶(滴加)37℃孵育15min，2%BSA(小牛血清蛋白)37℃孵育2h。②滴加免抗多克隆fos抗体(sigma)(稀释度1:200)或免抗多克隆jun抗体(sigma)(稀释度1:200)，37℃孵育2h或4℃过夜。③滴加生物素标记的单抗兔IgG (Zymed公司)，稀释度为 1:100，37℃孵育 30 min，④滴加辣根酶标记的链霉卵白素(Zymed公司)，稀释度为1:100，37℃孵育15min。⑤DAB显色，显微镜下控制显色时间3-5min，自来水冲洗，终止显色反应，最后脱水透明和封片，上述各步骤之间均用0.01mol/L PBS 冲洗3×5min。
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五 、图像分析
对正常对照组和应激组的每只动物各取具有额叶皮层(FC)、海马齿状回(DG)、下丘脑室旁核(PVN)及小脑颗粒细胞层(GCL)切片 10±1张在计算机图像分析系统(MIAS-2000)上分别测量c-fos和 c-jun阳性细胞相对切面面积比(阳性细胞面积和占视场面积的百分比)和平均目标灰度值(所测阳性细胞平均灰度)，灰度单位分为256个等级，免疫反应的强弱与灰度值呈反比关系，对每只动物所测量的切片得出的数据取平均值，结果采用两样本均数比较的t检验。
结果
一、c-fos和 c-jun阳性神经元的分布
1. 大脑皮层 强迫游泳应激后，c-fos和 c-jun的 表达主要集中于额叶、颞顶皮层，顶叶和枕叶皮层也有一定程度的表达，束缚应激后大脑皮层c-fos和 c-jun阳性神经元的分布类似于强迫游泳，但细胞染色深度稍弱。
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2. 海马 两组应激动物在齿状区和CA1区可见中等着色的c-fos和 c-jun阳性神经元，在CA2和 CA3-CA4几乎未见阳性着色，强迫游泳组可见海马脚有中等程度c-fos阳性染色，而束缚应激组未见类似阳性细胞。
3. 下丘脑 两组应激动物在PVN、视上核(SON)、外侧区(LH)及背内侧核(DMN)均有较强的c-fos阳性染色，在乳头体及后内侧区偶见有较小阳性细胞。两组仅在PVN及内侧乳头体可见较强 c-jun 阳性神经元，其它区域只有较少的小型阳性细胞。
4. 小脑 强迫游泳组在浦肯野氏细胞层(PCL)和GCL均有较大c-fos神经元，而束缚应激组无类似发现；两组在PCL和GCL区域均可见中等着色的c-jun阳性细胞。
二、两种应激方式诱导c-fos和 c-jun表达的图像分析
应激组动物不同脑区相关核团内c-fos和 c-jun阳性细胞密度和染色强度均高于正常对照组，经计算机图像分析后，见表1、2。 两种应激方式在大脑额皮层(FC)、海马齿状回(DG)、下丘脑室旁核(PVN)及小脑颗粒细胞层(GCL)诱导的c-jun表达基本一致 ，两组c-fos表达仅在GCL区域存在有显著性差异(P<0.05)。
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表1 两种应激后不同脑区内c-fos阳性细胞相对切面面积比和平均灰度值 分 组
FC
DG
PVN
GCL
面积比
灰度值
面积比
灰度值
面积比
灰度值
面积比
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灰度值
正常组
0.82±0.03
178.41±3.75
0.71±0.02
174.21±4.16
0.56±0.11
180.5±7.81
0.92±0.13
168.17±9.30
束缚应激
2.95±0.23*
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138.7±3.98*
2.45±0.30*
148.73±3.92
3.23±0.48*
128±6.20*
1.21±0.10
166.21±8.50
强迫游泳
3.10±0.41*
124.22±3.12*
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2.49±0.31*
146.23±3.45
3.28±0.45*
130±7.20*
1.28±0.17*△
135.12±6.4*△
注：与正常组相比*P<0.05；与束缚应激组相比△P<0.05表2 两种应激后不同脑区内c-jun阳性细胞相对切面面积比和平均灰度值 分 组
FC
DG
, 百拇医药
PVN
GCL
面积比
灰度值
面积比
灰度值
面积比
灰度值
面积比
灰度值
正常组
0.96±0.04
178.12±7.65
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1.14±0.81
182.10±9.1
0.88±0.03
192.225±8.80
1.24±0.06
174.1±7.50
束缚应激
3.21±0.13*
131.01±5.81*
2.49±0.82*
135.91±6.25*
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3.24±0.12*
129.65±5.15*
2.34±0.13*
145.51±7.18
强迫游泳
3.87±0.14*
128.5±5.01*
2.68±0.71*
147.21±5.85
3.50±0.12*
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126.75±5.01*
2.48±0.14*
146.7±6.90
注：与正常组相比*P<0.05讨论
IEG由于在很多脑区可以快速地诱导表达，近年来已被视为神经元活动的标志，在应激反应中，第一级神经元的兴奋引起神经递质(或激素)的分泌，并作为第一信使，作用于靶细胞的细胞膜，再由跨膜转导机制将信号传入细胞内，激活胞内的第二信使，如cAMP、cGMP、甘油二脂(DG)及Ca2+等，从而引起靶细胞特定的生理反应(如神经元的兴奋或抑制，肌细胞的收缩，腺细胞的分泌等)，同时还会激活IEG基因(如c-fos、c-jun)的转录，该转录生成的mRNA逸出胞核到胞浆被翻译成FOS和JUN蛋白，二者形成同源或异源二聚体，并作为转录因子，作用于靶基因上的AP-1结合位点，从而调控其它多种基因的表达和靶蛋白的合成[4，5]。一般认为c-fos mRNA的表达在应激后几分钟开始，而c-fos蛋白的表达需要一个较长的转录过程，本研究中c-fos和 c-jun蛋白于应激后3h左右已有较强表达，并广泛分布于大脑皮层、海马、下丘脑及小脑等多个脑区，说明应激后的生理和行为反应涉及到了上述多个脑区的神经元活动。
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在本研究中，c-fos的 表达除在下丘脑PVN外，在视上核，背内侧核、外侧区、弓状核和后内侧核亦有较强的表达，PVN可以合成和释放CRH，是HPA轴功能活跃的直接起始点，背内侧核和外侧区分布有较多促黑素能神经元，促黑素激素能调节HAP轴的功能[6]；而在弓状核，c-fos的表达与POMC及神经肽Y神经元分布紧密相联，POMC和神经肽Y被认为是介导冲动至PVN的重要结构[7]，这说明c-fos通过调节这些区域的激素(或递质)的合成，而参与HPA轴功能的改变。另外，前脑亦有较多的c-fos和 c-jun阳性细胞，在前脑分布有GABA能神经元投射到PVN的CRH神经细胞，在背内侧核也有GABA能神经元投射到PVN的内侧小细胞部，而GABA能系统被认为广泛地参与了应激时的情绪和行为反应[8，9]。在本研究中还发现下丘脑重要核团PVN的大细胞部(mPVN)c-fos和 c-jun阳性染色较弱，明显低于小细胞部(pPVN)，但并不能否认mPVN在应激反应中的重要作用，因为在急性应激后，还有一个较长时间的继发效应，如集中涣散的注意力，平静唤起的情绪等，mPVN的IEG 是否是在其它脑区IEG表达下降后再起动表达，从而介导应激的继发性生理和心理效应，目前还不清楚，需要进一步研究证实。
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探索不同的应激方式诱导的大脑的不同区域IEG神经元活动及HPA轴功能改变，对了解应激的神经生物学机制有着重要意义[10]。在本实验中，小脑部分区域c-fos的表达在强迫游泳组明显高于束缚应激组，提示在强迫游泳应激过程中，动物为了避免浸没水中，而需不停地游动，此种应激可能存在更多地生理性效应。但在其它脑区，两种应激诱导的c-fos和c-jun的表达分布基本一致，染色强度亦相近，无显著性差异，说明不同的应激方式，其生理和心理效应是类似的[11]。
总之，通过本研究可以发现不同方式的应激均可在大脑的相关区域诱导c-fos和 c-jun的表达，多个脑区c-fos和c-jun阳性神经元的活动均可能参与了激发HPA轴功能改变，不同脑区在参与应激反应和影响HPA轴功能中的作用机制并不相同，关于应激的急性效应和继发效应与相关脑区IEG的即时反应和继发性反应之间的关系，还没有肯定的结论，值得进一步深入研究。
* 国家自然科学基金会启动基金题(960179)及美国南加利福尼亚大学合作项目。
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收稿日期：1998—12—27, 百拇医药