褪黑激素抗胶质瘤作用的体内试验
作者：王广秀 浦佩玉 刘旭文 王春艳
单位：天津医科大学总医院 天津市神经病学研究所神经肿瘤室(天津300052)
关键词：胶质瘤；褪黑激素；体内试验
肿瘤990408 目的 探讨MLT体内抗胶质瘤作用。方法 观察荷C6鼠胶质瘤大鼠接受MLT治疗后肿瘤大小，生存期，病理组织学及细胞凋亡的变化。结果 MLT治疗后C6胶质瘤生长延缓，荷瘤大鼠生存期延长，诱发肿瘤细胞凋亡。 结论 MLT有一定抑瘤作用，值得进一步临床实验。
THE EFFECT OF MELATONIN ON BRAIN TUMOR IN VIVO
Wang Guangxiu, Pu Peiyu, Liu Xuwen, et al.
, http://www.100md.com
Lab. of Neuro-Oncology, Tianjin Neurologic Institute.Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 300052
Objective：To explore the inhibitory effect of melatonin (MLT) on brain tumors in vivo.Methods：Observe the change of tumor size, survival time, histopathology, and cell apoptosis in Wistar rats bearing C6 glioma which were treated with MLT.Results：The survival times of the rats with C6 glioma were prolonged, C6 gliomas grew slower than in the control rats and the apoptosis of tumor cells was induced.Conclusion：MLT has moderate inhibitory effect on C6 gliomas, study is warranted
, 百拇医药
Key words Melatonin Glioma Experiment in vivo
恶性胶质瘤的治疗仍是当前神经外科亟待解决的问题，许多学者致力于开拓新的治疗方法。褪黑激素(melatonin, MLT)作为一种新型的辅助抗癌药物已得到某些学者的关注，我室曾采用恶性胶质瘤体外细胞对MLT抗胶质瘤作用进行了体外试验，发现有明显抑瘤作用[1]。为进一步探讨MLT体内抗胶质瘤作用，模拟人脑胶质瘤的临床治疗过程，本文使用C6大鼠脑胶质瘤模型进行了MLT抑癌作用的研究。
材料与方法
一、大鼠脑C6胶质瘤模型的建立及实验分组
1.C6鼠胶质瘤细胞(美国NIH馈赠)于含10%FCS DMEM培养液中生长。二级雄性Wistar大鼠，体重150～200 g，共14只，由中国医学科学院实验动物研究所提供。应用立体定向术将含1.5×106个C6胶质瘤细胞的15 μl细胞悬液，接种于大鼠右尾状核建立脑胶质瘤动物模型[2]。将动物随机分为二组：(1)对照组8只接种C6大鼠胶质瘤细胞。(2)治疗组6只接种C6胶质瘤细胞1周后，每天按10 μg/g体重剂量饲喂MLT(Sigma Chemical Co, USA)，直到大鼠自然死亡。
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2.肿瘤生长情况检测进行下列观察：
(1)各组大鼠一般情况及生存期。
(2)鼠脑MRI检查 用GE公司1.5T Signa MR机对对照组及治疗组部分大鼠定期进行MRI平扫及增强扫描(Gd-DTPA 0.2 mmol/kg，尾静脉注入)观察肿瘤生长情况。
(3)病理组织学观察 各组大鼠均在其自然死亡后，将脑肿瘤组织固定于10%福尔马林溶液中，常规石蜡包埋后冠状切片，行大体标本观察、常规HE染色。
(4)电镜检查 各组均选取2例标本的少量组织，经6%戊二醛磷酸缓冲液固定，进行细胞凋亡的超微结构观察。
二、鼠皮下胶质瘤模型的建立及MLT的抑瘤作用
在鼠脑胶质瘤模型建立的同时，将含1.5×106个C6胶质瘤细胞的15 μl细胞悬液接种于同只大鼠右后肢皮下，制成C6胶质瘤皮下模型，对照组8只，未治疗；治疗组8只，按每天10 μg/g体重剂量直接于肿瘤部位注射给药，直至大鼠自然死亡，计算两组的肿瘤体积[3]：皮下肿瘤体积=肿瘤的短径2×肿瘤长径/2。
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结果
一、大鼠一般情况与生存观察
对照组 脑部接种C6胶质瘤细胞1周后，大鼠开始自行觅食水较正常鼠明显减少，体重下降，精神不振，继而出现进行性左侧偏瘫，部分大鼠出现眶周出血，均于2～3周内发生死亡；对照组8只大鼠，平均生存时间为17.3±6.5天。治疗组 治疗组大鼠一般情况与同期对照组大鼠相似，但平均生存时间比对照组有所延长，为23.3±8.3天，与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。
二、MRI影像学检查结果
对照组 接种C6胶质瘤细胞1周后有4只行MRI检查。表现较淡的长T1长T2信号，中线轻度移位，轻度均匀或不均匀强化，边缘不清楚。接种C6胶质瘤细胞2周后有6只行MRI检查，增多表现为明显的长T1长T2信号影，中线明显移位，均匀或环状强化，6只中3只脑室扩大。治疗组 接种1周时即治疗前有2只行MRI扫描，其表现同对照组。接种后2周时即治疗后1周，原长T1长T2病灶增大，边缘清楚，强化均匀或环状强化，中线结构明显左移，脑室轻度扩大，肿瘤体积比对照组略小(见图1，2)。接种后4周行MRI扫描，发现原有病灶强化范围均较前次MRI扫描时继续增大，中线左移，脑室增大更加明显。
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图1 接种C6细胞2周时对照的MRI影像，鼠脑右侧可见强化的边界不清晰的瘤灶，范围较大。
图2 接种C6细胞2周(即经MLT治疗1周)时治疗鼠的MRI影像，可见强化明显，边界清楚的瘤灶。
三、病理
对照组 HE检查可见生长活跃的胶质瘤细胞密集成群，并向脑组织呈侵袭性生长，肿瘤中心C6细胞重叠并有囊性变、坏死和肿瘤血管生成，坏死的肿瘤细胞伴随明显的假栅栏状排列并存在有丝分裂特征，脑组织与肿瘤交界处虽能见到单个C6细胞侵入脑实质，但仍能见到一个较明显的界限，侧脑室脉络丛、室管膜下及蛛网膜下可见少量的肿瘤细胞，尤以脑室扩大者明显。治疗组与对照组差别不大。
四、透射电镜观察细胞凋亡
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透射电镜下见治疗组肿瘤细胞细胞核染色质凝聚成团块，有的成典型的新月形改变，附于核膜下，有凋亡的改变(见插页第4页图2)，而对照组肿瘤细胞核膜及细胞器结构完整，未检出有这种凋亡的特征性改变(见插页第4页图3)。
图2 透射电镜下治疗组肿瘤细胞，可见染色质凝聚于核膜下的凋亡改变
图3 透射电镜下对照组肿瘤细胞，未见细胞凋亡的特征性变化
五、大鼠皮下肿瘤的生长情况
接种C6胶质瘤细胞后1周内，大鼠右后肢皮下可见团块性肿瘤形成，瘤体随瘤龄延长其体积明显增大。对大鼠在自然死亡时其右后肢皮下团块性肿瘤体积进行测量，结果对照组8只大鼠为1.34±0.03 cm3；而治疗组6只大鼠为0.36±0.02 cm3，两者间有显著性差别(P<0.05)。
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讨论
MLT是松果体分泌的激素，其合成释放呈现昼低夜高的昼夜节率变化。MLT的生理功能不仅与生殖系统的发育有关，影响机体的时间生物效应，近年则发现，MLT具有抑制肿瘤细胞生长的作用。MLT在体外抗乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌等肿瘤细胞的增殖，国外已有报道[4]。我室曾研究和发现MLT对人脑复发性恶性星型细胞瘤体外细胞系TJ861有明显的生长抑制作用[1]。
关于MLT抗肿瘤作用的体内试验也有某些报道。Narita等[5]将7×104个B16黑色素瘤细胞接肿于BALB/c裸鼠的背部皮下，按每天5 μg/g体重的剂量饲喂MLT，40天后检查，实验组肿瘤体积明显小于对照组，其重量仅为对照组的1/4～1/2。Lissoni等[6]对54例常规治疗无效的晚期转移癌病人，给MLT治疗，其中1/3病例(18/54)病情有明显改善。MLT抑制肿瘤细胞生长的机理目前尚不完全清楚，Narita和Shellard等[5，7]学者通过总结试验结果，认为：1.直接杀伤细胞。2.抑制细胞的有丝分裂。3.对于肿瘤生长有关的垂体激素的抑制。4.调节多胺合成和喋呤代谢，从而影响肿瘤细胞增殖。5.具有免疫调控作用。动物实验表明MLT可促进T淋巴细胞的增生及增强NK细胞的活性[8]。
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本实验表明，MLT能够延缓C6鼠脑胶质瘤的生长，使荷瘤大鼠生存期延长，在实验中还发现，MLT直接注射肿瘤局部其效果更加明显，这可能与局部MLT浓度增高，其直接杀伤瘤细胞的作用有关。此外，MLT可以促进宿主免疫反应，诱发肿瘤细胞凋亡。因此，我们认为MLT是一种潜力的抗肿瘤辅助药物，有待于进一步临床实验观察。
第一作者简介 王广秀，女，大专，主管技师。
参考文献
1 赵 亮，浦佩玉，彭 琼，等.褪黑激素抗胶质瘤作用体外试验研究.中华神经外科杂志，1995，11：154
2 王伟民，朱 诚，张光霁，等.脑立体定向接种C6细胞建立大鼠胶胶质瘤模型.中华实验外科杂志，1995， 12(4)：221
3 Mishma K, Asai A, Sugiyama A, et al. Increased expression of schwannoma-derived growth factor (SDGF) mRNA in rat tumor cells: involvement of SDGF in the growth promotion of rat gliomas. Int J Cancer, 1996，66:352
, 百拇医药
4 Barni S, Lissoni P. A study of the pineal hormone melatonin as a second line therapy in metastatic colorectal cancer resistant to fluorouracil plus folates.Tumori, 1990, 76:58
5 Narita T, Kudo H. Effect of melatonin on B16 melanoma growth in athymic mice.Cancer Res, 1985,45:4175
6 Lissoni P, Barni S, Cattaneo G, et al. Clinical results with the pineal hormone melatonin in advanced cancer resistant to standard antitumor therapies. Oncology, 1991, 48:448
, http://www.100md.com
7 Shellard SA, Whelan RDH, Hill BT. Growth inhibitory and cytotoxic effects of melatonin and its metabolisms on human tumor cell lines in vitro. Br J Cancer, 1989, 60:288
8 Fraschini F, Scaglione F, Franco P, et al. Melatonin and immunity. Acta Oncol, 1990; 29(6):775
(收稿：1998-08-27 修回：1998-12-07), 百拇医药
单位：天津医科大学总医院 天津市神经病学研究所神经肿瘤室(天津300052)
关键词：胶质瘤；褪黑激素；体内试验
肿瘤990408 目的 探讨MLT体内抗胶质瘤作用。方法 观察荷C6鼠胶质瘤大鼠接受MLT治疗后肿瘤大小，生存期，病理组织学及细胞凋亡的变化。结果 MLT治疗后C6胶质瘤生长延缓，荷瘤大鼠生存期延长，诱发肿瘤细胞凋亡。 结论 MLT有一定抑瘤作用，值得进一步临床实验。
THE EFFECT OF MELATONIN ON BRAIN TUMOR IN VIVO
Wang Guangxiu, Pu Peiyu, Liu Xuwen, et al.
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Lab. of Neuro-Oncology, Tianjin Neurologic Institute.Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 300052
Objective：To explore the inhibitory effect of melatonin (MLT) on brain tumors in vivo.Methods：Observe the change of tumor size, survival time, histopathology, and cell apoptosis in Wistar rats bearing C6 glioma which were treated with MLT.Results：The survival times of the rats with C6 glioma were prolonged, C6 gliomas grew slower than in the control rats and the apoptosis of tumor cells was induced.Conclusion：MLT has moderate inhibitory effect on C6 gliomas, study is warranted
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Key words Melatonin Glioma Experiment in vivo
恶性胶质瘤的治疗仍是当前神经外科亟待解决的问题，许多学者致力于开拓新的治疗方法。褪黑激素(melatonin, MLT)作为一种新型的辅助抗癌药物已得到某些学者的关注，我室曾采用恶性胶质瘤体外细胞对MLT抗胶质瘤作用进行了体外试验，发现有明显抑瘤作用[1]。为进一步探讨MLT体内抗胶质瘤作用，模拟人脑胶质瘤的临床治疗过程，本文使用C6大鼠脑胶质瘤模型进行了MLT抑癌作用的研究。
材料与方法
一、大鼠脑C6胶质瘤模型的建立及实验分组
1.C6鼠胶质瘤细胞(美国NIH馈赠)于含10%FCS DMEM培养液中生长。二级雄性Wistar大鼠，体重150～200 g，共14只，由中国医学科学院实验动物研究所提供。应用立体定向术将含1.5×106个C6胶质瘤细胞的15 μl细胞悬液，接种于大鼠右尾状核建立脑胶质瘤动物模型[2]。将动物随机分为二组：(1)对照组8只接种C6大鼠胶质瘤细胞。(2)治疗组6只接种C6胶质瘤细胞1周后，每天按10 μg/g体重剂量饲喂MLT(Sigma Chemical Co, USA)，直到大鼠自然死亡。
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2.肿瘤生长情况检测进行下列观察：
(1)各组大鼠一般情况及生存期。
(2)鼠脑MRI检查 用GE公司1.5T Signa MR机对对照组及治疗组部分大鼠定期进行MRI平扫及增强扫描(Gd-DTPA 0.2 mmol/kg，尾静脉注入)观察肿瘤生长情况。
(3)病理组织学观察 各组大鼠均在其自然死亡后，将脑肿瘤组织固定于10%福尔马林溶液中，常规石蜡包埋后冠状切片，行大体标本观察、常规HE染色。
(4)电镜检查 各组均选取2例标本的少量组织，经6%戊二醛磷酸缓冲液固定，进行细胞凋亡的超微结构观察。
二、鼠皮下胶质瘤模型的建立及MLT的抑瘤作用
在鼠脑胶质瘤模型建立的同时，将含1.5×106个C6胶质瘤细胞的15 μl细胞悬液接种于同只大鼠右后肢皮下，制成C6胶质瘤皮下模型，对照组8只，未治疗；治疗组8只，按每天10 μg/g体重剂量直接于肿瘤部位注射给药，直至大鼠自然死亡，计算两组的肿瘤体积[3]：皮下肿瘤体积=肿瘤的短径2×肿瘤长径/2。
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结果
一、大鼠一般情况与生存观察
对照组 脑部接种C6胶质瘤细胞1周后，大鼠开始自行觅食水较正常鼠明显减少，体重下降，精神不振，继而出现进行性左侧偏瘫，部分大鼠出现眶周出血，均于2～3周内发生死亡；对照组8只大鼠，平均生存时间为17.3±6.5天。治疗组 治疗组大鼠一般情况与同期对照组大鼠相似，但平均生存时间比对照组有所延长，为23.3±8.3天，与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。
二、MRI影像学检查结果
对照组 接种C6胶质瘤细胞1周后有4只行MRI检查。表现较淡的长T1长T2信号，中线轻度移位，轻度均匀或不均匀强化，边缘不清楚。接种C6胶质瘤细胞2周后有6只行MRI检查，增多表现为明显的长T1长T2信号影，中线明显移位，均匀或环状强化，6只中3只脑室扩大。治疗组 接种1周时即治疗前有2只行MRI扫描，其表现同对照组。接种后2周时即治疗后1周，原长T1长T2病灶增大，边缘清楚，强化均匀或环状强化，中线结构明显左移，脑室轻度扩大，肿瘤体积比对照组略小(见图1，2)。接种后4周行MRI扫描，发现原有病灶强化范围均较前次MRI扫描时继续增大，中线左移，脑室增大更加明显。
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图1 接种C6细胞2周时对照的MRI影像，鼠脑右侧可见强化的边界不清晰的瘤灶，范围较大。
图2 接种C6细胞2周(即经MLT治疗1周)时治疗鼠的MRI影像，可见强化明显，边界清楚的瘤灶。
三、病理
对照组 HE检查可见生长活跃的胶质瘤细胞密集成群，并向脑组织呈侵袭性生长，肿瘤中心C6细胞重叠并有囊性变、坏死和肿瘤血管生成，坏死的肿瘤细胞伴随明显的假栅栏状排列并存在有丝分裂特征，脑组织与肿瘤交界处虽能见到单个C6细胞侵入脑实质，但仍能见到一个较明显的界限，侧脑室脉络丛、室管膜下及蛛网膜下可见少量的肿瘤细胞，尤以脑室扩大者明显。治疗组与对照组差别不大。
四、透射电镜观察细胞凋亡
, 百拇医药
透射电镜下见治疗组肿瘤细胞细胞核染色质凝聚成团块，有的成典型的新月形改变，附于核膜下，有凋亡的改变(见插页第4页图2)，而对照组肿瘤细胞核膜及细胞器结构完整，未检出有这种凋亡的特征性改变(见插页第4页图3)。
图2 透射电镜下治疗组肿瘤细胞，可见染色质凝聚于核膜下的凋亡改变
图3 透射电镜下对照组肿瘤细胞，未见细胞凋亡的特征性变化
五、大鼠皮下肿瘤的生长情况
接种C6胶质瘤细胞后1周内，大鼠右后肢皮下可见团块性肿瘤形成，瘤体随瘤龄延长其体积明显增大。对大鼠在自然死亡时其右后肢皮下团块性肿瘤体积进行测量，结果对照组8只大鼠为1.34±0.03 cm3；而治疗组6只大鼠为0.36±0.02 cm3，两者间有显著性差别(P<0.05)。
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讨论
MLT是松果体分泌的激素，其合成释放呈现昼低夜高的昼夜节率变化。MLT的生理功能不仅与生殖系统的发育有关，影响机体的时间生物效应，近年则发现，MLT具有抑制肿瘤细胞生长的作用。MLT在体外抗乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌等肿瘤细胞的增殖，国外已有报道[4]。我室曾研究和发现MLT对人脑复发性恶性星型细胞瘤体外细胞系TJ861有明显的生长抑制作用[1]。
关于MLT抗肿瘤作用的体内试验也有某些报道。Narita等[5]将7×104个B16黑色素瘤细胞接肿于BALB/c裸鼠的背部皮下，按每天5 μg/g体重的剂量饲喂MLT，40天后检查，实验组肿瘤体积明显小于对照组，其重量仅为对照组的1/4～1/2。Lissoni等[6]对54例常规治疗无效的晚期转移癌病人，给MLT治疗，其中1/3病例(18/54)病情有明显改善。MLT抑制肿瘤细胞生长的机理目前尚不完全清楚，Narita和Shellard等[5，7]学者通过总结试验结果，认为：1.直接杀伤细胞。2.抑制细胞的有丝分裂。3.对于肿瘤生长有关的垂体激素的抑制。4.调节多胺合成和喋呤代谢，从而影响肿瘤细胞增殖。5.具有免疫调控作用。动物实验表明MLT可促进T淋巴细胞的增生及增强NK细胞的活性[8]。
, http://www.100md.com
本实验表明，MLT能够延缓C6鼠脑胶质瘤的生长，使荷瘤大鼠生存期延长，在实验中还发现，MLT直接注射肿瘤局部其效果更加明显，这可能与局部MLT浓度增高，其直接杀伤瘤细胞的作用有关。此外，MLT可以促进宿主免疫反应，诱发肿瘤细胞凋亡。因此，我们认为MLT是一种潜力的抗肿瘤辅助药物，有待于进一步临床实验观察。
第一作者简介 王广秀，女，大专，主管技师。
参考文献
1 赵 亮，浦佩玉，彭 琼，等.褪黑激素抗胶质瘤作用体外试验研究.中华神经外科杂志，1995，11：154
2 王伟民，朱 诚，张光霁，等.脑立体定向接种C6细胞建立大鼠胶胶质瘤模型.中华实验外科杂志，1995， 12(4)：221
3 Mishma K, Asai A, Sugiyama A, et al. Increased expression of schwannoma-derived growth factor (SDGF) mRNA in rat tumor cells: involvement of SDGF in the growth promotion of rat gliomas. Int J Cancer, 1996，66:352
, 百拇医药
4 Barni S, Lissoni P. A study of the pineal hormone melatonin as a second line therapy in metastatic colorectal cancer resistant to fluorouracil plus folates.Tumori, 1990, 76:58
5 Narita T, Kudo H. Effect of melatonin on B16 melanoma growth in athymic mice.Cancer Res, 1985,45:4175
6 Lissoni P, Barni S, Cattaneo G, et al. Clinical results with the pineal hormone melatonin in advanced cancer resistant to standard antitumor therapies. Oncology, 1991, 48:448
, http://www.100md.com
7 Shellard SA, Whelan RDH, Hill BT. Growth inhibitory and cytotoxic effects of melatonin and its metabolisms on human tumor cell lines in vitro. Br J Cancer, 1989, 60:288
8 Fraschini F, Scaglione F, Franco P, et al. Melatonin and immunity. Acta Oncol, 1990; 29(6):775
(收稿：1998-08-27 修回：1998-12-07), 百拇医药