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编号:10277695
垂体腺瘤p16抑癌基因免疫组化和原位杂交的检测及与PCNA共表达的研究
http://www.100md.com 《肿瘤》 1999年第4期
     作者:于德蓉 易 静 陈玉英 李骁雄 熊文浩 沈建康 汤雪明

    单位:上海第二医科大学细胞生物学实验室(上海 200025);李骁雄 熊文浩 附属仁济医院神经外科;沈建康 附属瑞金医院神经外科

    关键词:垂体腺瘤;p16;PCNA;免疫组化;原位杂交

    肿瘤990405 目的 研究良性肿瘤垂体腺瘤中p16抑癌基因的改变和可能的作用机制。方法 用免疫组化和原位杂交技术研究p16在垂体腺瘤中的表达及其与临床病理的关系;并结合反映细胞增殖活性的指标PCNA的改变,以进一步了解p16在垂体腺瘤发生、发展过程中可能作用的分子机理。 结果 p16基因在垂体腺瘤中不发生缺失,而是存在不同程度的表达增强,其免疫组化阳性百分率的高低与肿瘤的大小、侵袭性、复发密切相关;p16的表达与PCNA呈高度正相关。 结论 p16、PCNA反映垂体腺瘤细胞的增殖活性,可能对临床预后有提示意义。
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    IMMUNOHISTOCHEMICAL AND IN SITU HYBRIDIZATIONAL STUDIES ON EXPRESSION OF TUMOR SUPPRESSOR GENE p16 AND ITS COEXPRESSION WITH PCNA IN PITUITARY ADENOMAS

    Yu Derong, Yi Jing, Chen Yuying, Li Xiaoxiong*, et al.

    Cell Biology Laboratory; Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025;*Department of Neurosurgery, Renji Hospital; Department of Neurosurgery,Ruijin Hospital;

    Objective:The aim of this work was to examine the alteration and the possible mechanism of tumor suppressor gene p16 in pituitary adenomas. Methods:Expressionof p16 gene and PCNA and their relationship with clinicopathological parameterswere investigated by immunohistochemical and in situ hybridization techniques. Results:p16 gene showed no deletion but over-expression in varied degree. A higher percentage of p16 positive cells had a statistically significant relation with bigger size of neoplasm, more frequent invasion and recurrence. The intensityof p16 immunohistochemical positivity was correlated with intensity of PCNA expression.Conclusion:The over-expression of p16 and PCNA can both reflect the proliferative activity of tumor cells and may be considered as prognostic indicators in pituitary adenomas.
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    Key words Pituitary adenoma p16 PCNA Immunohistochemistry In situ hybridization

    抑癌基因p16定位于染色体9p21,其编码的蛋白为细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)蛋白的抑制因子,参与细胞周期的调控。p16基因在多种肿瘤中的变化及其规律是抑癌基因研究的关注热点。一方面p16变化的分子机制已被揭示有基因的缺失、突变、甲基化等,另一方面以原发肿瘤临床标本为材料的大量工作证明p16改变所涉及的肿瘤种类相当广泛。对于p16在各种肿瘤中的变化形式及其与临床病理之间的关系究竟有无共同机制可寻,是令人感兴趣而又结论不一的一个问题。垂体腺瘤是一种常见的内分泌系统良性肿瘤。本研究就p16抑癌基因在垂体腺瘤中的表达情况和可能作用机制作一探讨。

    材料和方法

    (一)材料 31例垂体腺瘤均为上海第二医科大学附属瑞金和仁济医院新鲜垂体肿瘤切除手术标本。组织学分型为嗜酸、嗜碱、嫌色、混合性细胞腺瘤和组织增生。所有用于免疫组化和原位杂交的病理组织标本均经统一的方法进行处理,包括:4%多聚甲醛-PBS固定4~5小时后,梯度乙醇脱水,石蜡包埋,切片厚6 μm,每例标本均做HE染色。
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    (二)方法

    1.p16和PCNA免疫组化

    p16免疫组化采用Dako公司LSAB试剂盒。实验步骤包括:病理组织经前述统一方法制备后,切片经脱蜡复水,Triton-100处理,血清白蛋白封闭,抗p16多克隆抗体(C-20,Santa Cruz)1∶60稀释,4℃温育过夜。生物素化连结抗体原液室温温育20 min,辣根过氧化物酶联结的链霉亲和素1∶80稀释,室温20 min,DAB(3,3-二氨基联苯胺,辣根过氧化物酶催化底物)暗环境中显色至合适时终止反应。。

    PCNA免疫组化采用华美公司的ABC试剂盒,操作包括:石蜡切片经脱蜡复水后,3% H2O2-甲醇处理,血清白蛋白封闭,抗PCNA单抗(IDM879,华美生物工程公司)1∶100稀释,4℃温育过夜,生物素化鼠抗1∶50稀释,室温温育45 min,过氧化物酶联结的亲和素1∶50稀释,室温温育45 min,暗环境下DAB显色合适后终止反应。
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    对照 用已知p16和PCNA蛋白阳性表达的口腔鳞癌组织作为阳性对照,以PBS替代一抗作为阴性对照,存档的正常尸体垂体标本1例按同样步骤进行p16和PCNA组化反应。

    p16和PCNA免疫组化结果判断标准:以细胞核呈现棕色作为阳性。组化阴性细胞经苏木素复染后胞核呈蓝色。计数每200个肿瘤细胞中的阳性细胞数,计算出各例标本p16组化阳性细胞百分率,并将其分成四级:<25%为Ⅰ级;25%~50%为Ⅱ级;51%~75%为Ⅲ级;>75%为Ⅳ级。

    2.p16原位杂交

    病理组织经前述方法统一制备,其中捞片和梯度酒精复水均用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的双蒸水。杂交前主要实验步骤为:0.1 mol/L HCl,蛋白酶K(20 μg/ml 8 min,37 ℃),1%多聚甲醛-PBS,0.1 mol/L甘氨酸和0.25%乙酸酐-0.1 mol/L三乙醇胺,然后2×SSC(标准柠檬酸钠溶液)漂洗,切片在55 ℃杂交过夜。杂交探针为p16 RNA探针(ZDP7017,0.8 kb地高辛标记,购自北京中山公司,北京医科大学分子病理室制备)。杂交后组织经浓度逐渐降低的SSC溶液漂洗,碱性磷酸酶联结的抗地高辛抗体4℃温育过夜。碱性磷酸酶催化底物NBT/BCIP暗环境中显色。
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    对照 以杂交前用RNA酶(20 μg/ml)处理的及不加探针的切片作为阴性对照,已知出现杂交信号的口腔鳞癌切片作为阳性对照。判别标准:阳性杂交信号为蓝紫色,位于胞浆部位。

    (三)临床病理分型

    组化实验完成后收集临床病理资料。31例标本组织学分型为嗜酸、嗜碱、嫌色、混合性腺瘤。激素免疫组化分型有生长素、催乳素、促肾上腺皮质激素、黄体生成素、卵泡刺激素、促甲状腺素和混合性等类型。选择瘤体大小、是否侵袭蝶鞍和是否复发等若干参数反映临床肿瘤增殖能力。在31例标本中,瘤体大于或等于2cm直径的有19例,侵犯蝶鞍8例,复发5例。

    (四)统计学处理

    将p16和PCNA组化阳性百分率分为Ⅰ~Ⅱ级和Ⅲ~Ⅳ级两种,31例按肿瘤大小、是否穿透蝶鞍、复发以及临床特征和肿瘤组织学分型,分成若干组,各组p16和PCNA改变差异用卡方公式进行统计学分析;p16与PCNA的相关性分析用列联表资料的χ2检验,同时计算出校正Spearman等级相关系数rs’,以说明两者相关关系的密切程度和相关方向。分析用SAS软件包(6.11版)进行。
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    结果

    一、p16免疫组化

    阳性反应物位于细胞核部位,呈清晰棕色。各例中均可见到p16阳性肿瘤细胞,其中许多为体积较大、细胞核圆且大、核浆比例也较大的细胞,有些阳性染色很强呈深棕色,有些稍弱呈棕黄色。在不同的病例中,阳性细胞百分率差异较大,约在5%~95%之间。组织中绝大多数间质细胞呈阴性,经苏木素复染后细胞核为蓝色,其余呈弱阳性,即细胞核呈淡棕色(见插页第3页图3)。尸检正常垂体切片中,所有垂体前叶内分泌细胞和间质细胞都呈p16组化阴性。表明p16蛋白在肿瘤细胞中含量常常比正常细胞高。

    图3 垂体腺瘤P16免疫组化结果。阳性肿瘤细胞胞核呈清晰棕色,有些阳性染色很强呈棕色,有些稍弱呈棕黄色。组织中绝大多数间质细胞呈阴性,经苏木素复染后细胞核为蓝色,其余呈弱阳性,即细胞核呈淡棕色。LSAB法×400
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    阴性对照片未加一抗,经苏木素复染后,可见所有细胞的胞核均被染成蓝色。

    二、PCNA免疫组化

    棕色的阳性反应物位于细胞核部位。PCNA阳性肿瘤细胞百分率约在5%~95%之间。组织中绝大多数间质细胞为阴性,经苏木素复染后细胞核被染成蓝色,其余为弱阳性。(见插页第3页图4)

    阴性对照片未加一抗,经苏木素复染后,可见所有细胞的胞核均被染色成蓝色,尸检正常垂体切片中未见PCNA阳性细胞。

    图4 垂体腺瘤PCNA免疫组化结果的观察。阳性反应物沉积于细胞核部分,吴清晰棕色。组织中约大多数间质细胞为阴性,经苏木素复染后细胞核被染色蓝色,其余呈弱阳性。ABC×440

, 百拇医药     三、垂体腺瘤p16、PCNA的表达与临床病理特点的关系

    在瘤体直径≥2.0 cm、穿透蝶鞍、复发的病例中,p16、PCNA阳性百分率在Ⅲ~Ⅳ级的病例分别占73.7%、87.5%、100%和68.4%87.5%、100%,明显高于另一组(P<0.05)。p16、PCNA的改变与患者性别、年龄及组织学分型等无关(见附表)。

    附表 p16、PCNA组化阳性与临床病理特点 分类

    例数

    p16阳性百分率

    P值

    PCNA阳性百分率

    P值

    Ⅰ~Ⅱ
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    %

    Ⅲ~Ⅳ

    %

    Ⅰ~Ⅱ

    %

    Ⅲ~Ⅳ

    %

    性别

    男

    14

    6

    42.9

    8

    57.1
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    >0.05

    6

    42。9

    8

    57.1

    >0.05

    女

    17

    8

    47.1

    9

    52.9

    9

, 百拇医药     52。9

    8

    47.1

    年龄

    <45岁

    17

    7

    41.2

    10

    58.5

    >0.05

    8

    47。1

, 百拇医药     9

    52.9

    >0.05

    >45岁

    14

    7

    50.0

    7

    50.0

    7

    50。0

    7

    50.0

    增生
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    1

    1

    100

    0

    0

    1

    100

    0

    0

    嗜酸

    5

    4

    80.0

    1
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    20.0

    4

    80。0

    1

    20.0

    组织学分型

    嗜碱

    0

    0

    0

    0

    0

    >0.05

    0
, 百拇医药
    0

    0

    0

    >0.05

    嫌色

    24

    9

    37.5

    15

    62.5

    9

    37.5

    15

    62.5
, 百拇医药
    混合性

    1

    0

    0

    1

    100

    1

    100

    0

    0

    瘤体大小

    ≥2.0cm

    19

    5
, 百拇医药
    26.3

    14

    73.7

    <0.05

    6

    31.6

    13

    68.4

    <0.05

    <2.0cm

    12

    9

    75.0
, 百拇医药
    3

    25.0

    9

    75.0

    3

    25.0

    侵袭性

    穿透蝶鞍

    8

    1

    12.5

    7

    87.5

, 百拇医药     <0.05

    1

    12.5

    7

    87.5

    <0.05

    未穿透蝶鞍

    23

    13

    65.0

    10

    35.0

    14

, 百拇医药     60.9

    9

    39.1

    是否复发

    复发

    5

    0

    0

    5

    100

    <0.05

    0

    0

    5
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    100

    <0.05

    初发

    26

    14

    68.2

    12

    31.8

    15

    57.7

    11

    42.3

    四、p16与PCNA相关性的分析
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    用统计学上等极相关分析方法,对每例标本的p16阳性细胞百分率和相应的PCNA阳性细胞百分率,进行相关性分析,得校正Spearman等级相关系数rs’=0.852,P<0.01,表明p16与PCNA的表达呈高度正相关(见图1)。

    图1 示p16与PCNA阳性细胞百分率的相关曲线。

    从图中可见各点较均匀地分布于相关曲线的两侧,同时计算rs’=0.852,P<0.01,表明p16与PCNA的表达呈高度正相关。

    五、p16原位杂交

    31例石蜡包埋的切片中所有肿瘤细胞和间质细胞的胞浆部位均出现蓝色杂交信号(见插页第4页图1)。阴性对照片所有细胞均不着色。表明,垂体腺瘤细胞和间质细胞均有p16基因mRNA存在。
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    图1垂体腺瘤P16原位杂交结果的观察.可见所有肿瘤细胞和间质细胞的胞浆部位均出现蓝色杂交信号。×440

    讨论

    1994年Kamb等人发现在一系列肿瘤的细胞株中存在着p16基因的缺失,随后的几年中,在一些原发性恶性肿瘤如头颈部鳞癌等,也发现了p16的缺失和突变[1,2]。但人们同时发现原发肿瘤中p16缺失和突变的频率要大大低于细胞株。有学者认为在细胞株中p16阴性现象的大量存在可能是一种组织培养中的适应而造成的假象;也有学者认为在切下来的肿瘤组织中,非肿瘤成分中的p16基因始终存在,当采用分子生物学技术对匀浆标本进行基因缺失的检测时,非肿瘤细胞的污染可能会影响结果的准确性。所以,在保持细胞原有位置和结构的情况下,通过各种反应使细胞中化学成分在显微镜下可见、从而在原位分析这些化学物质的性质和含量的免疫组化和原位杂交技术,显示出其无可替代的优越性,重新得到了重视[3~4]
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    在用免疫组化研究肿瘤细胞p16蛋白表达情况的工作中,报道的p16蛋白阳性强度和阳性细胞比例各不相同,这中间显然可以有实验条件变异的影响。以同一标本中的非肿瘤细胞作为内参照来评判肿瘤细胞是否阳性和阳性程度,应该是反映细胞中靶蛋白相对含量的一个可靠方法。在同一实验条件下,部分细胞因靶蛋白含量较高而显色较快,呈反应阳性或强阳性,而那些反应阴性的细胞只能说明其靶蛋白含量相对较低(如果不是缺如的话)。在本实验p16免疫组化结果中,垂体腺瘤细胞一部分呈反应阳性,一部分阴性,而同一标本中的非肿瘤细胞的间质细胞则绝大多数为阴性,仅有少部分为阳性,且很弱。这一现象表明,组化阳性的肿瘤细胞其p16含量要比非肿瘤细胞的高。据此,本文把组化阳性的肿瘤细胞定为存在p16蛋白的过度表达。而各个病例p16阳性细胞百分率的高低,正是反映了该例肿瘤细胞p16基因过表达的程度。本实验原位杂交的结果显示间质细胞和肿瘤细胞中均存在p16的mRNA,表明p16基因在垂体腺瘤中没有缺失,那些组化阴性的细胞所含的p16蛋白含量较低。

    p16的过表达可能与细胞的增殖活性有关,主要鉴于:(1)免疫组化阳性细胞多为那些体积较大、细胞核较大、核浆比例较大的肿瘤细胞,反映了这些细胞可能具有较强的增殖活性,而绝大多数间质细胞和部分肿瘤细胞呈阴性反应;(2)p16与PCNA的表达呈高度正相关,PCNA是一个分子量为36 kD的核磷蛋白,为δ-DNA聚合酶的一个辅助蛋白,是DNA复制及细胞增殖所必需的,其表达水平是反映细胞增殖活性的较好指标;(3)p16组化阳性百分率与肿瘤大小、侵袭力、复发密切相关,相应不同组之间存在着明显的差异(P<0.05)。人们普遍了解到多种肿瘤的发生、发展中,p16改变主要为蛋白的失活,原因包括p16基因的缺失、突变和甲基化,且失活频率越是高的肿瘤其细胞恶性程度越高。但最近的研究表明,在部分良性和恶性肿瘤中均观察到p16蛋白表达增高的现象,且结合临床病理资料分析可见p16免疫组化阳性的病例临床表现较差,其高表达可能与不良预后有关[4,5]。有学者认为p16的过表达可能反映了过度增殖的肿瘤细胞中G1/S限制点的功能失常[6],也有认为可能是由于生长信号的异常刺激导致CDK4的大量表达,从而引起p16的反应性增高[7]。对于p16这一抑癌基因在恶变细胞中反而表达增多这一似乎矛盾的现象,其实在p16研究早期就发现了并引起讨论[8]。Tam等在对一系列恶性肿瘤细胞株的研究中发现,部分肿瘤的细胞株发生了缺失,部分肿瘤的细胞株中p16表达水平较之相应的正常细胞要明显增高。这一现象提示p16基因的缺失或是过表达与肿瘤细胞的类型有关,即在不同的肿瘤中p16的改变可能有所不同,即使在同种肿瘤的不同亚型,p16的改变也可能有所不同[9]
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    作者认为,p16基因在不同类型肿瘤可能发生不同形式的改变,即可以是基因缺失、突变、甲基化等造成的失活,也可以是基因的异常过度表达,而不管是失活还是过表达,都可能与细胞异常增殖和分化有关,从而与肿瘤发生、发展有关。在垂体腺瘤已有报道显示p16突变很少发生[10],本工作表明存在着p16基因的过度表达,垂体腺瘤p16表达强度和PCNA表达强度与临床较强的肿瘤增殖活性有关,因而可能有一定的提示预后意义。

    第一作者简介 于德蓉,女,硕士。

    参考文献

    1 Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994,264:436
, 百拇医药
    2 Reed AL, Califano J, Cairns P, et al. High frequent of p16 (CDKn2/MTS-1/zINK4a) inactivation in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res, 1996, 56:3630

    3 Ichiro K, Hirotoshi DA, Takayuki M, et al. Altered p16INK4 and retinoblastomaprotein status in non-small cell lung cancer: potential synergistic effect withaltered p53 protein on proliferative activity. Cancer Res, 1996, 56:5557

    4 Dong Y, Walsh MD, et al. Increased expression of cyclin-dependent kinase inhibitor 2 (CDKN2A) gene product p16INK4A in ovarian cancer is associated with progression and unfavourable prognosis. Int J Cancer (Pred Oncol), 1997, 74:57
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    5 Manfred Volm RK, Stamler G et al. Prognostic implications of cyclins (D1, E,A), cyclin-dependent kinase (CDK2,CDK4) and tumor-suppressor genes (pRb, p16INK4A) in childhood acute lymphoblastic leukemia. Int J Cancer, 1997, 74:508

    6 Shigemasa K. Hu C, West CM, et al. p16 overexpression: a potential early indicator of transformation in ovarian carcinoma. J Soc Gynecol Investig, 1997, 4(2):95

    7 Mcshea A, Harris PLR, Webster KR, et al. Abnormal expression of the cell cycle regulators p16 and CDK4 in Alzheimer's disease. Pathol, 1997, 150(6):1933
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    8 Serrano M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory motify in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature, 1993, 366(16):704.

    9 Tam SW, Shay JW, Pagano M. Differential expression and cell cycle regulation of the cyclin-depent kinase 4 inhibitor p16 Ink4. Cancer Res. 1994, 54:5816

    10 Yoshimoto K, Tanaka C, Yamada S, et al. Infrequent mutations of p16INK4A andp15INK4B genes in human pituitary adenomas. Eur J Endocrinol, 1997, 136(1):74

    (收稿:1998-08-17), http://www.100md.com


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