人脑胶质瘤细胞中IL-6mRNA的表达及意义
作者：李 刚 田志刚 张庆林 李新钢 刘 杰 孙 纳
单位：李 刚 张庆林 李新钢 济南市(250012)山东医科大学 附属医院神经外科；田志刚刘 杰 孙 纳济南市(250012)山东省医学科学院基础所
关键词：人脑胶质瘤细胞 IL-6 基因表达 RT-PCR
齐鲁肿瘤杂志980306
摘 要 目的 观察白细胞介素-6(IL-6)mRNA在人脑胶质瘤细胞中的表达。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对20例新鲜人脑胶质瘤标本进行了检测。结果 20例标本中有17例表达IL-6mRNA，恶性程度高的肿瘤中IL-6mRNA的表达量明显高于恶性程度低的肿瘤。结论 脑胶质瘤细胞中IL-6基因的表达与脑胶质瘤的发生发展有关。
The Expression and Importance of Interleukin-6 mRNA in Human Glioma Cells
, http://www.100md.com
Li Gang, Tian Zhigang, Zhang Qinglin, et al
(Affiliated Hospital of Shandong Medical University,Jinan 250012)
Abstract Objective In order to observe the expression of interleukin-6(IL-6)mRNA in human glioma cells.Methods We used the method of RT-PCR to detect 20 fresh human glioma specimens.Results The data showed that there were expression of IL-6mRNA in 17 human glioma specimens, and there was a relationship between the malignant degree of tumors and the expression of IL-6mRNA.Conclusions This result suggestsd thst the expression of IL-6mRNA in human glioma cells may play an important role in the occurring and developing of human glioma.
, 百拇医药
Key words Human glioma cells IL-6 Gene expression RT-PCR
脑胶质瘤是神经系统中发病率最高的肿瘤，但其病因目前尚不清楚。近年来国内外学者先后发现人脑胶质瘤细胞株的培养上清中有IL-6的持续分泌及表达，初步推测脑胶质瘤的发生发展与IL-6的异常分泌及表达有关。我们采用RT-PCR法对20例新鲜人脑胶质瘤标本中的IL-6基因进行了检测，现报告如下。
1 材料和方法
1.1本组共20例病人，均为我院神经外科的住院病人，术前均未接受过放疗、化疗及免疫治疗；其中男8例，女12例，年龄5～63岁，平均年龄42岁。病理分级：多形性胶质母细胞瘤6
例，间变性星形细胞瘤7例，室管膜瘤2例，星形细胞瘤Ⅱ级3例，星形细胞瘤Ⅰ级1例，少突胶质细胞瘤1例。
, 百拇医药
1.2 脑胶质瘤细胞的制备 检测所用标本均为手术所取的新鲜人脑胶质瘤组织，经剥离、去除血管及坏死组织后，Hanks液洗2次，将瘤组织剪碎至1mm3大小，加入0.25%胰酶37℃水浴摇床振荡消化25分钟，200目钢网过滤，离心洗涤后，用淋巴细胞分离液分离单个瘤细胞，再离心洗涤后备用。
1.3 瘤细胞总RNA的提取 采用异硫氰酸胍一步法提取[1]。
1.4 PCR引物IL-6及对照β-actin的引物序列见表1。
表1 RT-PCR检测IL-6基因的引物序列 细胞因子
序列
长度
合成单位
, 百拇医药
β-actin
5'GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3'
500bp
中科院上海植生所
5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTT3’
IL-6
5' CGAATTCATGATTGACAAACAAATTCGG3'
500bp
美国Verginia大学
5’CGCGGATCCTTACATTTGCCGAAGAG3’
, http://www.100md.com
高斌博士提供
1.5 逆转录反应 取5-10μg细胞总RNA，加入0.1MDTT2μ1，M-MLV1μ1(200u)，4×dNTP(10mM每种)1μ1，下游引物p2 0.5μ1(50pmol),总反应体积20μ1。37℃作用lh后，95℃10min灭活M-MLV.逆转录酶M-MLV,购自GIBCO公司。
1.6 PCR反应 在20μ1 RT反应产物中，加入15mM MgCl2 13.3μ1，4×dNTP 1μ1，上游引物p1 0.5μ1(50pmol),95℃5min,加入Taq DNA聚合酶2μ1(1u/μ1)，循环条件：94℃1min,58℃ lmin, 72℃1 min,循环35次，72℃延长 7min, 1.5%琼脂糖凝胶电泳观察结果。2 结果
在检测的20例标本中，有17例表达IL-6基因，其中6例为强表达，8例为一般表达，3例为弱表达，3例没有表达。(表2)。
, http://www.100md.com
表2 20例人脑胶质瘤标本IL-6基因表达 病理类型
例数
+++
++
+
-
多形性胶质母细胞瘤
6
3
3
间变性星形细胞瘤
7
2
, 百拇医药
4
1
室管膜瘤
2
1
1
星形细胞瘤Ⅰ级
3
1
1
1
星形细胞瘤Ⅱ级
1
1
, http://www.100md.com
少突胶质细胞瘤
1
1
注：+++为强表达 ++为一般弱表达 +为弱表达 -无表达3 讨论
IL-6是一种多功能细胞因子，对细胞的生长、分化以及某些特殊基因的表达具有调节及诱导作用，与多种疾病密切相关[2]。1987年Yasukawa等[3]首先发现人脑胶质瘤细胞株受LPS刺激后可以表达IL-6基因，细胞培养上清中IL-6含量亦明显增加；继而Van Meir 等[4]又发现人脑胶质瘤细胞在无任何刺激的情况下，在体内外均可自发分泌IL-6，并系统地观察了胶质瘤细胞释放IL-6的情况，结果表明，20个胶质瘤细胞株有19个可以持续分泌IL-6，最高分泌量可达14000u/ml，采用抗IL-6血清可中和上述培养上清中IL-6的活性。我国学者[5]测定了自己建株的人脑胶质瘤细胞株SHG-44分泌IL-6的能力，证明SHG-44细胞在无任何刺激的情况下，其培养上清中含有IL-6，活性可达56u/ml。
, 百拇医药
上述研究仅观察了人脑胶质瘤细胞株分泌和表达IL-6的情况，为了观察IL-6在活体人脑胶质瘤细胞中的表达，我们将手术所得的新鲜脑胶质瘤组织中的胶质瘤细胞分离出来，然后采用RT-PCR 法测定胶质瘤细胞中IL-6mRNA的表达，结果发现，20例胶质瘤标本中有17例表达IL-6mRNA(85%)，6例恶性程度最高的多形性胶质母细胞瘤中的3例为强表达，3例为一般表达；恶性程度仅次于多形性胶质母细胞瘤的7例间变性星形细胞瘤有2例为强表达，4例为一般表达；而恶性程度最低的1例Ⅰ 级星形细胞瘤和1例少突胶质细胞瘤没有IL-6基因的表达。研究结果表明，IL-6基因的表达量与脑胶质瘤的恶性程度有关，恶性程度高的肿瘤中IL-6mRNA 的表达量明显高于恶性程度低的肿瘤，提示IL-6在人脑胶质瘤细胞中的表达可能与脑胶质瘤的发生及发展有关。
参考文献
[1] Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid quanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156.
, http://www.100md.com
[2] Kishimoto.The biology of interleukin-6.Blood,1989,74:1.
[3] Yasukawa K.Structure and expression of human BSF2/IL-6 gene.EMBO J,1987,6:2939.
[4] Meir EV,Sawamura Y,Diserens AC,et al.Human glioblastoma cells release interleukin-6 in vivo and in vitro.Cancer Res,1990,50:6683.
[5] 戴燕芳，张学光，顾宗江，等.人脑胶质瘤细胞SHG-44分泌IL-6的测定. 中国实验临床免疫学杂志，1993，5：8., 百拇医药
单位：李 刚 张庆林 李新钢 济南市(250012)山东医科大学 附属医院神经外科；田志刚刘 杰 孙 纳济南市(250012)山东省医学科学院基础所
关键词：人脑胶质瘤细胞 IL-6 基因表达 RT-PCR
齐鲁肿瘤杂志980306
摘 要 目的 观察白细胞介素-6(IL-6)mRNA在人脑胶质瘤细胞中的表达。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对20例新鲜人脑胶质瘤标本进行了检测。结果 20例标本中有17例表达IL-6mRNA，恶性程度高的肿瘤中IL-6mRNA的表达量明显高于恶性程度低的肿瘤。结论 脑胶质瘤细胞中IL-6基因的表达与脑胶质瘤的发生发展有关。
The Expression and Importance of Interleukin-6 mRNA in Human Glioma Cells
, http://www.100md.com
Li Gang, Tian Zhigang, Zhang Qinglin, et al
(Affiliated Hospital of Shandong Medical University,Jinan 250012)
Abstract Objective In order to observe the expression of interleukin-6(IL-6)mRNA in human glioma cells.Methods We used the method of RT-PCR to detect 20 fresh human glioma specimens.Results The data showed that there were expression of IL-6mRNA in 17 human glioma specimens, and there was a relationship between the malignant degree of tumors and the expression of IL-6mRNA.Conclusions This result suggestsd thst the expression of IL-6mRNA in human glioma cells may play an important role in the occurring and developing of human glioma.
, 百拇医药
Key words Human glioma cells IL-6 Gene expression RT-PCR
脑胶质瘤是神经系统中发病率最高的肿瘤，但其病因目前尚不清楚。近年来国内外学者先后发现人脑胶质瘤细胞株的培养上清中有IL-6的持续分泌及表达，初步推测脑胶质瘤的发生发展与IL-6的异常分泌及表达有关。我们采用RT-PCR法对20例新鲜人脑胶质瘤标本中的IL-6基因进行了检测，现报告如下。
1 材料和方法
1.1本组共20例病人，均为我院神经外科的住院病人，术前均未接受过放疗、化疗及免疫治疗；其中男8例，女12例，年龄5～63岁，平均年龄42岁。病理分级：多形性胶质母细胞瘤6
例，间变性星形细胞瘤7例，室管膜瘤2例，星形细胞瘤Ⅱ级3例，星形细胞瘤Ⅰ级1例，少突胶质细胞瘤1例。
, 百拇医药
1.2 脑胶质瘤细胞的制备 检测所用标本均为手术所取的新鲜人脑胶质瘤组织，经剥离、去除血管及坏死组织后，Hanks液洗2次，将瘤组织剪碎至1mm3大小，加入0.25%胰酶37℃水浴摇床振荡消化25分钟，200目钢网过滤，离心洗涤后，用淋巴细胞分离液分离单个瘤细胞，再离心洗涤后备用。
1.3 瘤细胞总RNA的提取 采用异硫氰酸胍一步法提取[1]。
1.4 PCR引物IL-6及对照β-actin的引物序列见表1。
表1 RT-PCR检测IL-6基因的引物序列 细胞因子
序列
长度
合成单位
, 百拇医药
β-actin
5'GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3'
500bp
中科院上海植生所
5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTT3’
IL-6
5' CGAATTCATGATTGACAAACAAATTCGG3'
500bp
美国Verginia大学
5’CGCGGATCCTTACATTTGCCGAAGAG3’
, http://www.100md.com
高斌博士提供
1.5 逆转录反应 取5-10μg细胞总RNA，加入0.1MDTT2μ1，M-MLV1μ1(200u)，4×dNTP(10mM每种)1μ1，下游引物p2 0.5μ1(50pmol),总反应体积20μ1。37℃作用lh后，95℃10min灭活M-MLV.逆转录酶M-MLV,购自GIBCO公司。
1.6 PCR反应 在20μ1 RT反应产物中，加入15mM MgCl2 13.3μ1，4×dNTP 1μ1，上游引物p1 0.5μ1(50pmol),95℃5min,加入Taq DNA聚合酶2μ1(1u/μ1)，循环条件：94℃1min,58℃ lmin, 72℃1 min,循环35次，72℃延长 7min, 1.5%琼脂糖凝胶电泳观察结果。2 结果
在检测的20例标本中，有17例表达IL-6基因，其中6例为强表达，8例为一般表达，3例为弱表达，3例没有表达。(表2)。
, http://www.100md.com
表2 20例人脑胶质瘤标本IL-6基因表达 病理类型
例数
+++
++
+
-
多形性胶质母细胞瘤
6
3
3
间变性星形细胞瘤
7
2
, 百拇医药
4
1
室管膜瘤
2
1
1
星形细胞瘤Ⅰ级
3
1
1
1
星形细胞瘤Ⅱ级
1
1
, http://www.100md.com
少突胶质细胞瘤
1
1
注：+++为强表达 ++为一般弱表达 +为弱表达 -无表达3 讨论
IL-6是一种多功能细胞因子，对细胞的生长、分化以及某些特殊基因的表达具有调节及诱导作用，与多种疾病密切相关[2]。1987年Yasukawa等[3]首先发现人脑胶质瘤细胞株受LPS刺激后可以表达IL-6基因，细胞培养上清中IL-6含量亦明显增加；继而Van Meir 等[4]又发现人脑胶质瘤细胞在无任何刺激的情况下，在体内外均可自发分泌IL-6，并系统地观察了胶质瘤细胞释放IL-6的情况，结果表明，20个胶质瘤细胞株有19个可以持续分泌IL-6，最高分泌量可达14000u/ml，采用抗IL-6血清可中和上述培养上清中IL-6的活性。我国学者[5]测定了自己建株的人脑胶质瘤细胞株SHG-44分泌IL-6的能力，证明SHG-44细胞在无任何刺激的情况下，其培养上清中含有IL-6，活性可达56u/ml。
, 百拇医药
上述研究仅观察了人脑胶质瘤细胞株分泌和表达IL-6的情况，为了观察IL-6在活体人脑胶质瘤细胞中的表达，我们将手术所得的新鲜脑胶质瘤组织中的胶质瘤细胞分离出来，然后采用RT-PCR 法测定胶质瘤细胞中IL-6mRNA的表达，结果发现，20例胶质瘤标本中有17例表达IL-6mRNA(85%)，6例恶性程度最高的多形性胶质母细胞瘤中的3例为强表达，3例为一般表达；恶性程度仅次于多形性胶质母细胞瘤的7例间变性星形细胞瘤有2例为强表达，4例为一般表达；而恶性程度最低的1例Ⅰ 级星形细胞瘤和1例少突胶质细胞瘤没有IL-6基因的表达。研究结果表明，IL-6基因的表达量与脑胶质瘤的恶性程度有关，恶性程度高的肿瘤中IL-6mRNA 的表达量明显高于恶性程度低的肿瘤，提示IL-6在人脑胶质瘤细胞中的表达可能与脑胶质瘤的发生及发展有关。
参考文献
[1] Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid quanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156.
, http://www.100md.com
[2] Kishimoto.The biology of interleukin-6.Blood,1989,74:1.
[3] Yasukawa K.Structure and expression of human BSF2/IL-6 gene.EMBO J,1987,6:2939.
[4] Meir EV,Sawamura Y,Diserens AC,et al.Human glioblastoma cells release interleukin-6 in vivo and in vitro.Cancer Res,1990,50:6683.
[5] 戴燕芳，张学光，顾宗江，等.人脑胶质瘤细胞SHG-44分泌IL-6的测定. 中国实验临床免疫学杂志，1993，5：8., 百拇医药