非小细胞肺癌细胞MRP基因表达及意义
作者：单根法 钟竑 张辅贤
单位：单根法 钟竑 张辅贤(200092 上海第二医科大学附属新华医院心胸外科)
关键词：肺肿瘤；耐药性；MRP基因；预后
中国肺癌杂志000306 【摘要】 目的 研究多药耐药性相关蛋白基因——MRP基因(multi-drug resistance associated protein gene, MRP gene)对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者预后的影响。方法 应用地高辛标记探针原位分子杂交结合免疫组化技术检测47例NSCLC患者根治术后石蜡组织标本中癌细胞MRP基因mRNA表达，并对患者进行回顾性随访。结果 47例NSCLC组织标本中癌细胞均有不同程度MRP基因mRNA过度表达，其表达水平与患者术后生存期、复发及转移有密切关系，与临床病理特征无明显关系。结论 MRP基因与NSCLC患者预后有密切关系，检测MRP基因mRNA表达水平可作为预测NSCLC患者预后、确定化疗方案的手段之一。
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Expression of MRP gene in non-small cell lung cancer and its significance
SHAN Genfa, ZHONG Hong, ZHANG Fuxian.Department of Thoracic Surgery, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092, P.R.China
【Abstract】 Objective To investigate the effects of multi-drug resistance associated protein gene (MRP gene) overexpression on the prognosis of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods Paraffin-embedded cancer tissues from 47 cases of NSCLC who had undergone radical resection were determined for expression of MRP gene mRNA by in situ hybridization combined with immunohistochemistry and all the patients had been followed up. Results All of 47 lung cancer specimen were found to have overexpression of MRP gene mRNA and the overexpression was closely related to survival time and recurrence or metastasis after surgery, but not to the clinical pathological factors. Conclusion MRP gene is related with the prognosis of lung cancer patients and may be regarded as indicator to predict the prognosis and to choose suitable chemotherapy for non-small cell lung cancer patients.
, 百拇医药
【Key words】 Lung neoplasms Multi-drug resistance MRP gene Prognosis
This study was supported by a grant from Shanghai Natural Scientific Funds (to Shan Genfa)(96ZB14043).
肿瘤耐药性形成机制及逆转已成为肿瘤分子生物学研究热点[1]。我们应用地高辛标记探针原位分子杂交结合免疫组化技术检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者石蜡组织标本中癌细胞多药耐药性相关蛋白(multi-drug resistance associated protein, MRP)基因mRNA表达水平，并回顾性随访，研究MRP基因表达与NSCLC患者临床病理特征、术后生存期、复发及转移的相关性，评价MRP基因作为临床预测NSCLC患者预后、确定化疗方案的价值。
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1 材料与方法
1.1 临床资料 收集47例病史完整且经病理学证实的NSCLC患者根治术后的石蜡包埋组织标本；其中男性35例，女性12例；年龄<55岁者13例，55～65岁者20例，>65岁者14例；鳞癌24例，腺癌23例；Ⅰ期27例，Ⅱ期5例，ⅢA期9例，ⅢB期6例(TNM分期)；高分化11例，中分化21例，低分化15例。患者术后均接受常规化疗。
1.2 方法
1.2.1 探针制备 检测MRP基因mRNA表达的反义寡核苷酸探针依据Thomas等[2]所报道的序列，由中国科学院上海生物工程中心合成，序列长度为30个核苷酸；探针A为CAAGCTGGCGCTGCCCGACACTGAGGT-TCT标记3′末端，探针B为CAGACAGGTTCACGCCC-TTCTCGCCAATCT标记5′末端。
, 百拇医药 1.2.2 探针标记 按Boehringer Mannheim公司所提供试剂盒及方法应用地高辛抗体标记探针。
1.2.3 组织切片 应用病理学常规方法制作石蜡切片，采取肺癌组织及癌周正常组织进行检测。
1.2.4 检测方法 地高辛标记探针原位分子杂交及免疫组织化学方法按参考文献2进行，病理学方法HE复染。
1.2.5 结果判定 光学显微镜下可观察到MRP基因阳性细胞内有浅蓝色颗粒。计数肺癌细胞，得出阳性百分率。计算机辅助扫描，得出阳性颗粒占细胞面积的百分比(%)。以阳性颗粒占细胞面积的百分比(%)反映MRP基因mRNA表达水平。应用计算机SAS系统进行统计学分析，P<0.05表明有统计学差异。
2 结果
2.1 MRP基因mRNA表达水平与NSCLC患者临床病理特征的关系 肺癌组织及癌周正常肺组织均见MRP基因mRNA表达，图1示肺癌细胞MRP基因mRNA表达阳性。统计学分析显示肺癌细胞MRP基因mRNA表达水平明显高于癌周正常肺组织(P<0.01)，表明肺癌细胞均有不同程度MRP基因mRNA过度表达；但其过度表达与肺癌患者病理类型、肿瘤大小、淋巴结转移、病理分期、分化程度、年龄、性别等临床病理特征无明显相关性(P>0.05)。
, 百拇医药
图1 肺癌细胞MRP基因mRNA阳性表达(×100)
Fig 1 Positive stained cells of MRP gene mRNA in lung cancer cells(×100)
2.2 MRP基因mRNA表达水平与NSCLC患者术后生存期的关系 表1显示肺癌细胞MRP基因mRNA过度表达与NSCLC患者术后生存期有明显相关性，与生存期在3年以上者比较，生存期在3年以内者的MRP基因mRNA显著增高(P<0.05)，这提示MRP基因mRNA表达水平越高，患者生存期越短。统计结果还显示5′末端检测效果高于3′末端检测(P<0.05或P<0.01)。
表1 MRP基因mRNA表达与NSCLC患者生存期的相关性
Tab 1 Relationship between MRP gene
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mRNA expression and survival time of NSCLC patients of lung cancer Survival time
No. of cases
Probes
Positive percentage
(x±s)%
<1 year
11
3′-terminal
2.54±0.24
5′-terminal
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3.03±0.26
<2 years
14
3′-terminal
2.07±0.12
5′-terminal
2.80±0.27▲
<3 years
9
3′-terminal
1.83±0.14
5′-terminal
, http://www.100md.com
1.99±0.10
>3 years
13
3′-terminal
1.54±0.18△
5′-terminal
1.66±0.19△
：MRP基因mRNA表达水平以阳性颗粒占细胞面积的百分比表示；△：与其它组相应参数比较，P<0.05；▲：与同组3′末端比较，P<0.01。
：The level of MRP gene expression was illustrated by the percentage ratio of positive grain to cellular area；△：Compared with the same parameter of the other groups，P<0.05；▲：Compared with 3′-terminal between the same group，P<0.01.
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2.3 MRP基因mRNA表达与NSCLC患者术后1年内复发或转移的关系 统计结果显示，术后1年内复发或转移患者的肺癌细胞MRP基因mRNA表达明显高于3年内未见复发或转移患者(P<0.01)(表2)。
表2 MRP基因mRNA表达与NSCLC患者术后
复发或转移的关系
Tab 2 Relationship between the MRP gene mRNA
expression and recurrence or metastasis of lung cancer Group
n
Probes
Positive percentage
, http://www.100md.com
(
±s)%
Recurrence or
12
3′-terminal
2.36±0.33
metastasis in 1 year
5′-terminal
3.05±0.45
No recurrence or
11
, 百拇医药
3′-terminal
1.55±0.23
metastasis in 3 year
5′-terminal
1.90±0.41
：与3年内未见复发或转移比较，P<0.01。
：Compared with no recurrence or metastasis in 3 years group，P<0.01.
3 讨论
MRP基因是Cole等[3]在对经抗癌药物诱导产生耐药性的肺癌细胞株中研究发现的，它位于人类染色体16p13.1上，编码表达ATP能量依赖性跨膜糖蛋白泵分子——Pgp-190，该蛋白可将疏水性化疗药物逆浓度差泵出细胞外，减少细胞内药物蓄积，从而导致细胞产生耐药性。Sorensen等[4]应用免疫组化技术发现原发性肺癌患者手术标本中的肺癌细胞同样有不同程度的MRP基因表达，该基因可在化疗药物的诱导下激活、扩增从而产生耐药性。我们所检测的47例NSCLC患者手术标本亦显示肺癌细胞中有不同程度的MRP基因mRNA表达，其表达水平与患者临床病理特征无直接的关联，这一结果与白氏[5]所报道肺癌mdr1基因表达与肺癌多药耐药性研究相似。Berger等[6]曾应用RT-PCR方法对15株未经抗癌药物刺激培养的肺癌细胞株及正常肺组织细胞进行肺癌细胞耐药性研究，发现未经抗癌药物刺激培养的肺癌细胞中也有不同程度的MRP基因表达，其中2株肺癌细胞的MRP基因表达水平甚至高于经抗癌药物刺激培养产生耐药性的肺癌细胞株；该研究同时显示，MRP基因在抗癌前体药物的转运中起着关键性的作用。我们的研究合成2条不同的寡核苷酸链分别检测肺癌细胞MRP基因mRNA 3′、5′末端，结果显示，5′末端检测效果优于3′末端。
, 百拇医药
近年来在其他实体瘤的研究中表明，MRP基因表达不仅影响肿瘤患者的化疗疗效，更可影响患者生存期。Murray等[7]的研究即显示神经母细胞瘤患者的MRP基因表达与化疗疗效、患者生存期具有显著相关性。我们的研究结果显示，NSCLC患者MRP基因mRNA过度表达同样影响患者术后生存期和术后复发及转移。而我们先期进行的肺癌细胞耐药性逆转研究显示维拉帕米、三氟拉嗪可部分逆转耐药性肺癌细胞株A549、SPC-A1对抗癌药物的耐受性[8，9]。
我们在研究中采用了地高辛标记探针原位分子杂交结合免疫组化技术检测石蜡肺癌组织标本。该方法经HE染色可在直视条件下从成分复杂的肺组织切片中对肺癌细胞MRP基因mRNA表达进行直观分析，同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保存组织与细胞的形态，因而具有确切的可靠性及科学性。本项研究的结果表明，应用地高辛标记探针原位分子杂交结合免疫组化技术方法适合于临床实际。综上，我们认为，检测NSCLC癌组织MRP基因mRNA表达水平可作为预测NSCLC患者预后、确定化疗方案的手段之一。
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本研究受上海市自然科学基金(96ZB14043)资助
参考文献
1，钟竑.肺癌细胞耐药机制研究进展.国外医学呼吸系统分册，1996，16(增刊)∶27-30.
2，Thomas GA, Barrand MA, Stewart S, et al. Expression of the multidrug resistance-associated protein (MRP) gene in human lung tumors and normal tissue as determined by in situ hybridization. Eur J Cancer, 1994，30A(11)∶1705-1709.
3，Cole SPC, Bhardwaj G, Gerlach JH, et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug resistance human lung cancer cell line. Science, 1992，258(5088)∶1650-1654.
, 百拇医药
4，Sorensen KM, Jensen PB, Nielsen BS, et al. Immunohistochemical detection of DNA topoisomerase ⅡA, P-glycoprotein and multidrug resistance protein (MRP) in small-cell and non-small-cell lung cancer. Brit J Cancer, 1998,77(9)∶1469-1473.
5，白莉，孙燕，李申德.mdr1基因的表达和肺癌多药耐药的关系.中华结核和呼吸杂志，1997，20(1)∶30-32.
6，Berger W, Elbling L, Hauptmann E, et al. Expession of the multidrug resistance-associated protein (MRP) and chemoresistance of the huamn non-small-cell lung cancer cells. Int J Cancer,1997,73(1)∶84-93.
, 百拇医药
7，Murray DN, Boraow SB, Marshall GM, et al. Expression of the gene for multidrug-resistance-associated protein and outcome in patients with neuroblastoma. N Engl J Med,1996, 334(4)∶231-238.
8，单根法，钟竑，朱恩良，等.三氟拉嗪逆转肺癌细胞多药耐药性研究.中国癌症杂志,1996,6(6)∶273-275.
9，单根法，钟竑，朱恩良，等.维拉帕米逆转肺癌细胞耐药性研究.上海第二医科大学学报，1997，17(2)∶88-90.
(收稿：1999-10-26 修回：2000-02-18), 百拇医药
单位：单根法 钟竑 张辅贤(200092 上海第二医科大学附属新华医院心胸外科)
关键词：肺肿瘤；耐药性；MRP基因；预后
中国肺癌杂志000306 【摘要】 目的 研究多药耐药性相关蛋白基因——MRP基因(multi-drug resistance associated protein gene, MRP gene)对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者预后的影响。方法 应用地高辛标记探针原位分子杂交结合免疫组化技术检测47例NSCLC患者根治术后石蜡组织标本中癌细胞MRP基因mRNA表达，并对患者进行回顾性随访。结果 47例NSCLC组织标本中癌细胞均有不同程度MRP基因mRNA过度表达，其表达水平与患者术后生存期、复发及转移有密切关系，与临床病理特征无明显关系。结论 MRP基因与NSCLC患者预后有密切关系，检测MRP基因mRNA表达水平可作为预测NSCLC患者预后、确定化疗方案的手段之一。
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Expression of MRP gene in non-small cell lung cancer and its significance
SHAN Genfa, ZHONG Hong, ZHANG Fuxian.Department of Thoracic Surgery, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092, P.R.China
【Abstract】 Objective To investigate the effects of multi-drug resistance associated protein gene (MRP gene) overexpression on the prognosis of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods Paraffin-embedded cancer tissues from 47 cases of NSCLC who had undergone radical resection were determined for expression of MRP gene mRNA by in situ hybridization combined with immunohistochemistry and all the patients had been followed up. Results All of 47 lung cancer specimen were found to have overexpression of MRP gene mRNA and the overexpression was closely related to survival time and recurrence or metastasis after surgery, but not to the clinical pathological factors. Conclusion MRP gene is related with the prognosis of lung cancer patients and may be regarded as indicator to predict the prognosis and to choose suitable chemotherapy for non-small cell lung cancer patients.
, 百拇医药
【Key words】 Lung neoplasms Multi-drug resistance MRP gene Prognosis
This study was supported by a grant from Shanghai Natural Scientific Funds (to Shan Genfa)(96ZB14043).
肿瘤耐药性形成机制及逆转已成为肿瘤分子生物学研究热点[1]。我们应用地高辛标记探针原位分子杂交结合免疫组化技术检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者石蜡组织标本中癌细胞多药耐药性相关蛋白(multi-drug resistance associated protein, MRP)基因mRNA表达水平，并回顾性随访，研究MRP基因表达与NSCLC患者临床病理特征、术后生存期、复发及转移的相关性，评价MRP基因作为临床预测NSCLC患者预后、确定化疗方案的价值。
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1 材料与方法
1.1 临床资料 收集47例病史完整且经病理学证实的NSCLC患者根治术后的石蜡包埋组织标本；其中男性35例，女性12例；年龄<55岁者13例，55～65岁者20例，>65岁者14例；鳞癌24例，腺癌23例；Ⅰ期27例，Ⅱ期5例，ⅢA期9例，ⅢB期6例(TNM分期)；高分化11例，中分化21例，低分化15例。患者术后均接受常规化疗。
1.2 方法
1.2.1 探针制备 检测MRP基因mRNA表达的反义寡核苷酸探针依据Thomas等[2]所报道的序列，由中国科学院上海生物工程中心合成，序列长度为30个核苷酸；探针A为CAAGCTGGCGCTGCCCGACACTGAGGT-TCT标记3′末端，探针B为CAGACAGGTTCACGCCC-TTCTCGCCAATCT标记5′末端。
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1.2.3 组织切片 应用病理学常规方法制作石蜡切片，采取肺癌组织及癌周正常组织进行检测。
1.2.4 检测方法 地高辛标记探针原位分子杂交及免疫组织化学方法按参考文献2进行，病理学方法HE复染。
1.2.5 结果判定 光学显微镜下可观察到MRP基因阳性细胞内有浅蓝色颗粒。计数肺癌细胞，得出阳性百分率。计算机辅助扫描，得出阳性颗粒占细胞面积的百分比(%)。以阳性颗粒占细胞面积的百分比(%)反映MRP基因mRNA表达水平。应用计算机SAS系统进行统计学分析，P<0.05表明有统计学差异。
2 结果
2.1 MRP基因mRNA表达水平与NSCLC患者临床病理特征的关系 肺癌组织及癌周正常肺组织均见MRP基因mRNA表达，图1示肺癌细胞MRP基因mRNA表达阳性。统计学分析显示肺癌细胞MRP基因mRNA表达水平明显高于癌周正常肺组织(P<0.01)，表明肺癌细胞均有不同程度MRP基因mRNA过度表达；但其过度表达与肺癌患者病理类型、肿瘤大小、淋巴结转移、病理分期、分化程度、年龄、性别等临床病理特征无明显相关性(P>0.05)。
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图1 肺癌细胞MRP基因mRNA阳性表达(×100)
Fig 1 Positive stained cells of MRP gene mRNA in lung cancer cells(×100)
2.2 MRP基因mRNA表达水平与NSCLC患者术后生存期的关系 表1显示肺癌细胞MRP基因mRNA过度表达与NSCLC患者术后生存期有明显相关性，与生存期在3年以上者比较，生存期在3年以内者的MRP基因mRNA显著增高(P<0.05)，这提示MRP基因mRNA表达水平越高，患者生存期越短。统计结果还显示5′末端检测效果高于3′末端检测(P<0.05或P<0.01)。
表1 MRP基因mRNA表达与NSCLC患者生存期的相关性
Tab 1 Relationship between MRP gene
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mRNA expression and survival time of NSCLC patients of lung cancer Survival time
No. of cases
Probes
Positive percentage
(x±s)%
<1 year
11
3′-terminal
2.54±0.24
5′-terminal
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3.03±0.26
<2 years
14
3′-terminal
2.07±0.12
5′-terminal
2.80±0.27▲
<3 years
9
3′-terminal
1.83±0.14
5′-terminal
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1.99±0.10
>3 years
13
3′-terminal
1.54±0.18△
5′-terminal
1.66±0.19△
：MRP基因mRNA表达水平以阳性颗粒占细胞面积的百分比表示；△：与其它组相应参数比较，P<0.05；▲：与同组3′末端比较，P<0.01。
：The level of MRP gene expression was illustrated by the percentage ratio of positive grain to cellular area；△：Compared with the same parameter of the other groups，P<0.05；▲：Compared with 3′-terminal between the same group，P<0.01.
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2.3 MRP基因mRNA表达与NSCLC患者术后1年内复发或转移的关系 统计结果显示，术后1年内复发或转移患者的肺癌细胞MRP基因mRNA表达明显高于3年内未见复发或转移患者(P<0.01)(表2)。
表2 MRP基因mRNA表达与NSCLC患者术后
复发或转移的关系
Tab 2 Relationship between the MRP gene mRNA
expression and recurrence or metastasis of lung cancer Group
n
Probes
Positive percentage
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(
±s)%Recurrence or
12
3′-terminal
2.36±0.33
metastasis in 1 year
5′-terminal
3.05±0.45
No recurrence or
11
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3′-terminal
1.55±0.23
metastasis in 3 year
5′-terminal
1.90±0.41
：与3年内未见复发或转移比较，P<0.01。
：Compared with no recurrence or metastasis in 3 years group，P<0.01.
3 讨论
MRP基因是Cole等[3]在对经抗癌药物诱导产生耐药性的肺癌细胞株中研究发现的，它位于人类染色体16p13.1上，编码表达ATP能量依赖性跨膜糖蛋白泵分子——Pgp-190，该蛋白可将疏水性化疗药物逆浓度差泵出细胞外，减少细胞内药物蓄积，从而导致细胞产生耐药性。Sorensen等[4]应用免疫组化技术发现原发性肺癌患者手术标本中的肺癌细胞同样有不同程度的MRP基因表达，该基因可在化疗药物的诱导下激活、扩增从而产生耐药性。我们所检测的47例NSCLC患者手术标本亦显示肺癌细胞中有不同程度的MRP基因mRNA表达，其表达水平与患者临床病理特征无直接的关联，这一结果与白氏[5]所报道肺癌mdr1基因表达与肺癌多药耐药性研究相似。Berger等[6]曾应用RT-PCR方法对15株未经抗癌药物刺激培养的肺癌细胞株及正常肺组织细胞进行肺癌细胞耐药性研究，发现未经抗癌药物刺激培养的肺癌细胞中也有不同程度的MRP基因表达，其中2株肺癌细胞的MRP基因表达水平甚至高于经抗癌药物刺激培养产生耐药性的肺癌细胞株；该研究同时显示，MRP基因在抗癌前体药物的转运中起着关键性的作用。我们的研究合成2条不同的寡核苷酸链分别检测肺癌细胞MRP基因mRNA 3′、5′末端，结果显示，5′末端检测效果优于3′末端。
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近年来在其他实体瘤的研究中表明，MRP基因表达不仅影响肿瘤患者的化疗疗效，更可影响患者生存期。Murray等[7]的研究即显示神经母细胞瘤患者的MRP基因表达与化疗疗效、患者生存期具有显著相关性。我们的研究结果显示，NSCLC患者MRP基因mRNA过度表达同样影响患者术后生存期和术后复发及转移。而我们先期进行的肺癌细胞耐药性逆转研究显示维拉帕米、三氟拉嗪可部分逆转耐药性肺癌细胞株A549、SPC-A1对抗癌药物的耐受性[8，9]。
我们在研究中采用了地高辛标记探针原位分子杂交结合免疫组化技术检测石蜡肺癌组织标本。该方法经HE染色可在直视条件下从成分复杂的肺组织切片中对肺癌细胞MRP基因mRNA表达进行直观分析，同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保存组织与细胞的形态，因而具有确切的可靠性及科学性。本项研究的结果表明，应用地高辛标记探针原位分子杂交结合免疫组化技术方法适合于临床实际。综上，我们认为，检测NSCLC癌组织MRP基因mRNA表达水平可作为预测NSCLC患者预后、确定化疗方案的手段之一。
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本研究受上海市自然科学基金(96ZB14043)资助
参考文献
1，钟竑.肺癌细胞耐药机制研究进展.国外医学呼吸系统分册，1996，16(增刊)∶27-30.
2，Thomas GA, Barrand MA, Stewart S, et al. Expression of the multidrug resistance-associated protein (MRP) gene in human lung tumors and normal tissue as determined by in situ hybridization. Eur J Cancer, 1994，30A(11)∶1705-1709.
3，Cole SPC, Bhardwaj G, Gerlach JH, et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug resistance human lung cancer cell line. Science, 1992，258(5088)∶1650-1654.
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4，Sorensen KM, Jensen PB, Nielsen BS, et al. Immunohistochemical detection of DNA topoisomerase ⅡA, P-glycoprotein and multidrug resistance protein (MRP) in small-cell and non-small-cell lung cancer. Brit J Cancer, 1998,77(9)∶1469-1473.
5，白莉，孙燕，李申德.mdr1基因的表达和肺癌多药耐药的关系.中华结核和呼吸杂志，1997，20(1)∶30-32.
6，Berger W, Elbling L, Hauptmann E, et al. Expession of the multidrug resistance-associated protein (MRP) and chemoresistance of the huamn non-small-cell lung cancer cells. Int J Cancer,1997,73(1)∶84-93.
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7，Murray DN, Boraow SB, Marshall GM, et al. Expression of the gene for multidrug-resistance-associated protein and outcome in patients with neuroblastoma. N Engl J Med,1996, 334(4)∶231-238.
8，单根法，钟竑，朱恩良，等.三氟拉嗪逆转肺癌细胞多药耐药性研究.中国癌症杂志,1996,6(6)∶273-275.
9，单根法，钟竑，朱恩良，等.维拉帕米逆转肺癌细胞耐药性研究.上海第二医科大学学报，1997，17(2)∶88-90.
(收稿：1999-10-26 修回：2000-02-18), 百拇医药